大麦P3G和C3G合成主效QTL紧密连锁的InDel分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用。

背景技术：

花青素是一类广泛存在于水果、蔬菜、谷物中的水溶性的黄酮类化合物。花青素具有清除自由氧化基的能力，而后者能够引起细胞内的氧化应激反应。因此，花青素可以为人类的健康提供多方面的益处，特别是在抗氧化伤害和解毒方面起重要的作用，此外花青素还有抗炎、抗肥胖、抗癌症和和降血糖作用。这些生物功能使得花青素在食品工业、营养保健品和功能食品等领域都具有可观的潜在价值。大麦广泛分布于世界各地，在不同的生长环境下都具有较好的适应能力，无论是种植面积还是产量大麦都是世界范围内的第四大粮食作物。长期以来，大麦主要用于动物饲养或者作为麦芽汁原料以生产酒精型和非酒精型的饮料。大麦富含β-葡聚糖可以降低人体胆固醇，而且对降血糖和减肥也有不错的效果。因此，近些年来大麦因其营养和保健价值逐渐成为一类重要的健康食品原料，而彩色的大麦因其富含花青素被赋予了更多的价值。彩色大麦对人类健康具有重要的潜在的价值，是功能食品和保健营养品开发的重要材料，而且其抗氧化性和抗突变作用不仅在大麦籽粒中可以检测到，在其发酵液中也能得到检测。

虽然针对彩色大麦的遗传分析已有不短的历史，但都这些研究都是基于各个组织的颜色的分离而开展，存在表型难以量化或者不准确的缺点。自然状态的花青素常以多糖苷的形式存在(花色苷)。糖基的数量、种类以及连接的位置会影响到花青素的颜色、稳定性和抗氧化性等因此影响不同花青素的使用价值，最终决定不同材料的加工利用价值。更重要的是，已有的研究表明颜色不同甚至颜色相近的大麦籽粒中的花青素总含量，花青素组成以及抗氧化都表现出明显的差异，可以推测与其花青素合成有关的遗传调控方式也可能各不相同。在不同的彩色大麦育种过程中需要考虑到其花青素组成情况，特别是一些有重要作用的花青素成分。利用特异花青素分子作为表型数据对彩色大麦进行遗传分析，可以获得更丰富也更加准确的结果，对培育富含特定花青素种类的彩色大麦有重大指导意义。在众多彩色大麦中，芍药色素-3-葡萄糖苷(peonidin-3-glucoside,p3g)和矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside,c3g)普遍存在的重要花青素成分。

作物遗传改良是在作物中人为地对优良基因进行选择和集成的一个过程。利用准确、高效的方法对被转移的外源目的基因或染色体片段进行鉴定，可以提高选择的有效性，提高育种效率，缩短育种周期，是遗传育种过程中十分重要的环节。在彩色大麦种子中，花青素通常从开花后几周才开始积累，也即其种子颜色需在开花后几周才开始可以观测到。分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因进行选择，在植物生长早期就能进行检测，因而能大大提高育种效率。

indel分子标记基于pcr扩增技术，可以检测近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点发生的不同大小核苷酸片段的插入或缺失，具有稳定性好、多态性高、分型系统简单的优点，近年来开始被广泛运用于群体遗传分析和分子辅助育种工作中。目前，尚未发现有关大麦p3g和c3g合成基因/遗传位点紧密连锁的分子标记序列信息的报道。因此，筛选出彩色大麦中p3g和c3g合成基因紧密连锁的分子标记，尤其是操作简便、结果准确的indel(insertion-deletion)标记，能大大提高选择效率，从而提高彩色大麦育种效率，对培育富含特定花青素种类的彩色大麦有重大指导意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用，该分子标记(baid2h)可以鉴定大麦植株中是否具有pbg.ant-2h位点，快速筛选出具有p3g和c3g合成主效qtl的大麦品种或品系，加快特色大麦品种育种过程。

本发明提供了大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明所述的彩色大麦籽粒p3g和c3g合成主效qtl为pbg.ant-2h，基于栽培大麦hordeumvulgarecv.morex和野生大麦awcs079的基因组信息，利用生物信息学软件clcgenomicsworkbench9.0.1对pbg.ant-2h两侧序列进行比对，筛选出两者在基因序列有50bp以上连续插入或者缺失差异的片段，筛选出多个indel分子标记，其中，序列如seqidno:1所示的分子标记的特异性良好，记为baid2h。

本发明提供的分子标记可以鉴定大麦植株中是否具有与pbg.ant-2h位点紧密连锁的indel分子标记，快速筛选出具有p3g和c3g合成主效qtl的大麦品种或品系，加快特色大麦品种育种过程。

检测本发明所述分子标记的引物组，其由seqidno:2～3所示核苷酸序列的2条引物组成。

本发明所述的引物组在引物组在彩色大麦育种中的应用。

与pbg.ant-2h紧密连锁的indel分子标记的有和无真正地直接地决定了两种花青素的含量的有无或高低。通过本发明分子标记检测可以鉴定这个遗传位点的有或无。

所述彩色大麦育种为根据扩增结果，判断pbg.ant-2h遗传位点紧密连锁的分子标记的存在与否，进而预测大麦种粒中花青素p3g和c3g的含量的有无或高低。

大麦籽粒中的花青素p3g和c3g合成主效qtl检测试剂盒，其包括本发明所述的引物组。

本发明所述的试剂盒中，还包括marker；所述marker中包括2个dna分子，长度相差113bp。

一些具体实施例中，所述试剂盒的marker中两个片段的分子量分别为612bp、499bp。

本发明所述的试剂盒中，dntp、mgcl2和taq聚合酶。

本发明还提供了一种大麦籽粒中的花青素p3g和c3g合成主效qtl检测方法，包括：

以大麦叶片基因组dna为模板，以本发明所述的引物组进行pcr扩增，根据扩增产物判断大麦籽粒中的花青素p3g和c3g合成主效qtl的有无。

本发明实施例中，所述大麦叶片为大麦的幼嫩叶片。具体为大麦植株生长早期的叶片。

所述基因组dna的提取方法为ctab法。

本发明实施例中，每25μl所述pcr扩增的体系包括：水和10～100ng基因组dna、0.4μmol/l正向引物、0.4μmol/l反向引物、3mmol/lmgcl2，1mmol/ldntps和2.5utaqdna聚合酶，

本发明实施例中，所述pcr扩增的程序为：

95℃变性5min；

72℃终延伸10min。

本发明实施例中，所述判断为：

所述扩增产物中片段数量为2，则该植株中存在pbg.ant-2h，且控制大麦籽粒中p3g和c3g合成的遗传位点为为杂合型；

所述扩增产物仅为一个长片段，则该植株存在pbg.ant-2h，且控制大麦籽粒中p3g和c3g合成的遗传位点为纯合型；

所述扩增产物仅为一个短片段，不存在与大麦籽粒中花青素p3g和c3g合成的主效qtl。

通过本发明分子标记检测可以鉴定所述pbg.ant-2h遗传位点的有或无，进而判断大麦籽粒中两种花青素的含量的有无或高低。

所述长片段与短片段的长度相差113bp；具体的，长片段的分子量为612bp、短片段的分子量499bp。

本发明提供了大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记，并提供了该分子标记的检测引物。本发明提供标志物具有良好的特异性，可以鉴定大麦植株中是否具有与pbg.ant-2h位点紧密连锁的indel分子标记，快速筛选出具有p3g和c3g合成主效qtl的大麦品种或品系，可应用于大麦育种的早代选择，并在大麦植株生长的早期进行检测，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快育种速度，降低育种成本，该检测方法具有操作简单，成本低廉，周期短的优点。

附图说明

图1示不同分子标记的亲本间多态性检测结果，其中m代表dna分子量标准dl5000，g代表亲本gairdner，r代表亲本russia68；baid2h代表筛选合格的indel分子标记baid2h引物pcr扩增产物，unqid1和unqid2分别代表不合格的indel标记unqid1和unqid2引物pcr扩增产物，bmac0144、gbm1440和gbm1468分别代表ssr标记bmac0144、gbm1440和gbm1468引物pcr扩增产物；

图2示利用baid2h标记引物扩增紫色大麦russia68和无色大麦gairdner基因组的测序结果比对，其中r-baid2h代表紫色大麦russia68的baid2h序列，g-baid2h代表无色大麦gairdner的baid2h序列，下划线表示baid2h标记引物的位置，-代表序列缺失；

图3示利用baid2h标记鉴定群体基因型，其中g代表亲本gairdner的扩增产物，r代表亲本russia68的扩增产物，1～14分表代表编号1～14的群体样本的扩增产物；

图4示单标记法分析baid2h标记与p3g和c3g的含量关联性，其中图4-a代表baid2h标记与c3g含量关联分析，图4-b代表baid2h标记与p3g含量关联分析；a和a分别代表来自于紫色亲本russia68和无色亲本gairdner的等位基因。

具体实施方式

本发明提供了大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

以下实施例中涉及的紫色大麦russia68从usda-ars(http://www.ars-grin.gov)获得，无色大麦gairdner从澳大利亚联邦科工组织植物产业部种子库获得；花青素p3g和c3g标准品购自于phytolab公司，taq酶、mgcl2和ntps等pcr反应组分购自于bioline公司，其他试剂若无特别说明，均购自于sigma公司。

各试剂配方如下：

ctab缓冲液：0.1mol/ltris-hcl(ph8.0)+1％ctab(m/v)+0.7％nacl(m/v)+10mmol/ledta；

花青素提取液：methanol:1mhcl＝85:15；

溶液b:formicacid:acetonitrile:water＝0.1:90:9.9；

溶液a:formicacid:water＝0.1:99.9。

实施例1

根据文献(xiao-weizhang,qian-taojiang,yu-mingwei,etal.inheritanceanalysisandmappingofquantitativetraitloci(qtl)controllingindividualanthocyanincompoundsinpurplebarley(hordeumvulgarel.)grains.plosone,2017,12:e0183704)报道的彩色大麦籽粒p3g和c3g合成主效qtlpbg.ant-2h，基于栽培大麦hordeumvulgarecv.morex和野生大麦awcs079的基因组信息，利用生物信息学软件clcgenomicsworkbench9.0.1对pbg.ant-2h两侧序列进行比对，筛选出两者在基因序列有50bp以上连续插入或者缺失差异的片段，通过primerpremier5软件在插入或者缺失位置处两端设计pcr扩增引物对，扩增产物控制在150-500bp左右。

用ctab法提取紫色亲本russia68和无色亲本gairdner的幼嫩叶片基因组dna。以两亲本的基因组dna为模板，用上述步骤设计的引物进行pcr扩增。pcr的反应体系为：50ng基因组dna，0.4μm正向和反向引物，3mmmgcl2，1mmdntps，2.5utaqdna聚合酶，加水至总体系为25μl。pcr反应程序包括一个时长2min的98℃变性阶段，扩增阶段包括35个循环，每个循环的参数为98℃变性10s，59℃退火20s,72℃延伸40s，最后进行5min的终延伸反应。pcr产物经2％的琼脂糖电泳检测，电泳缓冲液为1×tbe，电泳的功率恒定为50w。

各标志物及引物如表1：

表1标记名称及引物

以各引物扩增紫色大麦russia68和无色大麦gairdner的叶片基因组dna，评价各标志物的特异性，结果如图1所示。如图所示，只有标志物baid2h能够清晰的分辨两种不同颜色大麦的基因型。利用标记baid2h引物扩增紫色大麦russia68和无色大麦gairdner基因组的测序结果如图2所示。

实施例2

本发明分子标记baid2h在选择大麦p3g和c3g合成主效qtlpbg.ant-2h上的应用试验

利用紫色大麦russia68作为母本，以无色大麦gairdner作为父本杂交，获得杂种f1，f1单株自交获得f2，在f2随机挑取120个单株构成f2遗传验证群体。

2.1花青素的提取、定性定量分析

收集f2验证群体的籽粒，置于28℃的通风箱中两周直至测定。基于文献(abdel-aalandhucl2007)，利用改良的方法提取籽粒中的花青素，具体操作流程如下：球磨机粉碎籽粒，0.2mm的筛网过筛。花青素提取液按照10:1的比例(v/m)添加入面粉中，混匀后调ph值至1。混合物于摇床上4℃，250rpm振荡混匀24h，然后10,000×g离心25min。上清液转至干净的离心管中作为待检测的样品。花青素标准品用花青素提取液进行溶解和梯度稀释。10μl样品或者标准品被注入shimadzunexera高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,hplc)系统，然后进入kinetex的c181.7μm的分离柱(phenomenex2.1mm×100mm)，流速为0.4ml/min，共洗脱15分钟,温度为60℃。梯度洗脱的程序如下：溶液b由5％上升至45％进行线性洗脱，共计十分钟；然后溶液b由45％上升至80％进行洗脱，持续一分钟；80％b溶液持续洗脱一分钟，最后用5％溶液b进行洗脱。移动相由溶液a和溶液b构成。6500qtrap质谱仪(ab/sciex)与hplc系统进行连接，对各个花青素化合物的进行定性和定量分析。质谱仪的运行参数如下：curtaingas35psi(poundspersquareinch),gs140psi,gs2,50psi；离子喷雾电压(ionsprayvoltage,is)为5500v，反应温度为500℃。所有的数据经由analyst1.6.2^tm(ab/sciex)软件进行分析和获取。每一个花青素分子用八离子转化法进行检测，并选择其中一个离子进行定量分析。每一个选定的定量离子峰用软件multiquant3.0(absciex)进行综合分析和计算，每一个信号值/噪音的比值大于7的峰被用于定量分析。

2.2利用分子标记baid2h鉴定f2群体基因型

利用实施例1筛选获得的分子标记baid2h的引物作为pcr反应引物，同时扩增紫色大麦母本russia68、无色大麦亲本gairdner和f2群体植株的dna，进行基因型鉴定，获得分子标记数据，pcr反应和检测过程如实施例1，结果如图3所示，利用baid2h标记的引物可以清晰地、准确地鉴定出大麦中pbg.ant-2h位点的基因型。

2.3分子标记的验证

根据步骤2.1获得的群体植株表型数据和步骤2.2获得的群体植株基因型数据，利用作图软件mapqtl5.0(vanooijen2004)进行单标记分析(singlemarkeranalysis,sma)。结果如图4所示，baid2h标记指示的遗传位点与大麦花青素p3g和c3g的含量有极显著的的关联，进而说明baid2h标记与pbg.ant-2h位点紧密连锁。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院麻类研究所

<120>大麦p3g和c3g合成主效qtl紧密连锁的indel分子标记及其应用

<130>mp1815395

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

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