一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法与流程

本发明属于真菌物种鉴定技术领域，具体涉及一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法。

背景技术：

野生食用菌是一种重要的森林资源，在绿色食品开发、生物制药、环境保护等行业中发挥着重要的作用，特别是生长在林区的一些野生食用菌。红汁乳菇(lactariushatsudake)，云南俗称铜绿菌、铜锣菌，是世界著名的美味野生食用菌，具有很高的经济价值，长期供不应求。该菌除鲜食外，还可加工成菌油，或经速冻后长期保，具有巨大的规模开发的市场前景。此菌试验抗癌，对小白鼠肉瘤的抑制率为100％，对艾氏癌的抑制率为90％，它与松等树木形成外生菌根。在这些野生食用菌的分类及其菌丝体分离物的鉴定方面，人们主要根据野生食用菌子实体的形态学、解剖学等特征来确定菌种。野生食用菌不产生子实体或尚未找到子实体时，就无法进行野生食用菌菌种的鉴定。即使是从野生食用菌的子实体上分离到纯菌种，为避免伴生菌和杂菌的污染所产生的误导，也应遵循柯赫法则进行回接试验，产生相同子实体的鉴定方法是令人信服的。遗憾的是现在很多珍贵的野生食用菌，尚未成功人工栽培出菇，在这种情况下就很难断定分离菌株的真伪。

红汁乳菇为乳菇属的野生食用菌，具有独特的口感。目前，真菌类采用dna分子的方法鉴定一般使用its基因进行，但是由于近源种中存在保守序列，不能将目标菌与近源菌区分开，例如，红汁乳菇与红菇属中的青头菌用真菌its通用引物its4/its5扩增，无法鉴定红汁乳菇。目前使用的分子鉴定的dna区段无法特异性鉴定红汁乳菇物种。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法，能够从真菌中快速、准确地鉴定红汁乳菇。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段，所述特异性dna片段具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种用于扩增所述的特异性dna片段的引物，包括tb1引物和tb2引物；

所述tb1引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列；

所述tb2引物具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种红汁乳菇的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待检菌的基因组dna；

(2)以所述步骤(1)中提取的基因组dna为模板，用上述方案中的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

(3)将所述步骤(2)中扩增产物电泳，得到电泳图；

(4)根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇。

优选的，所述pcr扩增的体系为pcr扩增mix液22.5μl、所述tb1引物1μl、所述tb2引物1μl和dna3μl。

优选的，所述pcr扩增的程序如下：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。

优选的，所述电泳用琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％～2.5％。

优选的，所述电泳的电压为90v，所述电泳的电流为78ma。

本发明提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段，所述特异性dna片段具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。所述特异性dna片段为红汁乳菇的基因组dna中所特有的，能够使之区别与其他真菌，具有特异性强的特点。

本发明提供了基于上述特异性dna片段鉴定红汁乳菇的方法，采用pcr扩增的方法能够准确特异性扩增上述特异性dna片段，根据电泳图中特异性dna片段产生的230bp条带的存在判断待检菌为红汁乳菇。本发明提供的鉴定方法不仅能从多种远缘真菌中鉴定红汁乳菇，而且还能用于区别于红汁乳菇同属的近源菌，实现了从真菌中快速、准确地鉴定红汁乳菇。

附图说明

图1为待检菌的pcr产物的电泳图，其中y为阴性对照；t1为红汁乳菇；q1为青头菌；m为2000marker；

图2为本发明实施例2中pcr扩增电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段，所述特异性dna片段具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。所述用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段的来源可以委托序列合成公司合成得到。所述特异性dna片段属于真菌转录间隔区(its)的部分序列。所述特异性dna片段的长度为230bp。

本发明提供了一种用于扩增所述的特异性dna片段的引物，包括tb1引物和tb2引物；

所述tb1引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列；

所述tb2引物具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述引物的来源可以委托序列合成公司合成得到。在本发明实施例中，所述引物的合成委托昆明硕擎生物科技有限公司进行。本发明对所述引物的设计方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的引物设计方法即可。

本发明提供了一种红汁乳菇的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待检菌的基因组dna；

(2)以所述步骤(1)中提取的基因组dna为模板，用权利要求2所述的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

(3)将所述步骤(2)中扩增产物电泳，得到电泳图；

(4)根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇。

本发明提取待检菌的基因组dna。本发明对所述提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的手提或试剂盒均可。在本发明实施例中，所述提取方法优选采用凯杰公司的dnaisolationkit(货号为：12888-50)按照说明书的步骤进行dna提取。

提取得到的基因组dna进行核酸定量检测。基因组dna浓度高时用缓冲液进行稀释。在pcr扩增时，所述基因组dna的浓度优选为25ng/μl。

提取基因组dna后，本发明以所述提取的基因组dna为模板，用上述方案中的引物进行pcr扩增，得到扩增产物。

本发明对所述pcr扩增的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的pcr扩增方法即可。本发明对所述pcr扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员常见型号的pcr仪即可。

在本发明中，所述pcr扩增的体系优选为pcr扩增mix液22.5μl、所述tb1引物1μl、所述tb2引物1μl和dna3μl。所述pcr扩增的程序优选如下：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。

得到扩增产物后，本发明将所述扩增产物电泳，得到电泳图。

在本发明中，所述电泳用琼脂糖凝胶的质量浓度优选为1.5％～2.5％，更优选为2％。所述电泳时扩增产物的点样体积优选为2μl。

在本发明中，所述电泳的电压优选为90v，所述电泳的电流优选为78ma。本发明对所述电泳的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的电泳方法即可。

电泳结束后，将电泳凝胶染色，再用紫外透射仪检测拍照，得到电泳图。所述染色用染料为genefinder^tm。

得到电泳图后，根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇；若电泳图中没有230bp大小的条带，说明待检菌不是红汁乳菇。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段及红汁乳菇的鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.材料采集

红汁乳菇菌塘土样和青头菌菌塘土样品都是在云南省武定县采集到的(如表1)。采集方法：在每个红汁乳菇和青头菌生长地，用5点法取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃(土壤样品为含有该菌塘的真菌混合样品)。

表1材料采集信息一览表

2方法

2.1dna提取

真菌土壤样品dna提取使用凯杰公司的dnaisolationkit(货号为：12888-50)进行dna提取

取表1所列真菌土壤样品约300mg(野外采集的土壤样品)，转入powerbeadtubesprovided研磨管(加入土壤样品前加入60μlc1溶液)中，轻轻混匀；70℃孵育5min，涡旋3～4s，然后70℃孵育5min，涡旋3～4s，最后70℃孵育5min；使用tissueprep研磨仪器速度为4，研磨10min，1000g离心30s；取上清液加入250μl的c2到2ml的离心管中混匀5s，4℃孵育5min，1000g离心1min；取600μl的上清液和200μlc3到2ml的离心管中混匀，4℃孵育5min，1000g离心1min；取新的2ml的离心管加入1200μl的c4和750μl的上清液混匀，每次取675μl的混合溶液到mbspincolumn中1000g离心30s，倒掉离心管中液体，重复2次，直到所有混合液全部转入mbspincolumn中为止，倒掉离心管中所有液体；加入500μl的c5，1000g离心30s，倒掉倒掉离心管中液体，1000g离心1min；将mbspincolumn放入新的2ml的离心管中，加入100μlc6到白色过滤膜上，1000g离心30s，收集液体放到-20℃备用(所得的液体为土壤真菌dna混合液体)。

2.2特异性引物设计

根据变异区设计红汁乳菇(lactariushatsudake)特异性引物如下：

tb1：5’-atgaagaacgcagcgaaatg-3’(seqidno.2)

tb2：5’-aggatcggcaaagaggacc-3’(seqidno.3)。

2.3pcr以及琼脂糖凝胶电泳

以上述土壤样品dna为模板，用特异性引物tb1、tb2进行pcr反应，扩增反应体系为金牌mix(昆明硕擎生物科技有限公司)22.5μl，tb11μl，tb21μl，土壤样品dna3μl。扩增条件为：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。取2μlpcr产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，genefinder^tm染色，紫外透射仪检测，结果见图1。只有红汁乳菇扩增出230bp大小的片段，而青头菌没有扩增出条带。这说明本发明提供的特异性dna片段能够区分出与红汁乳菇近源种的青头菌，实现近源菌的鉴定。

实施例2

1.材料采集

牛肝菌、青头菌和铜绿菌子实体样品为云南昆明市的云南木水花野生菌市场购买所得(如表2)。

表2材料采集信息一览表

2方法

2.1dna提取

真菌子实体样品用ctab法进行提取

取表2所列真菌子实体样品0.5g，放入含有200μlctab溶液的2ml的离心管中，加入1颗研磨珠，放入研磨仪中研磨，直至研磨完全，再补入400μlctab；将离心管在65℃下水浴1h，期间每20min混匀1次；在离心管中加入氯仿和tris饱和酚各500μl，13000rpm离心10min；取上清液至新的1.5ml离心管中，重复上一步骤，直到上清液澄清；将上清液移至1.5ml离心管中，加入0.6倍体积-20℃预冷的异丙醇中，混匀后，-20℃放置30min以上。之后13000rpm离心10min，弃上清液；加入1ml70％的乙醇，混匀13000rpm离心1min，弃上清。重复此步骤1次。置于室温完全风干；用20μlddh2o振荡溶解，-20℃保存备用。

2.2pcr以及琼脂糖凝胶电泳

以上述子实体样品dna为模板，用特异性引物tb1、tb2进行pcr反应，扩增反应体系为金牌mix(昆明硕擎生物科技有限公司)22.5μl，tb11μl，tb21μl，真菌子实体样品dna1μl。扩增条件为：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。取2μlpcr产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，genefinder^tm染色，紫外透射仪检测，结果见图2。只有红汁乳菇扩增出230bp大小的片段，而牛肝菌和青头菌没有扩增出条带。这说明本发明提供的特异性dna片段能够区分出与红汁乳菇近源种的牛肝菌和青头菌，实现近源菌的鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>云南大学

<120>一种用于红汁乳菇鉴定的特异性dna片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>230

<212>dna

<213>lactariushatsudake

<400>1

tcggcaaagaggaccccgctaattcatttaagaggagctggctctagagagacgccagca60

aaggcctccaaagtccaagcctccttcggtgtccagaagaaaaccgagaaggttgagatt120

ttcacgacactcaaacgggtgtgcccctcggaataccaaggggcgcaaggtgcgttcaaa180

gattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacgtatcgcatttcg230

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaagaacgcagcgaaatg20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aggatcggcaaagaggacc19