一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的InDel标记引物及分子标记方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的indel标记引物及分子标记方法。

背景技术：

甜瓜(cucumismelol.)为一年生葫芦科(cucurbitaceae)黄瓜属(cucumis)作物，其色香味俱全，并且具有较高的营养价值，是一种广受欢迎的水果。甜瓜果肉颜色主要分为绿色、白色和橘色，与绿色和白色果肉甜瓜相比，橘色果肉甜瓜颜色更加诱人，更重要的是其具有更高的营养价值，所以受到消费者的偏爱。因此培育合适果肉颜色的甜瓜品种，特别是橘色果肉的甜瓜品种，是当前甜瓜遗传育种的重要目标之一。

甜瓜果肉颜色由叶绿素和类胡萝卜素共同决定，其中类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素是决定甜瓜橘色果肉的关键色素。β-胡萝卜素广泛存在于新鲜蔬菜和水果中，是人体必不可少地营养元素之一。适量摄入β-胡萝卜素可以缓解由维生素a缺乏引起的多种病症，并具有预防癌症、心脑血管疾病和眼部疾病的功效，还有抗氧化和预防衰老的作用。前人的研究表明甜瓜果肉颜色由两个等位基因决定，分别为gf(决定果肉绿色)、wf(决定果肉白色)，而gf决定橘色果肉，它同时对gf和wf呈显性上位效应。值得注意的是galiltzuri(theplantjournal,2015,vol82:267-279)在甜瓜中发现一个可以增加果肉β-胡萝卜素含量的基因cmor，被证明是甜瓜中的gf位点，它是控制甜瓜果肉颜色的关键因子，含有正常功能cmor基因的甜瓜表现为橘色的果肉，含有突变形式cmor基因的甜瓜表现为绿色或白色果肉。

当前对于，一般还采用传统方法，即对育种材料成熟期的果实颜色进行鉴定，具有费时、费力、易受环境影响等缺点。分子标记辅助育种可以直接从基因组水平对与目标性状连锁的标记进行选择，达到对目标性状选择的目的，具有省时、省力、不受环境影响等优点，可以大幅缩短育种周期，是传统育种技术的有力补充。indel(insertion-deletion)分子标记具有准确性高、稳定性好等优点，并且其检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，能够基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物，直接进行pcr扩增，电泳技术检测即可。

开发合适的indel分子标记，用于橘色果肉的甜瓜品种或品系的选育，能够提高育种效率，降低育种成本，加快甜瓜的育种进程，具有很高的实际应用价值。

技术实现要素：

对于橘色果肉甜瓜的选育，育种材料成熟期的果实颜色进行鉴定的传统方法具有费时、费力、易受环境影响等缺点，为了克服现有技术中的这些缺点，本发明提供了一种用于鉴定厚皮甜瓜果肉颜色的专用引物及分子标记方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的indel标记引物，其特征是所述引物为如序列表中seqidno.3所示，从5’端到3’端的第1-25位的单链dna序列的正向引物agaggagactgtagccgatgtttgg；和如序列表中seqidno.4所示，从5’端到3’端的第1-28位单链dna序列的反向引物caacctttcttctcccattgcacattgc。

利用本发明的分子标记专用引物，以待检测材料的基因组dna为模板，通过pcr扩增获得分子标记，通过测序可得到：

果肉为橘色的甜瓜材料的分子标记大小为560bp的pcr产物，如序列表中seqidno.1所示，从5’端到3’端的单链dna序列为：

agaggagactgtagccgatgtttggatttcatcatctaatgcttgggggtttgcatcttcttcccaacttaatgatttgaagattactgaatgggcttctttaactcatcgcttgtcttctgtcagatttcattcttctcctgattcatggatatggtcccttgactcctctatgttattgttaagtttctcatggctgacttggtgtgtaggtgcatgatccacgcttttttgtttttattatgttatctggaaggatttttatccaaagaagataaaagtctttctttgggaatttagttcggaagcgatcaatactgtgaagtgcgttcagtgtcaaatgccttatatgtatctctcttcatcttggggtctcatatgcttccatcactttgagtcaccagcccatttgtttattcattgcccttttgcatcaaaattttggactttctttttttagtgagaaacagacgatcataatttcattgataatgtggaattacagaagggaaaaaaagccatctgattacatgcaatgtgcaatgagagaagaaaggttg；

果肉为绿色或白色的甜瓜材料的分子标记大小为488bp的pcr产物，如序列表中seqidno.2所示，从5’端到3’端的单链dna序列为：

agaggagactgtagccgatgtttggatttcatcatctaatgcttgggggtttgcatcttcttcccaacttaatgatttgaagattactgaatgggcttctttaactcatcgcttgtcttctgtcagatttcattcttctcctgattcatggatatggtcccttgactcctctatgttatctggaaggatttttatccaaagaagataaaagtctttctttgggaatttagttcggaagcgatcaatactgtgaagtgcgttcagtcaaatgccttatatgtatctctcttcatcttggggtctcatatgcttccatcactttgagtcaccagcccatttgtttattcattgcccttttgcatcaaaattttggactttctttttttagtgagaaacagacgatcataatttcattgataatgtggaattacagaagggaaaaaaagccatctgattacatgcaatgtgcaatgagagaagaaaggttg

一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的分子标记方法，其特征是提取甜瓜待检测样品的基因组dna作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。

具体步骤如下：

1)利用ctab法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组dna；

2)以步骤1所得的待测样品基因组dna为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行pcr扩增，获得扩增产物；

3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对步骤2所得的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，使不同大小的pcr扩增产物处于不同的位置；

4)利用银染的方法检测凝胶电泳的结果，经过银染，通过肉眼观察可看到pcr扩增的dna片段在凝胶中的位置，距离上样孔距离远的，是小的dna片段488bp，距离上样孔近的，为大的dna片段560bp；

5)通过判断片段大小，pcr扩增片段较大的为果肉颜色为橘色的甜瓜材料，扩增片段较小的为果肉颜色为绿色或白色的甜瓜材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明方法特异性好，准确率可达到99.8％。

(2)本发明获得的分子标记及其特异性引物，在不同果肉颜色的甜瓜材料中可以对橘色果肉甜瓜材料进行很好的区分，因此，本发明获得了一个可以高效、准确区分厚皮甜瓜是否为橘色果肉甜瓜材料的分子标记。

(3)通过对pcr扩增产物直接电泳检测，可以清晰的将区分甜瓜材料是否为橘色果肉材料，省时省力，不受环境因素影响。

附图说明

图1为本发明的分子标记专用引物以不同颜色果肉甜瓜高代自交系的基因组dna为模板进行pcr扩增结果；其中m表示dnamarker，1号-20号表示不同样品的pcr扩增的结果，其中1、红蜜jr；2、改良金尊jr；3、nb507；4、水高庄hj；5、nb510；6、nb513；7、nb514；8、nb520；9、nb536；10、nb539；11、nb558；12、豫甜脆hp；13、nb563；14、nb565；15、nb567。

具体实施方式

下面结合附图与具体的实施方式对本发明作进一步详细描述：

以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中的甜瓜材料红蜜jr、改良金尊jr、nb507、水高庄hj、nb510、nb513、nb520、nb536、nb539、nb558、豫甜脆hp、nb563、nb565、nb567。公众可从天津大学植物资源及育种实验室获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

实施例1、分子标记的获得

甜瓜基因cmor是调节甜瓜果实颜色的重要调控因子，利用甜瓜基因组重测序信息，在该基因所在染色体的位置附近区域，筛选合适的indel位点，最终获得了1个具有多态性的indel标记，它们分别位于甜瓜(cucumismelol.)基因组第09染色体第上。为利用该indel位点，设计了合适的特异性引物，包括上游引物f和下游引物r，引物序列如下：

上游引物f:5'-agaggagactgtagccgatgtttgg-3'

下游引物r：5'-caacctttcttctcccattgcacattgc-3'

实施例2、高代自交系甜瓜果肉颜色的鉴定

不同颜色果肉甜瓜高代自交系红蜜jr、改良金尊jr、nb507、水高庄hj、nb510、nb513、nb514、nb520、nb536、nb539、nb558、豫甜脆hp、nb563、nb565、nb567。在田间正常种植、管理，将成熟后的甜瓜果实，从中间切开，观察果肉颜色，上述高代自交系的果肉颜色统计如下：

表1.甜瓜材料果肉颜色鉴定统计结果

实施例3、分子标记在鉴定甜瓜是否为橘色果肉甜瓜中的应用

对实施例2中的甜瓜材料，利用ctab法提取叶片的基因组dna，具体的步骤为：取甜瓜幼嫩叶片0.2g入1.5ml离心管中，加50μl2％ctab提取缓冲液，研磨，后补齐至400μl，65℃水浴30min；加入400μl氯仿：异戊醇(24:1)，轻摇5min。12000rpm离心5min；取上清200μl，加入预冷的异丙醇200μl混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μl预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μl溶解dna，室温放置1h；用蒸馏水将dna稀释到50ng/μl，作为pcr模板使用或-20℃保存备用。以上述甜瓜基因组dna为模板，实施例1中的上游引物f和和下游r为引物，进行pcr扩增，采用10μl的反应体系，包括：

pcr扩增采用的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

对pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶中，150v恒压电泳30min，eb染色后，用凝胶成像系统观察结果。也可以制成试剂盒，用于鉴定甜瓜是否为橘色果肉甜瓜。其中，在橘色果肉甜瓜，pcr扩增产物的电泳条带为560bp，在非橘色果肉的甜瓜，pcr扩增产物的电泳条带为488bp。根据电泳结果图，统计如表2和图1；

表2.甜瓜材料indel分子标记鉴定统计结果

将每个高代自交系甜瓜材料的果肉颜色鉴定结果与indel分子标记的鉴定结果进行统计，发现其结果完全一致。

综合以上结果可知，利用序列表中序列1所示的indel标记，即甜瓜基因组第09染色体上的1个indel标记，及其特异引物(序列表中的上游引物为序列no.2和下游引物为序列no.3)对待鉴定的甜瓜材料进行pcr扩增，电泳检测后，发现甜瓜果肉颜色的分子水平鉴定结果与表型鉴定结果一致，表明序列表中序列1所示的indel标记与甜瓜果肉颜色的表型紧密连锁，该indel标记及其特异引物可以用于对甜瓜果肉颜色进行辅助筛选和鉴定，筛选或者辅助筛选具有橘色果肉的甜瓜品系或品种。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110>天津大学

<120>一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的indel标记引物及分子标记方法

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>560

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<213>人工序列

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<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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