用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤学生物检测领域，尤其涉及用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用。
背景技术：
：结直肠癌(crc)是当今最常见的疾病之一，每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。结直肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加，比如发达国家的结直肠癌发病中位年龄为70岁。我国结直肠癌发病率及死亡率呈总体增高趋势，结直肠癌在10年间的发病率表现为明显升高趋势，而在死亡率方面，男性患者同样表现为逐年上升趋势，而女性患者则相对趋于平稳。2015年我国约有281.4万人死于癌症，结直肠癌在男性和女性中死亡率为第五位。i期大肠癌的5年生存率超过90％，二期的80％左右，三期的也有60％左右，但如果到了第iv期，5年生存率只有10％。而大肠癌的复发几率与确诊时的分期具相关性，一般，越是早期发现的大肠癌，治疗后复发率就会越低。在生存期方面，i期患者的5年生存率可达90％以上，而iv期患者只有略大于10％的5年生存率。肿瘤复发和转移是结直肠癌患者的主要死亡原因，目前临床暂无明显有效的治疗措施，预防结直肠癌治疗后的复发或转移，治疗后规范的辅助化疗和放疗可以减少大肠癌的复发转移或延长复发转移的时间，但并不能完全避免肿瘤的复发甚至转移，因此一般临床医生会建议病人定期检查。同时结直肠癌crc有着较高的复发率，实施根治术后，有50％的复发可能，结直肠癌治疗后两年内复发率最高，因此临床大夫建议患者每3-6个月复查一次，两年后改为半年一次一直持续到第3年。目前结直肠癌发生或复发检测的方法及其相关特点包括如下所述：(1)便隐血试验(fecaloccultbloodtest，fobt)：具有方便、无创、患者接受度高等优点，但其检验结果的假阳性率及假阴性率均较高，易造成漏检或错检；(2)全结肠镜/乙状结肠镜检查：是目前诊断/复发检测的金标准检查方法，其检验结果的敏感性和特异性均较高，但部分患者检查过程需要麻醉或镇静，且检查中可能出现出血、穿孔等并发症(0.1％)，这些检查过程的不适以及检查的禁忌症使得很多患者对接受结肠镜检查心有疑虑，并且作为大规模结直肠癌早期筛查方法来讲，耗费的社会医疗资源将过于巨大；(3)cea、ca99等血清常规肿瘤标志物：现今被广泛使用与肿瘤辅助诊断、复发监控，检测灵敏度较低；(4)pet-ct检查:对于病情复杂、常规检查无法明确诊断的患者可作为有效的辅助检查。术前检查提示为ⅲ期以上肿瘤，为了解有无远处转移使用；(5)经直肠腔内超声检查、b型超声、ct、mri：为常规检测，具有方便快捷的优越性；明确病变侵犯肠壁的深度，向壁外蔓延的范围和远处转移的部位。现有研究发现癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤dna(circulatingtumordna，ctdna)。游离循环肿瘤dna是一种胞外dna，主要存在于血液(血清或血浆)、滑膜液和脑脊液等体液中。ctdna释放入血的机制目前仍无定论，现在普遍认为细胞的凋亡和坏死为血液内ctdna的主要来源。近年来，大量ctdna检测在肿瘤诊断、治疗中的研究被报道。epigenomicsag公司的septin9基因甲基化检测试剂盒epiprocolon2.0为结直肠癌辅助诊断提供了一个良好的检测手段，但是存在检测血量太大，检测灵敏度较低的问题。综上所述，仍有必要提供一种的待测样本血量少、灵敏度高的基因甲基化检测试剂盒。技术实现要素：鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种用于检测结直肠癌的试剂盒。本发明以检测血浆ctdna发现结直肠癌发生的方法，通过对循环肿瘤dna(ctdna)甲基化异常高灵敏度检测，可同时对多个结直肠癌标记物的甲基化异常进行分析，对ctdna甲基化异常有低至0.1％的检测灵敏度，可实现肿瘤的早期发现、复发的实时监控，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、普及度高、检测结果稳定的优势。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：用于检测结直肠癌的试剂盒，包括寡核苷酸预混液i组中核苷酸序列，所述核苷酸序列seqidno.01、seqidno.02、seqidno.03、seqidno.04、seqidno.05、seqidno.06、seqidno.07、seqidno.08、seqidno.09、seqidno.10。在一些实施例中，还包括包括寡核苷酸预混液ii组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括包括seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.08、seqidno.09、seqidno.10。在一些实施例中，还包括游离dna甲基化溶剂。在一些实施例中，还包括pcr检测预混液、pcr检测核苷酸预混液、质控品试剂；所述pcr检测核苷酸预混液包括pcr检测核苷酸预混液i和pcr检测核苷酸预混液ii；所述pcr检测核苷酸预混液i包括所述第一组核苷酸序列，所述pcr检测核苷酸预混液ii包括所述第二组核苷酸序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列seqidno.04的3’端带有间壁3修饰；所述核苷酸序列seqidno.04的第16、23、25、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。锁核酸修饰可以增加阻遏片段(blocker)对于模板的结合能力，使得阴性模板更易被阻遏。在一些实施例中，所述核苷酸序列seqidno.15的3’端带有间壁3修饰；所述核苷酸序列seqidno.15的第4、8、11、21位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。在一些实施例中，所述游离dna甲基化溶剂包括亚硫酸氢盐修饰试剂、dna保护液、脱磺液、漂洗液、洗脱液、和/或氧化硅磁珠悬浮液。在一些实施例中，所述pcr检测预混液包括聚合酶缓冲液、taq聚合酶、二价阳离子、和/或dntps。在一些实施例中，所述质控品包括阳性质控品、阴性质控品、和/或空白质控品。在一些实施例中，所述阳性质控品包括人工模拟血浆、和/或hct116细胞系dna；所述阴性质控品包括人工血浆、和/或hct116细胞系dna；所述空白质控品包括人工模拟血浆。一种根据上述任意一项所述的试剂盒在结直肠癌诊断、结直肠癌实时监测或术后复发诊断中的应用。在一些实施例中，采用q-pcr检测法进行检测，所述q-pcr检测法为三重pcr检测的组合方式。在一些实施例中，所述三重pcr检测的组合方式包括：检测管i为septin9、bcat1、和actb；和/或检测管ii为ikzf1、sdc2、actb。在一些实施例中，采用pcr检测的荧光信号为三个通道，所述三个通道采集的荧光信号分别为513nm-523nm、543nm-553nm、和662nm-672nm。与现有技术相比，本发明提供的用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用，达到的技术效果是：(1)本发明的试剂盒可以用于结直肠癌的早期检测、或术后复发检测；(2)假阳性率低：蛋白质标记血液含量在非肿瘤的病理或生理条件下也有可能升高，而本发明试剂盒的靶标只有在癌变和癌前病变的细胞存在时才会出现，假阳性几率低；(3)能够实时反映肿瘤的动态：大多数蛋白质生物标识能在血液中存在数周，而ctdna的半衰期不到两个小时，因此本发明检测试剂盒可呈现肿瘤实时进展情况；(4)敏感性更高：依赖于高灵敏度检测技术以及多基因甲基化标记物，本发明检测试剂盒可对单拷贝ctdna进行定量、定性分析，由此实现较高的检测灵敏度；(5)更小的血液使用量：采集血液量较大时病人依存性较差，检测4个靶标基因时使用3重pcr可以将血液采集量由20ml降低为10ml，有效的提高了患者依存性；(6)较二重、一重检测，三重pcr检测可以使用同等的血液量检测3个基因(1个内参基因和两个靶标基因)，在不提高采血量的同时通过多靶标检测提高检出率。附图说明图1是根据本申请一些实施例，bcat1,sept9基因检测结果为阳性的样本检测结果图；图2是根据本申请一些实施例，sdc2,ikzf1基因检测结果为阳性的样本检测结果图；图3是根据本申请一些实施例，bcat1,sept9基因检测结果为阴性的样本检测结果图；图4是根据本申请一些实施例，sdc2,ikzf1基因检测结果为阴性的样本检测结果图。以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。实施例1用于检测结直肠癌的试剂盒组成本申请中检测结直肠癌的试剂盒组成可以包括如表1所示：表1试剂盒的组成实施例2用于检测结直肠癌的试剂盒组成本申请中检测结直肠癌的试剂盒组成可以包括如表2所示：表2试剂盒的组成以下将具体阐述实施例1、实施例2中所用的各部分组成：血浆游离dna修饰试剂包括：(1)亚硫酸氢盐修饰试剂含有50g亚硫酸氢钠固体，使用时需溶解在1ml去离子水中；(2)dna保护液可以包含溶解在二甲醚中的水溶性ve，其浓度可以为2-4m。其中，在一些实施例中，其最优浓度为3.2m；(3)结合液可以包括异硫酸氢胍，其浓度为5-8m。其中，在一些实施例中，其最优浓度可以为6.6m；(4)脱磺液可以包括氢氧化钠，其浓度为1.0-2.0m。其中，在一些实施例中，其最优浓度可以为1.6m；(5)漂洗液可以包括75％无水乙醇、tri-hcl，tri-hcl的浓度可以为8-12mm。其中，在一些实施例中，其最优浓度可以为10.5mm；(6)洗脱液可以包括tri-hcl，其浓度可以为10mmol/l；(7)磁珠悬浮液可以为氧化硅磁珠悬浮液，在一些实施例中，氧化硅磁珠悬浮液可以含有60-100mg/ml氧化硅磁珠。在一些实施例中，其最优浓度可以为80mg/ml。pcr检测预混液可以包括：聚合酶缓冲液，在一些实施例中其可以为含有2×聚合酶缓冲液；taq聚合酶，在一些实施例中，其含量可以为0.27u/μl；二价阳离子，在一些实施例中，二价阳离子可以为mgcl2，其浓度为24mm；dntps浓度可以为4.0mm。pcr检测核苷酸预混液i可以包括如表3所示的核苷酸序列，及其含量。表3pcr检测核苷酸预混液ipcr检测核苷酸预混液ii可以包括如表4所示的核苷酸序列，及其含量。表4pcr检测核苷酸预混液ii其中，seqidno.04核苷酸序列3’端带有间壁3修饰；第16、23、25、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。seqidno.15核苷酸序列3’端带有间壁3修饰，第4、8、11、21位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。质控品试剂包括：(1)阳性质控品试剂：可以包括人工模拟血浆、hct116细胞系dna，dna浓度为10ng/ml；(2)阴性质控品试剂：可以包括人工模拟血浆、juarket细胞系dna，dna浓度为10ng/ml；(3)空白质控品试剂：可以为人工模拟血浆(外购)。实施例3本发明试剂盒的检测方法1)对待测样本、质控品进行核酸富集，洗脱液洗脱后进行亚硫酸氢盐修饰，纯化后得到待测样本模板、质控品模板；2)对待测样本模板、质控品模板进行pcr检测，将待测样本模板、质控品模板分别加入两组pcr检测管中；3)将待测样本模板、质控品模板分为检测管i、检测管ii中进行；检测管i组成如表5：表5检测管i组成pcr预混液15μlpcr检测核苷酸预混液i1μlddh2o6μldna/质控品8μl检测管ii组成如表6：表6检测管ii组成4)将pcr检测管放入qpcr仪器中，涉及程序如下：步骤1：35℃-39℃，反应30分钟；步骤2：92℃-96℃，优选地94℃反应2分钟；步骤3：54℃-58℃，反应40秒，然后94℃反应30秒，循环15次：步骤4：65℃反应2秒，56℃反应40秒(收集荧光)、94℃反应20秒，循环30次；步骤5：40℃反应：30秒。在一些具体的实施例中，程序可以如下：步骤1：37℃反应30分钟；步骤2：94℃反应2分钟；步骤3：56℃反应40秒、94℃反应30秒，循环15次：步骤4：65℃反应2秒、56℃反应40秒(收集荧光)、94℃反应20秒，循环30次；步骤5：40℃反应：30秒。其中，检测管i检测的荧光信号为三个通道，采集的荧光信号为518nm，548nm，667nm；检测管ii检测的荧光信号为三个通道，采集的荧光信号为518nm，548nm，667nm；待测样本可以包括肿瘤组织基因组dna、外周血游离dna、尿液游离dna或排泄物细胞dna中的一种或者任意组合。5)对检测数据进行分析：检测无效判读：i组：actb的扩增ct值＞23，或ntc有扩增detarn＞0.1，或nc中sept9，bcat1扩增，荧光升高detarn＞0.1；ii组：actb的扩增ct值＞23，或ntc有扩增，荧光升高detarndetarn＞0.1；nc中sdc2,ikzf1任一基因有扩增，荧光升高detarn＞0.1。检测阳性判读：在无检测无效判读的前提下，将4靶标基因的检测ct值带入回归方程：将4基因的检测ct值带入回归方程：y＝-42.40+42.76*sept9+21.82*ikzf1+21.82*bcat1+20.59*sdc2，得到的数值＞0。检测阴性判读：在无检测无效判读的前提下，将4靶标基因的检测ct值带入回归方程：y＝-42.40+42.76*sept9+21.82*ikzf1+21.82*bcat1+20.59*sdc2，得到的数值≤0。对于单个基因大于等于阈值计为“1”，小于阈值计为“0”；4靶标基因阈值为：sept9为23.2、bcat1为24.1、sdc2为23.4、ikzf1为24.5。内参基因阈值为21.0。实施例4亚硫酸氢盐处理dna回收率、转化率待测样本：参考品dna：来源于肿瘤组织，使用超声波打碎为50-300bp片段之间，使用ddpcr定量仪器：agilent2200tapestation、高速离心机、pcr仪、漩涡震荡仪、瞬时离心机、冰箱步骤：(1)取一个200ulep管，依次加入表7中的试剂，后盖紧管盖涡旋混匀，瞬时离心。加入的dna量依次为10ng、20ng、40ng；表7反应体系(2)将ep管放入pcr仪，按下列程序进行亚硫酸氢盐处理反应。表8反应程序(3)纯化dnaa、在1.5mlep管中，加入上步反应混合液，再加入1.8ml结合液，涡旋混匀，瞬时离心；b、加入50ul磁珠悬浊液，旋转30分钟，后放在磁力架，30秒后倒出液体；c、加入100ul漂洗液，在涡旋振荡仪上震荡30s，后放在磁力架，30秒后倒出液体；d、加入200μl脱磺液，室温(20-25)放置20min，后放在磁力架，30秒后倒出液体；e、加入200ul漂洗液，在涡旋振荡仪上震荡30s，后放在磁力架，30秒后倒出液体；f、重复上次；g、加入40ul洗脱液，后放在磁力架，30秒后吸出液体；即为纯化后的dna溶液。(4)回收率计算使用ddpcr对纯化回收回来的dna进行定量，得到的回收率：表9dna回收率投入量(ng)回收量(ng)回收率106.8968.9％2014.6573.25％4029.7574.38％(5)转化率计算使用纯化得来的dna，进行sanger测序，与原序列对比后得知c转u的转化率。共统计474个c，只有一个c未转变为u，转化率为99.79％。实施例5pcr检测体系性能分析仪器：abi7500、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱。配置不同浓度的阳性参考品：297copies/10ng、99copies/10ng、33copies/10ng、11copies/10ng。pcr检测方法：a.检测管i：取一个1.5mlep管，依次加入15μlpcr检测预混液、1μl核苷酸预混液i、6μlddh2o，涡旋混匀，瞬时离心。检测管ii：取一个1.5mlep管，依次加入15μlpcr预混液、1μl核苷酸预混液ii、6μlddh2o，涡旋混匀，瞬时离心。b.将检测管i、检测管ii预混液分装至96孔板中，后加入模板dna和质控品。c.将96孔板瞬时离心，放入abi7500仪器中，设置荧光定量pcr仪程序如下进行反应：步骤1：37℃反应30分钟；步骤2：94℃反应2分钟；步骤3：56℃反应40秒、94℃反应30秒，循环16次：步骤4：65℃反应2秒、56℃反应40秒(收集荧光)、94℃反应20秒，循环30次；步骤5：40℃反应：30秒。其中，检测管i检测的荧光信号为三个通道，采集的荧光信号为518nm、548nm、667nm；检测管ii检测的荧光信号为三个通道，采集的荧光信号为518nm、548nm、667nm；(2)检测结果检测管i、检测管ii中3重pcr扩增无干扰，基因扩增效率分别为sept9：105％；bcat1：98％；sdc2：108％；ikzf1：105％。实施例6本申请的试剂盒在结直肠癌诊断、术后诊断中的应用待测样本：待检血浆样本(4ml)40例、阳性质控品(4ml)、阴性质控品(4ml)、空白质控品(4ml)，详细待测样本如表10所示：表10待测样本的基本信息仪器：abi7500、高速离心机、pcr仪、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱。操作方法：1.核酸富集：使用qiaampcirculatingnucleicacid(货号55114)，按照说明书提取血浆游离dna。使用agilent2200tapestation电泳平台，对cfdna进行qc质控。2对游离dna进行亚硫酸氢钠处理(1)取一个200ulep管，一次加入下列试剂，后盖紧管盖涡旋混匀，瞬时离心，其反应体系如表7；(2)将ep管放入pcr仪，按下列程序进行亚硫酸氢盐处理反应。其程序如表8所示；(3)纯化dnaa、在1.5mlep管中，加入上步反应混合液，再加入1.8ml结合液，涡旋混匀，瞬时离心；b、加入50ul磁珠悬浊液，旋转30分钟，后放在磁力架，30秒后倒出液体；c、加入100ul漂洗液，在涡旋振荡仪上震荡30s，后放在磁力架，30秒后倒出液体；d、加入200μl脱磺液，室温(20-25)放置20min，后放在磁力架，30秒后倒出液体；e、加入200ul漂洗液，在涡旋振荡仪上震荡30s，后放在磁力架，30秒后倒出液体；f、重复上次；g、加入40ul洗脱液，后放在磁力架，30秒后吸出液体；即为纯化后的dna溶液。3.pcr检测(1)检测管i：取一个1.5mlep管，依次加入15μlpcr预混液、1μl核苷酸预混液i、6μlddh2o、涡旋混匀，瞬时离心；检测管ii：取一个1.5mlep管，依次加入15μlpcr预混液、1μl核苷酸预混液ii、6μlddh2o、涡旋混匀，瞬时离心；(2)将检测管i、检测管ii预混液分装至96孔板中，排板如下，后加入模板dna和质控品。i-s1i-s9i-s17i-n5i-n13i-ncii-s1ii-s9ii-s17ii-n5ii-n13ii-nci-s2i-s10i-s18i-n6i-n14i-pcii-s2ii-s10ii-s18ii-n6ii-n14ii-pci-s3i-s11i-s19i-n7i-n15i-ntcii-s3ii-s11ii-s19ii-n7ii-n15ii-ntci-s4i-s12i-s20i-n8i-n16ii-s4ii-s12ii-s20ii-n8ii-n16i-s5i-s13i-n1i-n9i-n17ii-s5ii-s13ii-n1ii-n9ii-n17i-s6i-s14i-n2i-n10i-n18ii-s6ii-s14ii-n2ii-n10ii-n18i-s7i-s15i-n3i-n11i-n19ii-s7ii-s15ii-n3ii-n11ii-n19i-s8i-s16i-n4i-n12i-n20ii-s8ii-s16ii-n4ii-n12ii-n20(3)将96孔板瞬时离心，放入abi7500仪器中，设置荧光定量pcr仪程序进行反应；4.检测结果如表11所示、和图1-图4所示：表11试剂盒在结直肠癌术后复发患者中的检测结果5.检测结果讨论按照判读标准，40例检测actbct值都小于32，各基因ntc无扩增，除了内参基因各基因nc无扩增，各基因pc扩增正常，表明检测都为有效检测，具体检测结果如表11。在该示例性实验中检测8例结直肠癌临床确诊病人，7例检测为阳性；17例临床检查为无结直肠癌人群，16例检测为阴性；检测12例结直肠癌术后复发患者，10例检测为阳性；3例结直肠癌术后未复发患者，3例都检测为阴性。检测总灵敏度为85％，特异性为95％。由此说明说明本发明试剂盒具有良好的检测性能。本发明的试剂盒还可以用于实时监控结直肠癌的动态，例如每月监控结直肠癌的进展动态。序列表<110>苏州艾达康医疗科技有限公司<120>用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用<141>2018-12-05<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgcgattcgttatttattaa20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttcgaaattcgaaataat18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttaatcgcgaaattcgat18<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tattaattattatattgaattttgtgattaatg33<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gtcgcgagagggtcggtttg20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctaaaacaatacccgaaacga21<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tagttcgttacgtgtattcgtc22<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtttagtaagttttttggattgtga25<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9acctactcctcccttaaaaattac24<210>10<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caacacacaataacaaacacaaattcac28<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ttttgcgtttttttgcgcgtt21<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cgcgcacctctcgacc16<210>13<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tttgtatcggagtagcgattcgggagg27<210>14<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gtagttgcgggcggcg16<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gaaaactcgaactcgaaactcg22<210>16<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16taggaggaggaagcgagcgttttcgag27<210>17<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17ttgtgggtggtgggagtaggtgtagg26当前第1页12