靶向配体的制作方法
本申请要求2016年9月2日提交的美国临时专利申请序列号62/383,221和2017年2月8日提交的美国临时专利申请序列号62/456,339的优先权，其各自内容通过引用全文纳入本文。
背景技术：
许多化合物需要被递送至特定位置(例如，期望的细胞)以具有治疗作用或可用于诊断目的。当试图在体内递送治疗性化合物时经常发生这样的情况。此外，向特定位置高效递送化合物的能力可以限制或潜在地消除可能是通过给予化合物而导致的不希望的后果(如脱靶作用)。促进诸如治疗性化合物的化合物递送至体内所需位置的一种方法是通过将化合物与靶向配体连接或连附。
可以使用靶向配体靶向的一类治疗性化合物是寡聚化合物。已经显示包括与靶核酸至少部分互补的核苷酸序列的寡聚化合物将改变体外和体内靶标的功能和活性。已经显示当递送至含有靶核酸(如mrna)的细胞时，寡聚化合物将调节靶标的表达，导致靶核酸转录或翻译的改变。在某些示例中，寡聚化合物可以通过抑制核酸靶标和/或触发靶核酸降解来减少基因表达
如果靶核酸是mrna，则表达抑制性寡聚化合物可以调节mrna靶标表达的一种机制是通过rna干扰。rna干扰是使rna或rna样分子(诸如化学修饰的rna分子)通过降解能使基因表达沉默的生物过程。该转录后基因沉默过程被认为是防止外来基因表达的进化保守型细胞保护机制。
合成的rna和rna样分子已经显示将引发体内rna干扰。例如，elbashir等.(nature2000,411,494-98)描述了通过在培养的哺乳动物细胞中导入合成的21-核苷酸rna分子的双链体诱导的rnai。可以触发rnai反应机制的合成的rna或rna样分子的类型可以包括修饰的核苷酸和/或一种或多种非磷酸二酯连接。
此外，单链rna和rna样分子还可以改变诸如靶mrna的靶核酸的表达，所述单链rna和rna样分子可以还包括修饰的核苷酸并且具有一个或多个非磷酸二酯连接。
技术实现要素：
本文公开了这样的靶向配体，所述靶向配体可以增强治疗性化合物向诸如人患者或动物的对象内特定靶位置(例如，特定器官或组织)的递送。在一些实施方式中，本文所述靶向配体可以增强表达抑制性寡聚化合物的靶向递送。在一些实施方式中，靶向配体可以增强表达抑制性寡聚化合物向肝脏的递送。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体包括下述部分、由下述部分组成或主要由下述部分组成：一个或多个靶向部分，一个或多个拴系物(tether)，一个或多个分支点基团，和一个或多个接头。适合用于本文所公开的靶向配体的接头包括“刚性的”接头，其可以赋予整个靶向配体足够的稳定性和刚性以减少一个或多个靶向配体与其连接的治疗性化合物之间潜在的相互作用。此外，适合用于本文所公开的靶向配体的“刚性”接头能够有效将靶向配体合成为亚磷酰胺化合物(本文也称之为“含亚磷酰胺的化合物”)。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体包括下述部分、由下述部分组成或主要由下述部分组成：一个或多个靶向部分，一个或多个拴系物(tether)，一个或多个具有接头替代部分的分支点基团。接头替代部分包括下述部分、由下述部分组成或主要由下述部分组成：取代的或未取代的环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基基团或其共价连接的组合，其位于分支点基团内。具有分支点基团内的接头替代部分(linkerreplacementmoiety)通过使整个靶向配体具有足够的稳定性和刚性来赋予与本文所公开的“刚性”接头相似的性质。此外，适合用于靶向配体的具有接头替代部分的分支点基团可用于有效地将靶向部分合成为亚磷酰胺化合物。
本文公开了包括式i结构、由该结构组成或基本上由该结构组成的靶向配体：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有接头替代部分的分支点基团。
本文公开了包括式ii结构、由其组成或基本上由其组成的靶向配体：
本文所公开的靶向配体可以直接或间接地连接至化合物，诸如治疗性化合物，例如，表达抑制性寡聚化合物，例如，表达抑制性寡聚化合物的3'或5'末端。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物包括一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是rnai试剂，诸如双链rnai试剂。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体连接至双链rnai试剂正义链的5'末端。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体经由磷酸酯、硫代磷酸酯或膦酸酯基团在双链rnai试剂正义链5'末端与rnai试剂连接。
本文所公开的靶向配体包括一个或多个靶向部分。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体包括n-乙酰基-半乳糖胺作为靶向部分。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体具有如下所示的结构：
本文公开了这样的组合物，其包括靶向配体和表达抑制性寡聚化合物或由其组成或主要由其组成。本文公开了包括靶向配体和rnai试剂的组合物。
在一些实施方式中，本文所公开的包括靶向配体和rnai试剂的组合物具有下式代表的结构：
本文公开了包括靶向配体的亚磷酰胺化合物。
在一些实施方式中，包括本文所公开的靶向配体的亚磷酰胺化合物具有由下式所代表的结构：
同样公开了药物组合物，其包括本文所公开的靶向配体。
本文公开了治疗将受益于化合物之给予的疾病或病症的方法，该方法包括向对象给予连接本文所公开的靶向配体的化合物。
本文公开了抑制对象中靶核酸表达的方法，该方法包括给予治疗量的连接本文所公开的靶向配体的表达抑制性寡聚化合物。
本文公开了体内递送表达抑制性寡聚化合物至肝脏的方法，包括将与本文公开的靶向配体连接的表达抑制性寡聚化合物给予对象。
本文公开了制备包括靶向配体的亚磷酰胺化合物的方法或工艺，所述方法包括(i)将接头与分支点基团共价连接，和(ii)将接头与亚磷酰胺的磷原子通过与亚磷酰胺形成试剂发生磷酰化作用(phosphytylation)而连接，从而形成亚磷酰胺化合物。
本文所用术语“连接”，当表示两个分子之间的联系时，指两个分子通过共价键连接或者两个分子经由非共价键(例如，氢键或离子键)关联。在一些示例中，在术语“连接”表示两个分子经由非共价键关联的情况中，两个不同分子之间的关联具有在生理上可接受的缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水)中小于1x10-4m(例如，小于1x10-5m，小于1x10-6m或小于1x10-7m)的kd。
本文所用术语“直接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团在没有任何间插原子或原子基团的情况下连接。本文所用术语“间接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团通过中间基团、化合物或分子(例如，连接基团)连接。除非另外指出，本文所用术语“连接”包括本文所定义的“直接连接”和“间接连接”这些术语。
本文所用“寡聚化合物”是含有10-50个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡聚化合物具有这样的核碱基序列，其与细胞内表达的靶核酸或靶基因中的编码序列至少部分互补。在一些实施方式中，在将寡聚化合物递送至表达基因的细胞后，寡聚化合物能够抑制潜在(underlying)基因的表达，并且在本文中被称为“表达抑制性寡聚化合物”。可以体外或体内抑制基因表达。“寡聚化合物”包括但不限于：寡核苷酸，单链寡核苷酸，单链反义寡核苷酸，短干扰rna(sirna)，双链rna(dsrna)，微rna(mirna)，短发夹rna(shrna)，核糖酶，干扰rna分子，和dicer酶底物。
本文所用术语“寡核苷酸”指连接的核苷的聚合物，各连接的核苷可以被独立地修饰或不被修饰。
本文所用术语“单链寡核苷酸”指具有与靶mrna至少部分互补的序列的单链寡聚化合物，其能够通过氢键在哺乳动物生理条件(或相当的体外环境)下与靶mrna杂交。在一些实施方式中，单链寡核苷酸是单链反义寡核苷酸。
本文所用“rnai试剂”指含有能够以序列特异性方式降解或抑制靶mrna的信使rna(mrna)转录本翻译的rna或rna样(例如，化学修饰的rna)寡核苷酸分子的试剂。本文所用rnai试剂可以通过rna干扰机制(即，通过与哺乳动物细胞的rna干扰通路构成机制(rna诱导的沉默复合物或risc)相互作用诱导rna干扰)操纵，或通过任何其它机制或途径起作用。尽管认为如本文所用术语rnai试剂主要通过rna干扰机制操纵，但是公开的rnai试剂并不受限于或受约束于任何特定作用途径或机制。rnai试剂包括但不限于：单链寡核苷酸，单链反义寡核苷酸，短干扰rna(sirna)，双链rna(dsrna)，微rna(mirna)，短发夹rna(shrna)，和dicer底物。本文所述的rnai试剂包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与靶向的mrna至少部分互补的链。在一些实施方式中，本文所述rnai试剂是双链的，并且包括反义链以及与反义链至少部分互补的正义链。rnai试剂可以包括修饰的核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯连接。在一些实施方式中，本文所述的rnai试剂是单链的。
本文所用术语“沉默”、“降低”、“抑制”、“下调”或“敲减”，当指代表达给定基因时，表示与还没有经这样处理的第二细胞、细胞群或组织相比，当用与本文所述靶向配体连接的寡聚化合物处理该细胞、细胞群、或组织时基因表达降低，如由从基因转录的rna的水平或从转录基因的细胞、细胞群、组织或对象中mrna翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基的水平测量。
如本文所用，术语“序列”或“核苷酸序列”表示使用标准核苷酸命名的一序列字母描述的核碱基或核苷酸的次序或顺序物。
如本文所用，并且除非另外说明，术语“互补”在用于相对于第二核苷酸序列(例如，单链反义寡核苷酸或双链rnai试剂反义链)描述第一核苷酸序列(例如，rnai试剂正义链或靶向mrna)时，表示包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(在哺乳动物生理条件(或相当的体外环境)下形成碱基对氢键)并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，并且包括天然或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，至少达到满足上述关于杂交能力要求的程度。
如本文所用，“完美互补”或“完全互补”表示第一多核苷酸的连续序列中的全部碱基(100％)将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。连续序列可包括第一或第二多核苷酸序列的全部或部分。
如本文所用，“部分互补”表示在核碱基序列的杂交对中，第一多核苷酸的连续序列中至少70％(但不是所有)的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。
如本文所用，“基本互补”表示在核碱基序列的杂交对中，第一多核苷酸的连续序列中至少85％(但不是所有)的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”可以根据双链rnai试剂的正义链和反义链之间，双链rnai试剂的反义链和靶mrna序列之间，或单链反义寡核苷酸和靶mrna序列之间的碱基配对使用。
本文所用术语“治疗”、“处理”等表示为了在对象中提供一种或多种疾病的症状数量、严重程度和/或频率的缓解或减轻而采取的方法或步骤。
如本文所用，当述及寡聚化合物时，短语“导入细胞”表示功能性递送寡聚化合物到细胞中。短语“功能性递送”表示以这样的方式将寡聚化合物递送至细胞，所述方式能够使得寡聚化合物具有所期待的生物活性，例如，对于基因表达的序列特异性抑制。
除非另外指出，本文所使用符号
本文所用术语“异构体”指具有相同的分子式但性质或其原子结合序列或其原子的空间排列不同的化合物。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不成镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，而成不可叠加镜像的异构体称为“对映异构体”或有时称为光学异构体。连接四个不相同取代基的碳原子称为“手性中心”。
如本文所用，除非在结构中特定指出具有某种构型，对于存在不对称中心并且因此产生对映体、非对映体或其它立体异构体构型的各结构，本文所公开的各结构旨在表示所有这些可能的异构体，包括其光学纯和外消旋形式。例如，本文所公开的结构旨在包括非对映体以及单一立体异构体的混合物。
本文所用术语“取代的”表示指定原子(通常是碳、氧和氮原子)上的任何一个或多个氢原子被本文所限定的任何基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物。取代基的非限制性示例包括c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素(例如，f、cl、br、i)。当取代基是酮或氧代(即，＝o)时，则原子上有两个(2个)氢被替代。本文中所用的环双键是在两个毗邻环原子之间形成的双键(例如c＝c、c＝n、n＝n等)。
本文所用开的一些化合物可以互变异构体形式存在，所述互变异构体形式也旨在包括在本发明范围内。“互变异构体”是其结构在原子排列上显著不同的化合物，但以容易且快速的平衡存在应理解理解的是，本公开的化合物可描述为不同互变异构体。还应理解，当化合物具有互变异构形式时，意图将所有互变异构形式都包括在本发明的范围内，并且所述化合物的命名不排除任何互变异构形式。
本公开的化合物或药学上可接受的盐可以一种或多种互变异构体形式存在，包括酮-烯醇、酰胺-腈、内酰胺-内酰亚胺、酰胺-酰亚氨酸互变异构体(杂环中)(例如，在核碱基鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶中)，胺-烯胺和烯胺-烯胺以及几何异构体和其混合物。通过葡萄糖和其它糖类表示的环-链互变异构性源自糖链分子中的醛基(-cho)与相同分子中的一个羟基(-oh)反应生成环(环形)形式。所有这些互变异构形式包括在本发明的范围内。互变异构体在溶液中以互变集合的混合物形式存在。在固体形式中，通常一种互变异构体占主导。尽管描述了一种互变异构体，但本公开包括本文公开的化合物的所有互变异构体。互变异构体可由互变异构化而相互转换的概念称为互变异构性。在互变异构中，电子和氢原子转移同时发生。
互变异构化通过如下方式催化：碱：1.去质子化；2.形成离域的阴离子(例如，烯醇化物)；3.在阴离子的不同位置质子化；酸：1.质子化；2.形成离域的阳离子；3.在邻近阳离子的不同位置去质子化。
除非另有说明，本文所用术语“烷基”指具有1-10个碳原子的支链或直链的饱和的脂肪族烃基。例如，在“c1-c6烷基”包括具有以直链或支链排列的1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。如本文中所用，术语“氨基烷基”指上文所定义的烷基，如正常化合价所允许，在任意位置被一个或多个胺基取代。氨基可以是未取代的、单基取代的或双基取代的。
除非另有说明，本文所用术语“环烷基”指具有3-14个碳原子的饱和或不饱和的非芳香族烃环基。环烷基的示例包括但不限于，环丙基、甲基-环丙基、2,2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基、环己基等。环烷基可包括多个螺旋环或稠环。环烷基在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
除非另有说明，术语“烯基”指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少一个碳-碳双键，并且具有2-10个碳原子。在这样的基团中可以存在多达5个碳-碳双键。例如，“c2-c6”烯基被定义为具有2-6个碳原子的烯基。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。烯基的直链、支链或环状部分可以含有双键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。术语“环烯基”表示具有特定数量的碳原子和至少一个碳-碳双键的单环烃基。
除非另有说明，术语“炔基”指直链或支链的烃基，其含有2-10个碳原子并且含有至少一个碳-碳三键。可以存在多达5个碳-碳三键。因此，“c2-c6炔基”表示具有2-6个碳原子的烯基。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。炔基的直链、支链部分可以含有正常化合价所允许的三键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
本文所用术语“烷氧基”表示如上所定义的烷基具有通过氧桥连接的所示数量的碳原子。c1–6烷氧基意在包括c1、c2、c3、c4、c5和c6烷氧基。c1-8烷氧基意在包括c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8烷氧基。烷氧基的示例包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、仲戊氧基、正庚氧基和正辛氧基。
本文所用“酮”指代本文所述通过羰基桥连接的任何烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基或芳基。酮基的示例包括但不限于：烷酰基(例如，乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基)，烯酰基(例如，丙烯酰基)炔酰基(例如，乙炔酰基，丙炔酰基，丁炔酰基，戊炔酰基，己炔酰基)，芳酰基(例如，苯甲酰基)，杂芳酰基(例如，吡咯酰基，咪唑酰基，喹啉酰基，吡啶酰基)。
本文所用“烷氧基羰基”指通过羰基桥连接的上述定义的任何烷氧基(即，-c(o)o-烷基)。烷氧基羰基的示例包括但不限于：甲氧基羰基，乙氧基羰基，异丙氧基羰基，正丙氧基羰基，叔丁氧基羰基，苄氧基羰基或正戊氧基羰基。。
本文所用“芳氧基羰基”指通过氧羰基桥连接的上述定义的任何芳基(即，-c(o)o-芳基)。芳氧基羰基的例子包括但不限于：苯氧基羰基和萘氧基羰基。
本文所用“杂芳氧基羰基”指通过氧基羰基桥连接的上述定义的任何杂芳基(即，-c(o)o-杂芳基)。杂芳基氧基羰基的示例包括但不限于：2-吡啶氧基羰基，2-噁唑基氧基羰基，4-噻唑基氧基羰基或嘧啶基氧基羰基。
本文所用的“芳基”或“芳族”指任何稳定的单环或多环碳环，每个环上至多有7个原子，其中至少一个环是芳族的。芳基的示例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、四氢萘基、茚满基和联苯基。在芳基取代基是双环并且一个环是非芳香族的情况中，应理解，连接经由芳环进行。芳基在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
本文所用术语“杂芳基”表示稳定的单环或多环，每个环上至多有7个原子，其中至少一个环是芳族并且含有选自o、n和s的1-4个杂原子。杂芳基的示例包括但不限于：吖啶基，咔唑基，噌啉基，喹喔啉基，吡唑基，吲哚基，苯并三唑基，呋喃基，噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，苯并咪唑啉基，苯并噁唑啉基，喹啉基，异喹啉基，二氢异吲哚基，咪唑并吡啶基，异吲哚基，吲唑基，噁唑基，噁二唑基，异噁唑基，吲哚基，吡嗪基，哒嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯基，四氢喹啉。“杂芳基”也理解为包含任何含氮杂芳基的n氧化物衍生物。在杂芳基取代基是双环并且一个环是非芳香族或不含杂原子的情况中，应当理解的是连接是经由芳环或经由含有杂原子的环进行。杂芳基在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
本文所用术语“杂环”、“杂环的”或“杂环基”指3-14元芳族或非芳族杂环，其含有选自o、n和s的1-4个杂原子，包括多环基团。本文所用术语“杂环的”也被认为是术语“杂环”和“杂环基”的同义词，并且也被理解为具有本文所定义的定义。“杂环基”包括其上述及的杂芳基，以及其二氢和四氢类似物。杂环的示例包括但不限于：氮杂环丁烷基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋呫基(benzofurazanyl)、苯并吡唑基、苯并三唑基，苯并苯硫基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲哚并吖嗪基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘并吡啶基(naphthpyridinyl)、噁二唑基、氧代噁唑烷基、噁唑基、噁唑啉、氧代哌嗪基、氧代吡咯烷基、氧代吗啉基、异噁唑啉、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、哒嗪基、吡啶基、吡啶酮基、嘧啶基、嘧啶酮基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻喃基、四氢异喹啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、1,4-二噁烷基、六氢氮呯基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基(onyl)、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基，二氢噁唑基，二氢吡嗪基、二氢吡唑基，二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、二氧噻吩吗啉基、亚甲基二氧代苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基，及其n-氧化物。通过碳原子或杂原子连接杂环取代基。杂环基在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
取决于化合物或组合物所处的环境，本领域普通技术人员将容易地理解和意识到本文所公开的化合物和组合物可以具有处于质子化或去质子化状态的某些原子(例如，n、o或s原子)。因此，如本文所用，可以考虑将本文所公开的结构的某些官能团，诸如oh、sh或nh质子化或去质子化。如本领域普通技术人员容易理解的，本文所公开的内容旨在涵盖公开的化合物和组合物，与其基于环境的ph的质子化状态无关。
本文权利要求中所用短语“由......组成”排除未在权利要求中指定的任何要素，步骤或成分。当用于本文权利要求中时，短语“基本由……组成”将权利要求的范围限制到指定的物质或步骤以及要求保护的发明的本质上不影响基本和新特征的那些。
除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
从下文的详述和所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1是化合物11的1hnmr谱图(下述实施例1中对其进行描述，并且其具有本文所述结构1005b的化学结构)。
图1a是本文中结构1004b的1hnmr谱图(下述实施例1对其进行描述)。
图2是化合物19的31pnmr谱图(下述实施例2对其进行描述，并且其具有本文所述结构1008b的化学结构)。
图2a是化合物19的1hnmr谱图。
图2b是化合物14的1hnmr谱图(下述实施例2对其进行描述)。
图2c是化合物15的1hnmr谱图(下述实施例2对其进行描述)。
图2d是化合物16的1hnmr谱图(下述实施例2对其进行描述)。
图2e是化合物17的1hnmr谱图(下述实施例2对其进行描述)。
图2f是化合物18的1hnmr谱图(下述实施例2对其进行描述)。
图3是化合物30的1hnmr谱图(下述实施例3对其进行描述)。
图4是化合物38的1hnmr谱图(下述实施例4对其进行描述)。
图5是化合物44的5hnmr谱图(下述实施例5对其进行描述)。
图6是化合物47的1hnmr谱图(下述实施例6对其进行描述)。
图7是瓶中含peg接头-galnac亚磷酰胺的化合物的照片(下述实施例7对其进行描述)。
图8是瓶中含结构1008b亚磷酰胺的化合物的照片(下述实施例7对其进行描述)。
图9是peg接头-galnac结构的31pnmr谱图(下述实施例8对其进行描述)。
图10是显示野生型小鼠中标准化的小鼠因子12(mf12)蛋白质水平的图表(下述实施例11对其进行描述)。
图11是显示野生型小鼠中标准化的小鼠因子12(f12)蛋白质水平的图表(下述实施例12对其进行描述)。
图12是显示lp(a)转基因(tg)小鼠中标准化的脂蛋白(a)(lp(a))颗粒水平的图表(下述实施例13对其进行描述)。
图13是显示apo(a)转基因(tg)小鼠中标准化的apo(a)水平的图表(下述实施例14对其进行描述)。
图14是显示lp(a)tg小鼠中标准化的lp(a)颗粒水平的图表(下述实施例15对其进行描述)。
图15是显示野生型小鼠中标准化的小鼠f12蛋白质水平的图表(下述实施例16对其进行描述)。
图16是显示lp(a)tg小鼠中标准化的lp(a)颗粒水平的图表(下述实施例17对其进行描述)。
图17是显示apo(a)tg小鼠中标准化的apo(a)水平的图表(下述实施例18对其进行描述)。
图18是显示lp(a)tg小鼠中标准化的lp(a)颗粒水平的图表(下述实施例19对其进行描述)。
图19是显示食蟹猴中标准化的lp(a)颗粒水平的图表(下述实施例20对其进行描述)。
图20是显示食蟹猴中标准化的cf12蛋白质水平的图表(下述实施例21对其进行描述)。
图21是显示piz转基因小鼠中标准化的aat(z-aat)蛋白质水平的图表(下述实施例22对其进行描述)。
具体实施方式
本文描述了连接至化合物(诸如治疗性或诊断性化合物)的靶向配体。在一些实施方式中，连接本文所述的靶向配体的化合物包括或由治疗性化合物(诸如表达抑制性寡聚化合物)组成。靶向配体可以用于使治疗性化合物靶向靶核酸或靶基因的期望位置。本文还描述了包括靶向配体和治疗性化合物的组合物，诸如包括或由靶向配体和表达抑制性寡聚化合物组成的组合物。
本文所述的新型靶向配体提供了优于之前已知的靶向配体的对于促进治疗性化合物的递送的优势。这些优势包括例如，改善制备的简易性和效率，并且同时提供有效的靶向或生物分布，体内和/或体外足够的稳定性，和/或寡核苷酸治疗性产品递送所需的其它改善。该新的靶向配体特别适用于合成亚磷酰胺化合物，其降低制备的成本和负担，并且促进靶向配体与化合物(特别是表达抑制性寡聚化合物(诸如rnai试剂))的方便连接，同时提供相似的或(在一些情况中)改善的治疗性化合物递送和/或功效。
靶向配体
靶向配体由一个或多个靶向基团或靶向部分组成，其可以用于增强与其连接的化合物的药代动力学或生物分布特性，并且改善偶联的组合物的细胞特异性摄取以及细胞或组织特异性分布。总之，靶向配体协助引导将与其连接的治疗性化合物递送至所需靶位置。在一些情况中，靶向部分可以结合细胞或细胞受体，并且启动内吞作用以促进治疗性化合物进入细胞。靶向部分可以包括对细胞受体或细胞表面分子或抗体具有亲和性的化合物。含有靶向部分的各种靶向配体可以与治疗性试剂和其它化合物连接以将试剂靶向细胞和特定细胞受体。靶向部分的类型包括碳水化合物、胆固醇和胆甾醇基团或类固醇。可以结合细胞受体的靶向部分包括糖类，诸如半乳糖、半乳糖衍生物(如n-乙酰基-半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物)；其它碳水化合物；聚糖；半抗原；维生素；叶酸；生物素；适体；和肽，诸如含rgd的肽、胰岛素、egf和转铁蛋白。
已知结合脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)的靶向部分可特别用于引导递送寡聚化合物至肝脏。脱唾液酸糖蛋白受体在肝脏细胞(肝细胞)上大量表达。靶向ascpr的细胞受体靶向部分包括半乳糖和半乳糖衍生物。具体而言，半乳糖衍生物的簇，包括由2、3或4个n-乙酰基-半乳糖胺(galnac或nag)组成的簇可以促进肝细胞中某些化合物的摄取。偶联寡聚化合物的galnac簇用于引导组合物至肝脏，在这里n-乙酰基-半乳糖胺糖能够结合肝脏细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体。脱唾液酸糖蛋白受体的结合被认为将启动受体介导的内吞作用，从而促进化合物进入细胞内部。
本文所公开的靶向配体可以包括1、2、3、4或超过4个靶向部分。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体可以包括1、2、3、4或超过4个连接分支点基团的靶向部分。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体可以包括连接分支点基团的1、2、3、4或超过4个靶向部分，其中各靶向部分经由拴系物与连接分支点连接。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体可以包括连接分支点基团的1、2、3、4或超过4个脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)靶向部分。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体可以包括连接分支点基团的1、2、3、4或超过4个asgpr靶向部分，其中各asgpr靶向部分经由拴系物与连接分支点连接。
在一些实施方式中，分支点基团连接至接头。在一些实施方式中，分支点基团包括接头替代部分，并且分支点基团连接至治疗性化合物。在一些实施方式中，分支点基团连接至寡聚化合物。在一些实施方式中，分支点基团连接至表达抑制性寡聚化合物。
在一些实施方式中，靶向配体由下述式i表示：
式i的接头是这样的基团，其包括选自下述的一个或多个取代的或未取代的部分：环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基基团或其共价连接的组合，其将接头一端上的分支点基团连结至接头上另一端上的治疗性化合物(或当靶向配体作为亚磷酰胺化合物合成时，至亚磷酰胺的磷原子)。在一些实施方式中，一个或多个其它基团，如可切割部分(如磷酸基团或含有二硫键的基团)或形成硫代磷酸酯或膦酸酯连接的基团被插入治疗性化合物和接头之间。接头是“刚性的”，因此它们将赋予整个靶向配体稳定性和刚性，以减少式i靶向部分与其连接的治疗性化合物之间的相互作用。因此，这样可以改善靶向部分与靶位点的相互作用。此外，用于本文所公开的靶向配体的接头经特别设计，用于将靶向配体合成为亚磷酰胺化合物，其能够实现靶向配体与寡聚化合物5'末端的高效连接。
式i的分支点基团是这样的任何基团，其能够使得一个或多个靶向部分(经由一个或多个拴系物)与接头连接。
在一些实施方式中，靶向配体由下述式ii表示：
在式ii中，分支点基团是任何这样的基团，其能够使得一个或多个靶向部分(经一个或多个拴系物)经由接头替代部分连接至治疗性化合物(或当靶向配体作为亚磷酰胺化合物合成时，连接至亚磷酰胺的磷原子)。如本文所用，当分支点基团包括一个或多个取代的或未取代的环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基基团或其组合时(包括在分支点基团内的稠合形式(fused))，分支点基团包括接头替代部分，其具有与本文所公开的式i的刚性接头相同的功能。
一个或多个式i和ii拴系物是作为间隔子的基团，其可以进一步增加靶向部分与分支点基团之间的连接的柔韧性和/或长度。拴系物提供了将靶向部分连结至分支点基团的高效方式。对于本文所公开的靶向配体，对于每各靶向部分，存在至少一个拴系物。在一些实施方式中，分支点基团和靶向部分之间存在多个(即两个或更多个)拴系物。
式i和式ii靶向部分是这样的基团，其用于增强与其连接的治疗性化合物的药代动力学或生物分布特性，并且改善偶联的组合物的细胞特异性摄取以及细胞或组织特异性分布。靶向部分可以包括对细胞受体或细胞表面分子或抗体具有亲和性的化合物。靶向部分的类型包括碳水化合物、胆固醇和胆甾醇基团或类固醇。可以结合细胞受体的靶向部分包括糖类，诸如半乳糖、半乳糖衍生物(如n-乙酰基-半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物)；其它碳水化合物；聚糖；半抗原；维生素；叶酸；生物素；适体；和肽，诸如含rgd的肽、胰岛素、egf和转铁蛋白。
本文所公开的靶向配体可以连接至治疗性化合物。在一些实施方式中，靶向配体经由其它接头和/或可切割部分与治疗性化合物连接，该其它接头和/或可切割部分再连接至治疗性化合物。在一些实施方式中，靶向配体与治疗性化合物本身接连。
在一些实施方式中，治疗性化合物是寡聚化合物。在一些实施方式中，治疗性化合物是表达抑制性寡聚化合物。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是rnai试剂。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是双链rnai试剂。
在一些实施方式中，靶向配体直接或间接地连接至双链rnai试剂正义链的5'端。在一些实施方式中，靶向配体直接或间接地连接至双链rnai试剂正义链的3'端。在一些实施方式中，靶向配体直接或间接地连接至双链rnai试剂反义链的3'端或5'端。在一些实施方式中，靶向配体直接或间接地连接至单链rnai试剂的3'端或5'端。
在一些实施方式中，靶向配体经由磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯或其它核苷间连接基团在双链rnai试剂正义链末端核苷的5'端与双链rnai试剂连接。
在一些实施方式中，本文公开的靶向配体包括可切割部分。在一些实施方式中，可切割部分包括或由可以被切割的磷酸酯或其它核苷间连接基团组成。在一些实施方式中，靶向配体经由可切割部分与治疗性化合物连接。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体与包括可切割部分的一个或多个其它基团连接。在一些实施方式中，靶向配体连接至可切割部分，该可切割部分再连接至表达抑制性寡聚化合物。
在一些实施方式中，靶向配体是含亚磷酰胺的化合物。使用本领域一般知晓的亚磷酰胺合成方法，包括本文所述靶向配体的亚磷酰胺化合物可用于将靶向配体容易地连接至治疗性化合物或其它基团。在一些实施方式中，包括靶向配体的亚磷酰胺化合物使用本领域熟知的方法与表达抑制性寡聚化合物连接。在一些实施方式中，含有靶向配体的亚磷酰胺连接至双链rnai试剂正义链的5'端。
在一些实施方式中，连接靶向配体的表达抑制性寡聚化合物包括单链寡核苷酸。在一些实施方式中，单链寡核苷酸是单链反义寡核苷酸。在一些实施方式中，靶向配体与单链反义寡核苷酸直接连接。在一些实施方式中，将其它基团插入靶向配体和单链寡核苷酸之间。
在一些实施方式中，连接rnai试剂的靶向配体包括一个或多个n-乙酰基-半乳糖胺糖作为一个或多个靶向部分。
在一些实施方式中，连接表达抑制性寡聚化合物的靶向配体包括拴系物，所述拴系物包括聚乙二醇(peg)。在一些实施方式中，拴系物由peg组成。在一些实施方式中，拴系物包括具有1-10个乙二醇单元的peg。在一些实施方式中，拴系物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元的peg。
在一些实施方式中，连接本文所公开的任何靶向配体的表达抑制性寡聚化合物包括rnai试剂。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体直接或间接地与rnai试剂连接。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体直接或间接地连接至rnai试剂。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体间接地连接至rnai试剂，因为其它基团被插入rnai试剂和靶向配体的接头之间。在一些实施方式中，接头和治疗性化合物之间包括第二接头。
接头
本文所公开的靶向配体包括如式i所示的接头，或者，连接点基团包括如式ii所示的接头替代部分。
接头是这样的原子团，其一端连接至分支点基团，而另一端连接至治疗性化合物(或当靶向配体作为亚磷酰胺化合物合成时，至亚磷酰胺的磷原子)。在一些实施方式中，接头一端连接至分支点基团，而另一端接连一个或多个基团，该一个或多个基团再与表达抑制性寡聚化合物接连。在一些实施方式中，接头直接连接至寡聚化合物。在一些实施方式中，接头连接至可切割部分，该可切割部分再连接至表达寡聚化合物。可切割部分的示例包括例如磷酸酯基团，包括二硫化物部分的基团，和/或可以被切割的其它核苷间连接。在一些实施方式中，接头不连接至可切割部分。在一些实施方式中，接头连接至硫代磷酸酯或膦酸酯基团。
对于根据式i的本文所公开的靶向配体，接头是“刚性的”接头。刚性接头是这样的连接基团，其包括一个或多个取代的或未取代的环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基基团或其共价连接的组合。
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，式i的靶向配体包括或由具有如下所示结构的接头组成：
在一些实施方式中，适合用于本文所公开的靶向配体的接头由这样的化合物生成，所述化合物包括刚性结构，所述刚性结构的一端具有末端羧酸部分(或其活化酯)，而另一端具有末端醇部分。在一些实施方式中，醇部分是仲醇。在一些实施方式中，醇部分是叔醇。在一些实施方式中，醇部分是伯醇。羧酸部分(或其活化酯)适合与分支点基团的连接，而醇部分适合通过采用亚磷酰胺形成试剂的磷酰化反应(phosphitylation)与亚磷酰胺磷原子连接。适用亚磷酰胺形成试剂的示例性磷酰化反应在本文的实施例中描述。本文所公开的接头结构适合用于将靶向配体制备为亚磷酰胺化合物。
在一些实施方式中，接头与表达抑制性寡聚化合物连接，所述表达抑制性寡聚化合物是双链rnai试剂。在一些实施方式中，接头连接至双链rnai试剂正义链的5'端。在一些实施方式中，接头连接至双链rnai试剂正义链的3'端。在一些实施方式中，接头连接至双链rnai试剂反义链的3'端。在一些实施方式中，接头连接至双链rnai试剂反义链的5'端。
在一些实施方式中，接头连接至可切割部分。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物的末端磷酸酯基团可以作为可切割部分。在一些实施方式中，独立选择的可切割部分与接头连接。如本文所用，可切割部分是细胞外稳定的基团，但是在进入靶细胞后被切割。可切割部分在某些条件下(诸如ph，或某些切割试剂，诸如促进降解的分子或氧化还原剂)容易被切割。
在一些实施方式中，可切割部分易受ph的影响。例如，已知核内体和溶酶体通常具有比人血(ph约为7.35-7.45)更酸性的ph(ph约为4.5-6.5)，而这样可以促进可切割部分的切割。
在一些实施方式中，可切割部分是磷酸酯基团。磷酸酯基团可以被已知降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体含有包括接头替代基团的分支点基团，而不是接头，如式ii所示。当接头被接头替代部分替代时，接头替代部分是分支点基团的部分。
在一些实施方式中，本文所公开的接头和接头替代部分允许靶向配体的仅单个异构体的纳入，而这可以为寡核苷酸治疗性产品提供额外优势。
分支点基团
本文所公开的靶向配体包括至少一个分支点基团。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体的分支点基团连接至接头。在一些实施方式中，分支点基团在一端连接至接头，且分支点基团在一个或多个另一端连接至一个或多个拴系物。在一些实施方式中，分支点基团经由一个或多个其它基团与表达抑制性寡聚化合物连接。在一些实施方式中，分支点基团包括接头替代部分，并且连接至表达抑制性寡聚化合物。
本文所公开的分支点基团可以是任何基团，其允许一个或多个靶向部分的连接，并且进一步允许连接至本文所公开的接头，或者，如果分支点基团包括接头替代部分，则分支点基团可以是包括接头替代部分的任何基团，所述接头替代部分允许连接至治疗性化合物，如表达抑制性寡聚化合物。
对于本文所公开的式i的分支点基团，在与接头偶联之前，用于生成分支点基团的分支点基团化合物具有针对与接头的各所需连接的一个末端胺，以及针对与拴系物的各所需连接的一个末端羧酸部分(或其活化酯)。
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的分支点基团：
在一些实施方式中，靶向配体包括分支点基团，其包括接头替代基团。
在一些实施方式中，靶向配体包括分支点基团，其包括具有如下所示结构的接头替代部分：
拴系物(tether)
本文所公开的靶向配体包括一个或多个拴系物。拴系物在分支点基团和各靶向部分之间连接。在一些实施方式中，拴系物的一端直接连接至靶向配体，而另一端直接连接至分支点基团。在一些实施方式中，拴系物的一端直接连接至靶向配体，而另一端间接地连接至分支点基团。在一些实施方式中，拴系物的一端间接地连接至靶向配体，而另一端间接地连接至分支点基团。在一些实施方式中，本文公开的靶向配体包括3个拴系物和3个靶向部分。在一些实施方式中，本文公开的靶向配体包括4个拴系物和4个靶向部分。在一些实施方式中，本文公开的靶向配体包括1个拴系物和1个靶向部分。在一些实施方式中，本文公开的靶向配体包括多个拴系物和多个靶向部分。
在一些实施方式中，在拴系物和式i或式ii靶向部分之间插入其它拴系物或其它基团。在一些实施方式中，在拴系物和式i或式ii靶向部分之间插入第二拴系物。在一些实施方式中，在拴系物和式i或式ii靶向部分之间插入第二拴系物和第三拴系物。在一些实施方式中，在拴系物和式i或式ii靶向部分之间插入第二、第三和第四拴系物。如本文所公开，对于每各靶向部分，存在至少一个拴系物。在一些实施方式中，对于各靶向部分，存在多于一个拴系物。本文所公开的靶向配体旨在涵盖这些组合物。
在一些实施方式中，可将其它基团插入式i或式ii的分支点基团和拴系物之间。
如本文所公开，拴系物作为间隔子起作用，其可以进一步向靶向部分与分支点基团之间的连接部分、接头和治疗性化合物添加柔韧性和/或长度。在一些实施方式中，拴系物包括烷基(包括环烷基)、烯基(包括环烯基)、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基或芳炔基。在一些实施方式中，拴系物包括一个或多个杂原子、杂环、杂芳基、氨基酸、核苷酸或糖。
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有下述结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括具有如下所示结构的拴系物：
在一些实施方式中，靶向配体包括多于一种类型的拴系物。在一些实施方式中，拴系物作为柔性亲水性间隔子起作用(参见，例如u.s.5,885,968；和biessen等.j.med.chem.1995,39,1538-1546，两者都通过引用其全部内容将其纳入本文)，并且包括peg间隔子。在其它实施方式中，peg间隔子具有1-20个乙烯单元(peg1-peg20)。例如，peg间隔子具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个乙烯单元。
靶向部分
本文所公开的靶向配体可以包括1-4或多于4个靶向部分。
在一些实施方式中，靶向配体可以是半乳糖簇。本文所用的半乳糖簇包括具有2-4个末端半乳糖衍生物的靶向配体。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或大于半乳糖对其亲和性的半乳糖衍生物。半乳糖衍生物是一种糖，其为一种类型的靶向部分。末端半乳糖衍生物通过糖的c-1碳连接至拴系物。
在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(诸如n-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对唾液酸糖蛋白受体均具有亲和性。在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端n-乙酰基-半乳糖胺(galnac或nag)作为靶向部分。例如，结构1001、1002、1004和1008各自是靶向配体，其具有作为靶向部分的3个末端n-乙酰基-半乳糖胺。
在一些实施方式中，各靶向部分包括是n-乙酰基-半乳糖胺的半乳糖胺衍生物。可用作靶向部分且对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的其他糖可选自列表，包括：半乳糖、半乳糖胺、n-甲酰基-半乳糖胺、n-丙酰基-半乳糖胺、n-正丁酰基-半乳糖胺和n-异丁酰基-半乳糖胺。大量半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性已被研究(参见例如:iobst,s.t.和drickamer,k.j.b.c.1996,271,6686，通过引用将其全部内容纳入本本文)或用熟知和本领域常用的方法容易地确定。
在一些实施方式中，靶向部分是靶向细胞的部分。
在一些实施方式中，靶向部分包括n-乙酰基-半乳糖胺：
在一些实施方式中，靶向配体包括3个靶向部分。在一些实施方式中，靶向配体包括4个靶向部分。在一些实施方式中，靶向配体包括1个靶向部分。在一些实施方式中，靶向配体包括2个靶向部分。在一些实施方式中，靶向配体包括4个或更多个靶向部分。
在一些实施方式中，靶向部分包括半乳糖、半乳糖胺、n-甲酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-半乳糖胺、n-丙酰基-半乳糖胺、n-正丁酰基半乳糖胺或n-异丁酰基半乳糖中的一种或多种。
例如，在一些实施方式中，结构1001至1027中任一结构的n-乙酰基-半乳糖胺靶向部分可被替代性靶向部分替代。这类替代性靶向部分包括，例如，半乳糖、半乳糖胺、n-甲酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-半乳糖胺、n-丙酰基-半乳糖胺、n-正丁酰基-半乳糖胺或n-异丁酰基-半乳糖胺。
此外，在一些实施方式中，结构1001至1027的靶向部分可被例如下述所替代：碳水化合物；聚糖；半抗原；维生素；叶酸；生物素；适体；和/或肽，如含rgd的肽，胰岛素，egf，和/或转铁蛋白。
在一些实施方式中，靶向配体是n-乙酰基-半乳糖胺三聚体的形式。在一些实施方式中，靶向配体是n-乙酰基-半乳糖胺四聚体的形式。
代表性靶向配体结构，以及包括靶向配体的亚磷酰胺化合物
本文所公开的靶向配体可以包括一个或多个靶向部分、拴系物、分支点基团和接头。本文所公开的靶向配体可由1、2、3、4或超过4个靶向部分组成。
在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体被合成为亚磷酰胺化合物的形式。亚磷酰胺广泛地用于rna和dna的化合物合成。在一些实施方式中，本文所公开的含有亚磷酰胺的靶向配体被添加至双链rnai试剂正义链的5'端。当靶向配体待连接至表达抑制性寡聚化合物5'末端时，将靶向配体制备成亚磷酰胺可能是非常有利的。不希望受制于理论，可以理解的是当靶向配体连接至表达抑制性寡聚化合物5'末端时，将靶向配体制备成亚磷酰胺允许靶向配体作为最末组成部分的连接(因此降低制造成本)，而且还在靶向配体连接至双链rnai试剂正义链5'末端时可能地允许靶向配体限制正义链向risc的加载。在表达抑制性寡聚化合物是双链rnai试剂时，当靶向配体待连接至rnai试剂正义链5'末端时，可以将靶向配体制备成亚磷酰胺化合物。
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且包括如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物连接至靶向配体，并且具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
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在如本文所公开的一些实施方式中，靶向配体的接头可不存在，只要分支点基团包括至少一个芳基、环烷基和/或杂环基团即可。具有位于分支点基团内的一个或多个芳基、环烷基和/或杂环基团作为接头替代基团发挥作用。在一些实施方式中，分支点基团内的一个或多个芳基、环烷基和/或杂环基位于表达抑制性寡聚化合物和分支点基团的一个或多个中央联结点之间。
在一些实施方式中，靶向配体具有如下所示的结构：
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在一些实施方式中，靶向配体是含有亚磷酰胺的化合物，其具有如下所示的结构：
在一些实施方式中，靶向配体是半乳糖簇的形式。本文所用的半乳糖簇包括具有2-4个末端半乳糖衍生物的靶向配体。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或大于半乳糖对它的亲和性的半乳糖的衍生物。半乳糖衍生物是一种糖，其为一种类型的靶向部分。末端半乳糖衍生物可以通过糖的c-1碳连接至拴系物。
在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(诸如n-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对唾液酸糖蛋白受体均具有亲和性。在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端n-乙酰基-半乳糖胺(galnac或nag)作为靶向部分。
在一些实施方式中，靶向配体包括4个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(诸如n-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对脱唾液酸糖蛋白受体均具有亲和性。一些实施方式中，靶向配体包括4个末端n-乙酰基-半乳糖胺(galnac或nag)作为靶向部分。
在一些实施方式中，各靶向部分包括半乳糖胺衍生物，其为n-乙酰基-半乳糖胺。可用作靶向部分且对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的其他糖可选自含有以下的列表：半乳糖、半乳糖胺、n-甲酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-半乳糖胺、n-丙酰基-半乳糖胺、n-正丁酰基-半乳糖胺和n-异丁酰基-半乳糖胺。大量半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和性已经被研究(参见例如:iobst,s.t.和drickamer,k.j.b.c.1996,271,6686)或用熟知和本领域常用的方法容易地确定。
当述及3个末端n-乙酰基-半乳糖胺时本领域常用的术语包括三触角(tri-antennary)、三价物(tri-valent)和三聚体。
当述及4个末端n-乙酰基-半乳糖胺时本领域常用的术语包括四触角(tetra-antennary)、四价物(tetra-valent)和四聚体。
寡聚化合物
本文所公开的靶向配体可以连接至寡聚化合物。在一些实施方式中，寡聚化合物是表达抑制性寡聚化合物。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是rnai试剂。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是双链rnai试剂。在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是单链寡核苷酸。表达抑制性寡聚化合物可以使用本领域常规方法合成。
表达抑制性寡聚化合物可以包括一个或多个修饰的核苷酸。核苷酸碱基(或核碱基)是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其是所有核酸的组分并且包括腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿嘧啶(u)。如本文所用，术语核苷酸摂可包括修饰的核苷酸或核苷酸模拟物、脱碱基位点、或替代部分。如本文中所用，“修饰的核苷酸”是不同于核糖核苷酸(2'-羟基核苷酸)的核苷酸、核苷酸模拟物、无碱基位点、或替代取代部分。在一些实施方式中，修饰的核苷酸包括2'-修饰的核苷酸(即，核苷酸在五元糖环的2'位置具有除羟基外的基团)。修饰的核苷酸包括但不限于：2′-修饰的核苷酸，2′-o-甲基核苷酸(本文表示为核苷酸序列中的小写字母“n”)，2′-脱氧-2′-氟核苷酸(本文表示为nf，本文也表示为2′-氟核苷酸)，2′-脱氧核苷酸(本文表示为dn)，2′-甲氧基乙基(2′-o-2-甲氧基乙基)核苷酸(本文表示为nm或2′-moe)，2′-氨基核苷酸，2′-烷基核苷酸，3′至3′连接(反向)核苷酸(本文表示为invdn、invn、invn、invx)，包括非天然碱基的核苷酸，锁定的核苷酸，桥接核苷酸，肽核酸，2′,3′-开环核苷酸模拟物(未锁定核碱基类似物，本文表示为nuna或nuna)，锁定核苷酸(本文表示为nlna或nlna)，3′-o-甲氧基(2′核苷酸间连接的)核苷酸(本文表示为3′-omen)，2'-f-阿拉伯核苷酸(本文表示为nfana或nfana)，吗啉代核苷酸，乙烯基膦酸脱氧核糖核苷酸(本文表示为vpdn)，乙烯基膦酸核苷酸，和脱碱基核苷酸(本文表示为x或ab)。不需要对给定化合物中的所有位置进行统一的修饰。相反地，可将多于一个的修饰纳入单个表达抑制性寡聚化合物或者甚至是其单个核苷酸中。表达抑制性寡聚化合物可以通过本领域已知的方法合成和/或修饰。在每个核苷酸上的修饰独立于其他核苷酸的修饰。
修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，如：5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，n-2、n-6和o-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤)，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基的衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫胸腺嘧啶，2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶，6-偶氮基胞嘧啶，6-偶氮基胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫脲嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶(例如，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶和5-溴胞嘧啶)、5-三氟甲基尿嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶)，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)，7-去氮腺嘌呤(7-deazaadenine)，3-去氮鸟嘌呤，和3-去氮腺嘌呤。
对于本文所述的表达抑制性寡聚化合物，任何修饰的核苷酸可以通过含磷酸酯的或不含磷酸酯的共价核苷间连接而连接。修饰的核苷间连接或主链包括但不限于：5′-硫代磷酸酯基团(本文表示为核苷酸前的小写“s”，如sn、sn、snf、或sdn)、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸盐、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、吗啉基连接、具有正常3′-5′连接的硼代磷酸酯、硼代磷酸酯2′-5′连接的类似物、以及具有反向极性(invertedpolarity)的硼代磷酸酯，其中核苷单位的临近对以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。在一些实施方式中，修饰的核苷间连接或主链缺少磷原子。缺少磷原子的修饰的核苷间连接或主链包括但不限于：短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接、或者一种或多种短链杂原子或杂环糖间连接。在一些实施方式中，修饰的核苷间主链包括但不限于：硅氧烷主链，硫化物主链，亚砜主链，砜主链，甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链，亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链，含烯主链，氨基磺酸酯主链，亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链，磺酸酯和磺酰胺主链，酰胺主链和具有混合的n、o、s和ch2组分的其他主链。
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是双链rnai试剂，并且包括彼此之间至少部分互补(至少70％互补性)的正义链和反义链。反义链含有具有这样序列的区域，所述序列与靶mrna中的序列完美互补(100％互补性)或至少基本上互补(至少85％互补性)。rnai试剂正义链和反义链的长度各自可以是16-30个核苷酸。正义和反义链的长度可以相同或它们可以不同。在一些实施方式中，正义链的长度是约19个核苷酸，而反义链的长度是约21个核苷酸。在一些实施方式中，正义链的长度是约21个核苷酸，而反义链的长度是约23个核苷酸。在其他实施方式中，正义和反义链的长度各自独立地是17-21个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自是21-26个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自是26个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自独立地是17-26个核苷酸。在一些实施方式中，双链rnai具有16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。正义链和反义链之间完美互补或基本上互补的区域通常是15-25(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长度)个核苷酸长度，并且出现在或邻近反义链的5′端。
偶联本文所公开的配体的表达抑制性寡聚化合物任选地并且独立地在核心序列的3′末端、5′末端、或者3′和5′末端处包括另外1、2、3、4、5、或6个核苷酸(作为延伸)。这些其他核苷酸，如果存在，可以与或不与靶向的mrna中相应的序列互补。
在一些实施方式中，当双链rnai试剂与本文所公开的靶向配体偶联，其它正义链核苷酸，如果存在，可以与或不与靶向的mrna中对应的序列相同。其它反义链核苷酸，如果存在，可以与或不与正义链的相应的其他核苷酸(如果存在)互补。
双链rnai试剂可以通过用正义链退火反义链来形成。
在一些实施方式中，靶向配体于rnai试剂正义链或反义链的3'端或5'端连接至rnai试剂。在一些实施方式中，靶向配体连接至正义链的5′末端。在一些实施方式中，靶向配体连接至正义链的3′末端。在一些实施方式中，靶向配体经由不稳定键、可切割键或可逆键与rnai试剂连接。在一些实施方式中，不稳定键、可切割键或可逆键包括在被添加至rnai试剂和靶向配体之间的可切割部分中。
在一些实施方式中，表达抑制性寡聚化合物是单链寡核苷酸。在一些实施方式中，单链寡核苷酸利用rna干扰机制来抑制mrna的表达。在一些实施方式中，单链寡核苷酸在通过除了rna干扰以外的机制降低靶核酸表达方面具有活性。
在一些实施方式中，相对于给药之前的对象或未接受靶向配体偶联物的对象，给予偶联表达抑制性寡聚化合物的所述靶向配体的对象中靶标的基因表达水平和/或mrna水平下降至少约5％，例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。对象中的基因表达水平和/或mrna水平可能在对象的细胞、细胞群、和/或组织中降低。在一些实施方式中，相对于给予靶向配体偶联物之前的对象或未接受靶向配体偶联物的对象，已经给予偶联表达抑制性寡聚化合物的所述靶向配体的对象中蛋白质水平下降至少约5％，例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或98％。对象中的蛋白质水平可在对象的细胞、细胞群、组织、血液、和/或其他流体中降低。可通过本领域已知的任何方法来评价基因表达、mrna、或蛋白质水平的降低。mrna水平和/或蛋白质水平的降低或减少在本文中统称为抑制、降低或减少靶基因的表达。
本领域已知可以用于本文所公开的靶向配体的特定表达抑制性寡聚化合物。具体地，许多参考文献公开了可以与靶向配体偶联的表达抑制性寡聚化合物，用于向肝脏递送组合物。非限制性的示例包括题为“用于抑制lpa基因表达的组合物和方法(methodsforinhibitinggeneexpressionoflpa)”的美国专利申请序列号15/281,309，通过引用将其全部内容纳入本文，其公开了适用于本文所公开的靶向配体的靶向人载脂蛋白(a)基因[lpa]的各种双链表达抑制性寡聚化合物(以抑制作为脂蛋白(a)颗粒一部分的apo(a)蛋白质的表达，从而抑制脂蛋白(a)颗粒(lp(a)))。该apo(a)基因[lpa]主要表达在人和非人灵长类动物的肝脏中。相似地，题为“乙肝病毒感染的rnai治疗(rnaitherapyforhepatitisbvirusinfection)”的美国专利申请序列号15/229,314也通过引用将其全部内容纳入本文，其公开了适用于本文所公开的靶向配体的靶向乙肝病毒的各种双链表达抑制性寡聚化合物。乙肝病毒是一种严格亲肝的含双链dna的病毒，并且其被分类为肝脱氧核糖核酸病毒(hepadnaviruses)的一个成员并且属于肝脱氧核糖核酸病毒科。此外，另一题为“用于抑制因子xii基因表达的组合物和方法(compositionsandmethodsforinhibitinggeneexpressionoffactorxii)”的美国专利申请序列号15/229,314通过引用将其全部内容纳入本文，其公开了适用于本文所公开的靶向因子xii(或因子12，f12)基因的各种双链表达抑制性寡聚化合物。因子xii是主要表达于肝脏中并存在于血液中的丝氨酸蛋白酶。而且，题为“用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表达的组合物和方法(compositionsandmethodsforinhibitinggeneexpressionofalpha-1antitrypsin)”的美国专利申请序列号14/740,307通过引用将其全部内容纳入本文，其公开了适用于本文所公开的靶向α-1抗胰蛋白酶(或att)基因的各种双链表达抑制性寡聚化合物。aat是属于丝抑蛋白超家族的一种蛋白酶抑制剂，并且正常的aat蛋白主要通过肝细胞在肝脏中合成并且分泌至血液。此外，题为“治疗apoc3相关疾病的有机组合物(organiccompositionstotreatapoc3-relateddiseases)”的wo2016/01123通过引用将其全部内容纳入本文，其公开了适用于本文所公开的靶向配体的靶向人载脂蛋白iii(apoc3)的各种双链表达抑制性寡聚化合物。载脂蛋白c-iii是脂蛋白的组成部分，其被认为会抑制富含甘油三酸酯的颗粒的肝脏摄取。本领域也可以找到公开了包括表达抑制性寡聚化合物在内的各种治疗性化合物的其它参考文献，其适用于本文所公开的靶向配体。这些包括但不限于将需要靶向肝脏的组合物。
药物组合物和制剂
本文所公开的靶向配体当其连接至寡聚化合物时，可以用于治疗患有将会受益于该化合物之给予的疾病或病症的对象(例如，人或哺乳动物)。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体当连接至表达抑制性寡聚化合物时，可以用于治疗患有将会受益于靶mrna表达之减少或抑制的疾病或病症的对象(例如，人或哺乳动物)。给予对象治疗有效量的连接至本文所公开的靶向配体的任何一种或多种表达抑制性寡聚化合物，诸如rnai试剂。对象可以是人、患者或人患者。对象可以是成年、青年、幼童或婴儿。所述包括与表达抑制性寡聚化合物连接的靶向配体的药物组合物可以用于提供用于疾病的治疗性处理的方法。这类方法包括向人类或动物给予本文所述的药物组合物。
本文所公开的药物组合物和方法可以在细胞、细胞群、细胞群、组织或对象中降低靶mrna的水平，包括：向对象给予治疗有效量的本文所述的表达抑制性寡聚化合物，所述表达抑制性寡聚化合物与靶向配体连接，从而抑制靶mrna在对象中的表达。在一些实施方式中，所述对象已在先前被鉴定为在靶向的细胞或组织中具有靶基因的病原性上调。
在一些实施方式中，药物组合物包括与靶向配体连接的至少一种表达抑制性寡聚化合物。这些药物组合物可特别用于抑制靶细胞、细胞群、组织或生物体中靶mrna的表达。该药物组合物可以用于治疗患有将受益于靶mrna水平之下降或靶基因表达之抑制的疾病或病症的对象。该药物组合物可以用于治疗这样的对象，所述处于发展出将受益于靶mrna水平之下降或靶基因表达之抑制的疾病或病症的风险中。在一实施方式中，该方法包括向待治疗的对象给予这样的组合物，所述组合物包括如本文所述与表达抑制性寡聚化合物(诸如rnai试剂)连接的靶向配体。在一些实施方式中，向包括连接至表达抑制性化合物的靶向配体的药物组合物添加一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括载剂、运载体、稀释剂、和/或递送聚合物)，从而形成适合用于体内递送至人的药学制剂。
在一些实施方式中，包括与表达抑制性寡聚化合物连接的靶向配体的所述药学组合物被用于治疗或管控与靶mrna表达相关的临床表现。在一些实施方式中，向需要这种治疗、预防或管控的对象给予治疗或预防有效量的一种或多种药物组合物。在一些实施方式中，给予共价连接至寡聚化合物的任何偶联配体可以用于降低对象中疾病症状的数量、严重程度和/或频率。
包括与表达抑制性寡聚化合物连接的靶向配体的所述药学组合物可以用于治疗患有将会受益于靶mrna表达之减少或抑制的疾病或病症的对象中至少一种症状。在一些实施方式中，给予对象治疗有效量的一种或多种这样的药物组合物，所述药物组合物包括与本文所述靶向配体连接的表达抑制性寡聚化合物(诸如rnai试剂)，从而治疗症状。在其他实施方式中，给予对象预防有效量的一种或多种表达抑制性寡聚化合物，从而预防所述至少一种症状。
在一些实施方式中，相对未接受药物组合物的对象，给予连接至本文所公开的靶向配体的表达抑制性寡聚化合物的对象中靶mrna的表达或水平下降至少约5％，例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。对象中的基因表达水平可能在对象的细胞、细胞群、和/或组织中降低。在一些实施方式中，mrna的水平下降。在其它实施方式中，表达的蛋白质水平下降。在一些实施方式中，相对未接受药物组合物的对象，给予连接至本文所公开的靶向配体的表达抑制性寡聚化合物的对象中蛋白质水平下降至少约5％，例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。可通过本领域已知的任何方法来评估表达、mrna、或蛋白质水平的降低。mrna水平和/或蛋白质水平的降低或减少在本文中统称为靶rna的降低或减少或者抑制或降低靶mrna的表达。
给药途径是表达抑制性寡聚化合物与身体接触的途径。通常，用于治疗哺乳动物的药物和核酸给予方法为本领域熟知，且可用于给予本文所述的组合物。连接至本文所述靶向配体的表达抑制性寡聚化合物可以经由任意合适的途径在根据特定途径适当调整的制备物中给予。因此，本文所述药物组合物可以通过注射给予，例如，静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射。在一些实施方式中，本文描述了药物组合物，并且经由吸入给予。
包括连接至本文所述靶向配体的表达抑制性寡聚化合物的药物组合物可使用本领域已知的寡核苷酸递送技术递送至细胞、细胞群、肿瘤、组织或对象。一般而言，本领域公认的递送核酸分子(体外或体内)的任何合适方法可适用于本文所述的组合物。例如，递送可以是通过局部给药(例如，直接注射、植入、或局部给予)，全身给药，或皮下，静脉内，腹膜内，或胃肠外途径，包括颅内(例如，心室内，实质内和鞘内)，肌肉内，透皮，气道(气溶胶)，鼻，口服，直肠，或局部(包括口颊和舌下)给药。在某些实施方式中，通过皮下或静脉内输注或注射给予组合物。
因此，在一些实施方式中，本文所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，可以配制本文所述药物组合物用于向患者给药。
如本文所述，药物组合物或药剂包括药学有效量的至少一种所述的治疗性化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)是除活性药物组分(pai，治疗产品，例如f12rnai试剂)以外有意地包含于药物递送系统的物质。赋形剂以预期的剂量不促进或不意图促进治疗效果。赋形剂可起到以下作用：a)在制造中在药物递送系统的加工中起辅助作用；b)保护、支持或提高api的稳定性、生物利用率或患者接受度；c)在产品的鉴定中起协助作用；和/或d)在储藏或使用中提高api的递送的整体安全性、有效性中的任何其他特性。药学上可接受的赋形剂可以是或不是惰性物质。
赋形剂包括但不限于：吸收促进剂、防粘剂、防泡剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、色素、递送促进剂、递送聚合物、葡糖聚糖、葡萄糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、膨胀剂、填料、香味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、等张剂、载剂、防水剂、和润湿剂。
适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛emtm(巴斯夫(basf)，新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。它应该在制造和储存条件下稳定，并且应该在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。
可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，得到由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
适合关节内给药的制剂可以是药物的无菌水性制备物形式，所述药物可以是微晶形式，例如，以水性微晶悬浮液的形式脂质体制剂或生物可降解聚合物系统也可以用于呈递关节内和眼科给药的药物。
适合局部给予(包括眼部治疗)的制剂包括液体或半液体制备物，如搽剂、洗剂、凝胶剂、施涂剂、水包油或油包水乳剂，如乳膏、软膏或糊剂，或溶液剂或混悬剂。用于局部给予至皮肤表面的制剂可以通过用皮肤病学可接受的运载体来分散药物制备，如洗剂、乳膏、软膏和皂剂。有用的是能够在皮肤上形成膜或层以固定施用物并阻抑移除的运载体。对于局部给予至内部组织表面，可以将试剂分散于液体组织粘合剂或已知将增强对组织表面吸收的其它物质。例如，羟基丙基纤维素或纤维蛋白原/凝血酶溶液可以用于获得优势。或者，可以使用组织包覆溶液，如含果胶的制剂。
就吸入治疗而言，可以使用以喷雾罐、喷雾器或喷雾器分散的粉末(自推进或喷雾制剂)的吸入。这类制剂可以是精细粉末的形式，用于从粉末吸入装置或自推进式分散粉末制剂的肺部给药。在自推进溶液和喷雾制剂的情况中，该作用可以通过选择具有所需喷雾特征的阀门(即，能够产生具有所需颗粒尺寸的喷雾)或通过纳入活性成分作为以受控颗粒尺寸的悬浮粉末来实现。就吸入给药而言，化合物还可以来自含合适推进剂(例如，如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。
也可通过经粘膜或透皮方法进行全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂和胆汁盐。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于透皮给药，通常将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的那样。
所述活性化合物可联合载体制备，所述药学上可接受的载体保护所述化合物不被身体快速清除，例如控释配方，包括植入和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备该制剂的方法是本领域技术人员显而易见的。脂质体悬浮液也能被用作药学上可接受的运载体。这些可按本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
口服或肠胃外组合物可以配制成单位剂型以便于给药和剂量均匀。单位剂量形式指作为单一剂量用于待治疗对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，该预定量经计算能够产生所需治疗效果。本公开中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于活性化合物的独特特性和待实现的治疗效果，以及合成这种活性化合物用于治疗个体的领域中的固有限制。此外，给药可以通过周期注射推注，或可以通过从外部储库(例如，静脉输液袋)的静脉内、肌肉内或腹膜内给药更加连续地实现。
可考虑药物基因组学(即，研究个体的基因型与该个体对外来化合物或药物的响应之间的关系)与本公开的方法联用。通过改变药学上活性药物的血液浓度和剂量之间的关系，治疗物的代谢差异可能导致严重毒性或治疗失败。因此，医生或临床医师可考虑应用相关药物基因组学研究中获得的知识来确定是否给予治疗剂以及裁量用该药物进行的治疗的剂量和/或治疗方案。
药物组合物可包含其他另外的在药物组合物中通常使用的成分。其它这类组分包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、或抗炎剂(例如抗组胺药、苯海拉明等)。也考虑到表达或包括本文定义的rnai试剂的细胞、组织或分离的器官可以被用作“药物组合物”。如本文所述，“药学上有效量”、“治疗上有效量”或简单的“有效量”是指有效产生预期的药学、治疗性或预防性结果的rnai试剂的量。
通常，活性化合物的有效量将在约0.1-约100mg/kg体重/天，例如，约1.0-约50mg/kg体重/天的范围内。在一些实施方式中，活性化合物的有效量将在各剂量约0.25-约5mg/kg体重的范围内。在一些实施方式中，活性成分的有效量将在各剂量约0.5-约3mg/kg体重的范围内。给药的量也可能取决于这样的变量，如患者的整体健康状态，递送化合物的相对生物活性，药物的制剂，制剂中赋形剂的存在和类型，以及给药的途径。此外，能够理解的是，为了快速实现所需血液水平或组织水平可以使给予的最初剂量超过上述较高的水平，或者最初剂量可以小于最佳值。
对于疾病的治疗或对于治疗疾病药物或组合物的制剂，本文所述药物组合物包括连接至靶向配体的表达抑制性寡聚化合物，如rnai试剂，本文所述组合物可与包括但不限于下述的赋形剂或与第二治疗剂或治疗组合：第二或其它表达抑制性寡聚化合物，小分子药物，抗体，抗体片段和/或疫苗。
当与表达抑制性寡聚化合物连接，并且当向其添加药学上可接受的赋形剂或佐剂时，所述靶向配体可被包装在试剂盒、容器、包袋或分配器中。本文所述药学组合物被包装于预填充注射器或瓶。
上述提供的实施方式现在用下面的非限制性实施例说明。
实施例
下述实施例并不是限制性的，并且旨在说明本文所公开的某些实施方式。
用于下述实施例合成的实验详述中的一些缩略语定义如下：h或hr＝小时；min＝分钟；mol＝摩尔；mmol＝毫摩尔；m＝摩尔；μm＝微摩尔；g＝克；μg＝微克；rt或rt＝室温；l＝升；ml＝毫升；wt＝体重；et2o＝乙醚；thf＝四氢呋喃；dmso＝二甲亚砜；etoac＝乙酸乙酯；et3n或tea＝三乙胺；i–pr2net或dipea或diea＝二异丙基乙胺；ch2cl2或dcm＝二氯甲烷；chcl3＝氯仿；cdcl3＝氘代氯仿；ccl4＝四氯化碳；meoh＝甲醇；etoh＝乙醇；dmf＝二甲基甲酰胺；boc＝叔丁氧基羰基；cbz＝苄氧羰基；tbs＝叔丁基二甲基硅烷基；tbscl＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯；tfa＝三氟乙酸；dmap＝4–二甲基氨基吡啶；nan3＝叠氮化钠；na2so4＝硫酸钠；nahco3＝碳酸氢钠；naoh＝氢氧化钠；mgso4＝硫酸镁；k2co3＝碳酸钾；koh＝氢氧化钾；nh4oh＝氢氧化铵；nh4cl＝氯化铵；sio2＝二氧化硅；pd–c＝钯碳(palladiumoncarbon)；hcl＝氯化氢或盐酸；nmm＝n-甲基吗啉；h2＝氢气；kf＝氟化钾；edc-hcl＝n-(3-二甲基氨丙基)-n′-乙基碳化二亚胺盐酸；mtbe＝甲基叔丁基醚；meoh＝甲醇；ar＝氩；sio2＝二氧化硅；rt＝保留时间。
此外，适合用于本文所公开的靶向配体的表达抑制性寡聚化合物示例在下述实施例中的各种表格中示出。下述符号用于表示本文所公开的表格中所示修饰的序列核苷酸：
n＝2′-oh(未修饰的)核糖核苷酸(大写字母，没有f或d指示)
n＝2′-ome修饰的核苷酸
nf＝2′-氟修饰的核苷酸
dn＝2′-脱氧核苷酸
nuna＝2′,3′-开环核苷酸模拟物(未锁定核碱基类似物)
nlna＝锁定的核苷酸
nfana＝2'-f-阿拉伯糖基核苷酸
nm＝2′-甲氧基乙基核苷酸
x或ab＝脱碱基核糖
r＝核糖醇
(invdn)＝反向脱氧核糖核苷酸(3′-3′连接的核苷酸)
(invab)＝反向脱碱基核苷酸
(invx)＝反向脱碱基核苷酸
(invn)＝反向2′-ome核苷酸
s＝硫代磷酸酯连接的核苷酸
vpdn＝乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸
(3'omen)＝3′-ome核苷酸
(5me-nf)＝5'-me，2'-氟核苷酸
cprp＝环丙基膦酸盐/酯
本公开的化合物可以使用本领域技术人员已知的合成化学技术制备。
实施例1.合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1005b、1004b和1002b。
根据下述过程合成含亚磷酰胺的化合物结构1005b、结构1004b和结构1002b，唯一的区别是4-顺式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8)用于合成化合物结构1005b，4-反式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8a)用于合成化合物结构1004b，而4-顺式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8)和4-反式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8a)的混合物用于合成化合物结构1002b。
1)制备2-氨基-3-[4-({[(苄氧基)羰基]氨基}甲基)苯基]丙酸(化合物2)。
将碱式碳酸铜(1.67克(g)，7.59mmol)缓慢地加入1(7.00g，30.34mmol)的水溶液(100ml)。将所得混合物加热到80℃直到观察到溶解。将获得的黑蓝色溶液冷却至25–30℃，然后用水溶液(10ml)形式的氢氧化钠(1.21g，30.34mmol)处理，这导致氨基酸-铜复合物沉淀。将悬浮液在环境温度下搅拌1小时，然后用逐滴添加的氯甲酸苄酯(6.21g，36.41mmol)的thf(20ml)溶液处理5分钟。将混合物搅拌1-2小时，然后过滤。然后将湿饼在etoac中研磨，并且再一次过滤以帮助除水。然后将蓝色固体加入含有200ml水的烧瓶，并用10ml浓缩的hcl处理。搅拌浆料18小时，然后过滤并用水洗涤，获得作为白色固体的化合物4.5g(45％产率，95ap)。rt＝5.8分钟。
2)制备三酸(化合物3)。
将1.5mnaoh(100ml)中的2的浆料(6.00g，18.27mmol)加热至60℃，在此时溶液形成。然后用溶解于1.5mnaoh(20ml)的溴乙酸(10.15g，73.20mmol)溶液处理该溶液。将溶液在60℃下搅拌2小时(通过hpcl，2＝nmt5％)。一旦反应达到完成，将溶液冷却至10℃，并且添加1mhcl直到达到ph＝1.7。允许浆料静置2-3小时，然后用去离子水过滤和洗涤。将固体真空干燥，产生3.01g三酸3(50％，94ap)。rt＝6.94分钟。
3)制备tfp酯(化合物4)。
将3(3.00g，6.75mmol)和2,3,5,6-四氟苯酚(3.99g，24.30mmol)的dcm溶液(50ml)冷却至10℃，并在5分钟内用数份n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺(4.66g，24.30mmol)处理。然后允许该溶液在20分钟内升温至环境温度，并且搅拌3小时。完成后(3<10ap)，用饱和碳酸氢钠(20ml)洗涤反应混合物，然后用盐水(20ml)处理并在旋转蒸发仪上浓缩。获得的油状物在快速柱上使用容积梯度的5-20％etoac/己烷纯化，获得2.6g无色油状物4(40％，94ap)。rt＝12.99分钟。
4)制备胺甲苯磺酸酯(化合物5)。
向适当大小的压力反应器充装(10体积)thf，然后是cbz保护的胺(1.0当量，nag-z)和p-tsoh-h2o(1.0当量)。用氮气对溶液进行3次脱气。装入10％pd/c(5.0重量％)，然后用氮气进行3次脱气。用氢气进行3次脱气。充入氢气至40-50psi的压力。于20-30℃搅拌3小时，然后用氮气进行3次脱气，并对样品进行ipc试验(规格≤0.5％nag-z，如果规格不满足，那么在40-50psi的h2下搅拌1-2小时后再试验)。通过硅藻土过滤以去除催化剂，用thf(4体积)洗涤。将合并的滤液浓缩并在真空下洗涤至约2体积，保持ti≤40℃。用dcm(3.8体积)稀释，然后再浓缩至2体积。重复dcm稀释和再浓缩，然后用dcm(3.8体积)稀释。采样用于kf分析(规格kf≤0.05％，如果不满足kf规格，那么重复进行浓缩并用dcm稀释)。满足kf规格后，将溶液浓缩至白色泡沫固体。未校正的产率为100％。可以还进行将三氟乙酸取代p-tsoh-h2o的类似反应并且可以互换使用。
5)制备三-nag(化合物6)。
将活化的酯4(2.15g，2.41mmol)和胺甲苯磺酸酯5(4.10g,6.75mmol)溶解于二氯甲烷(22ml)并冷却至10℃。在5分钟内逐滴加入三乙胺(1.37g，13.54mmol)以处理溶液，然后允许其升温至环境温度并且维持2小时。用饱和的碳酸氢钠(10ml)洗涤反应混合物，然后用盐水(10ml)处理。用硫酸镁干燥溶液，于旋转蒸发仪上过滤和浓缩以获得无色油状物。检查后，通过hplc发现了～10％的去-酰基(des-acyl)杂质。这些杂质通过在纯乙酸酐(90ml)和三乙胺(6ml)中搅拌1小时再次酰基化。然后在压力减小的情况下下去除乙酸酐，而生成的油状物溶解于二氯甲烷中，并用水性碳酸氢钠洗涤。将该溶液浓缩成油状物，并且经由快速色谱使用梯度洗脱(2.5–25％meoh/dcm)，得到1.98g白色固体6(47％，96ap)。rt＝7.57分钟；去-酰基杂质＝7.18分钟。
6)制备胺盐(化合物7)。
受保护的胺6(1.98g,1.06mmol)和对甲苯磺酸一水合物(202mg，1.06mmol)溶解于纯乙醇(30ml)并置于氮气气氛下。向烧瓶添加5％碳载钯(198mg，0.106mmol)并将烧瓶置于真空且回充氢气数次。一旦处于氢气气氛下，允许在环境温度下搅拌反应物，并发现其在4小时内完成或者直到hplc检测不到起始物质。将催化剂通过硅藻土床过滤，并且将滤液通过0.2微米的膜过滤器以去除细颗粒。在减压下浓缩溶液至干，进而产生2.01g的灰色固体7(100％，98ap)。rt＝5.82；对甲苯磺酸rt＝2.4和3.1分钟。
7)制备活化的接头(化合物9和9a)。
将顺式-4-羟基环己基羧酸8(用于合成结构1005)(4.00g，27.7mmol)和2,3,5,6-四氟苯酚(5.53g，33.3mmol)溶解于24ml的二氯甲烷并冷却至0℃。[如上所述，尽管顺式-4-羟基环己基羧酸(化合物8)用作接头以构成结构1005，但反式-4羟基环己基羧酸(化合物8b)可以代替顺式-同分异构体，而这导致结构1004b的合成，合成的剩余部分按相同操作进行：
向该溶液添加edc-hcl(6.38g，33.3mmol)。将溶液升温至22℃并搅拌12小时。用饱和水性nahco3(50ml)淬灭反应并分离层。用饱和盐水(50ml)洗涤有机层，并且用na2so4干燥。将干燥剂过滤并将溶液浓缩至约20ml，其缓慢固化(接种晶体将有所帮助)。将固体在5％mtbe/己烷(50ml)中浆料化并过滤以产生69％产率和95％纯度的5.6g产物9。
8)接头偶联(制备化合物10)。
将nag胺盐7(5.00g，2.88mmol)和,3,5,6-四氟苯基顺式-4-羟基环己烷羧酸乙酯9(1.68g,5.77mmol)溶解于25ml二氯甲烷并冷却至0℃。向该溶液中加入三乙胺(6.10ml，11.55mmol)。将溶液升温至室温并搅拌5小时，通过hplc监测。用饱和水性nahco3(35ml)淬灭反应并分离层。用饱和盐水(35ml)洗涤有机层，并且用na2so4干燥。将干燥剂过滤，并且经由使用梯度洗脱(0–20％meoh/dcm)的快速色谱将溶液浓缩和纯化，这样获得3.90g白色固体物质化合物10(80％)。rt＝6.16分钟。或者，可进行接头的直接偶联，不需要使用tep酯，如下文实施例2所示。
9)制备化合物11。
将化合物10(1.87g，1.11mmol)溶解于20ml二氯甲烷，并添加2-氰基乙基,n,n,n’,n’-四异丙基亚磷酰胺(0.84g，2.77mmol)。将所得溶液冷却至5℃。向该溶液中加入4,5-二氰基咪唑(0.026g，0.22mmol)。将溶液升温至室温并搅拌1小时。然后通过hplc检查转化的程度(其显示2～％残留的起始物质)。再加入额外2-氰乙基,n,n,n’,n’-四异丙基亚磷酰胺(0.14g,0.46mmol)，并将反应物再搅拌2.5小时(通过hplc未观测到显著的改变)。用饱和水性nahco3(20ml)淬灭反应并分离层。用水性nahco3(20ml)和饱和的盐水(2x20ml)洗涤有机层，并且用na2so4干燥。将干燥剂过滤，并且浓缩溶液以获得2.34g白色固体物质化合物11。
100mg粗物质11这样通过快速柱色谱纯化：通过首先用二氯甲烷中的2％三乙胺洗脱硅胶填充柱30分钟，然后将粗物质11上样到柱并使用梯度洗脱(0–20％的2％三乙胺：甲醇/2％三乙胺：二氯甲烷)进行纯化。最终产物化合物11(其具有本文所述结构1005b的化学结构)在2％三乙胺：二氯甲烷(组分2)中洗脱以获得80mg白色固体物质。
图1显示化合物11(本文所述结构1005b)的1hnmr谱。
图1a显示化合物11的反式异构体(本文所述结构1004b)的1hnmr谱，按照在步骤7中所述的另一种合成方式获得。
实施例2.合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1008b。
1)制备n-[n-(苄氧羰基)-l-γ-谷酰基]-l-谷氨酸三叔丁酯(化合物14)
向装有热电偶，磁力搅拌棒、氮入口和粉末漏斗的吹氮处理的250ml、3-颈圆底烧瓶添加12(10.00g,29.64mmol)，然后添加thf(100ml，10体积)。搅拌所得溶液，并且添加n-甲基吗啉(7.82ml，7.19g，71.15mmol，2.4当量)(反应混合物的kf：163ppm)。
用橡胶隔片替换粉末漏斗，并且使用冰浴将混合物冷却至0℃。在10分钟内向反应混合物中逐滴添加氯甲酸异丁酯(ibucocl，3.85ml，4.05g，29.64mmol，1.0当量)，维持低于4.0℃的罐内温度。添加后，搅拌混合物超过40分钟，并且用粉末漏斗替换隔片。在15分钟内向反应混合物中逐份添加13(8.767g,29.64mmol,1.0当量)，维持低于4.0℃的罐内温度(放热性添加)。添加13后，去除冰浴和粉末漏斗，在剩余步骤的过程中使反应升温至环境温度。添加13后，允许澄清无色溶液静置25分钟。
在开始添加13后40分钟后采集反应的样品，并通过rp-hplc分析转化百分比。因为发现剩余23％的12，所以在反应60分钟后，依次添加额外的ibucocl(1.16ml，1.21g，30mol％)和13(2.63g，30mol％)。允许另外放置溶液60分钟，直到通过hplc显示出超过99％转化的样品。从初始添加13开始，整个反应时间是2.5小时。
将反应溶液倒入冰浴中3℃冷却的0.5mhcl(aq)(125ml)搅拌溶液中，并且搅拌约5分钟。用乙酸乙酯(100ml，10体积；检查以确保水性层是对于nmm完全去除呈酸性)提取淬灭的反应混合物，并用盐水(100ml，10体积)洗涤有机相，用na2so4干燥，用粗孔烧结漏斗过滤进500ml圆底烧瓶中，并真空浓缩，获得稠厚无色油状物。将该油状物溶解于mtbe(100ml，10体积)，并且真空浓缩，再一次获得稠厚无色油状物。
向搅拌的油状物(约600rpm)中加入己烷(100ml，10体积)。溶液中出现白雾现象，其然后在进一步搅拌后消失。加入晶种，搅拌混合物40分钟，在此期间白色晶体缓慢形成。
20分钟内，添加额外的己烷(50ml，5体积)。40分钟后，用粗孔烧结漏斗过滤浆料，用己烷洗涤三次(每次约10ml)，然后在漏斗中风干1小时，进而获得14的精细白色粉末(15.64g，91％)。
图2b显示化合物14的1hnmr谱。
1)制备n-[n-(苄氧羰基)-l-γ-谷酰基]-l-谷氨酸(化合物15)
向装有顶式搅拌器、粉末漏斗、热电偶和加热罩的3000ml、3-颈圆底烧瓶添加14(72.57g,125.4mmol)和甲酸(试剂级别，>95％，1.45l，20体积当量)。用具有n2入口的塞子替换粉末漏斗，然后将获得的溶液加热至45℃并搅拌1小时，用rp-hplc监测。当剩余少于2.0％面积的单叔丁基酯时，认为反应完成。
甲酸添加后60分钟，提取反应的样品，并且通过rp-hplc分析样品中单叔丁基酯的残留百分比。该分析显示90分钟后剩余1.8％单叔丁基酯，并且使反应冷却至室温。
用甲苯和乙腈(各1500ml)稀释反应物，并且真空浓缩混合物。用1:1acn:甲苯(约600ml)以及两次acn(每次约500ml)共沸移除甲酸。高真空中过夜干燥材料以获得白色泡沫状固体(54.3g，定量产率，254nm为96.8％面积)。
图2c显示化合物15的1hnmr谱。
3)制备三-nag-二-glu-nh2(化合物16)。
向1升圆底烧瓶中添加nag-胺对甲苯磺酸盐(5,59.19g，97.6mmol，4.13当量)和z-二-glu三酸(15,10.01g，23.6mmol，校正纯度，1.0当量)。在乙腈(500ml；溶液的kf＝1283ppm)中溶解混合物，并且真空浓缩以通过共沸方式移除水。将残留物溶解在新鲜乙腈(400ml)中，并且转移至吹氮处理的1升3-颈圆底烧瓶，其包括搅拌棒并且装有热电偶。含水量通过kf测量(257ppm)。
通过粉末漏斗向在氮气下搅拌的溶液加入tbtu(28.20g，87.8mmol，3.7当量)。经由注射器在20分钟内逐滴加入dipea(34.0ml，25.2g，8.0当量)，维持反应温度低于25℃(在添加的过程中观测到5℃的放热)。从开始添加dipea时搅拌混合物2小时，通过hplc监测。78分钟时分析显示起始物质被完全消耗。
两小时后，将溶剂真空去除。获得的稠厚油状物溶解于二氯甲烷(1000ml)，并用1.0nhcl(aq)(3x500ml)以及饱和的nahco3(aq)(3x500ml)洗涤。有机层用na2so4干燥，过滤并真空浓缩以获得灰白色蜡状固体(33.5g)。
在iscocombiflash自动化纯化系统上使用330-giscorediseprfgold二氧化硅柱进行快速柱色谱。将粗制物质以chcl3中的溶液(约200ml)上样。利用洗脱液a：chcl3；洗脱液b：meoh的渐变梯度，并收集总计36个组分(各为250-500ml)。将含有组分的产物浓缩并产生18.75g的16(97.0％纯度)。混合的组分产生12.2g的16(78.8％纯度)。
图2d显示化合物16的1hnmr谱。
4)制备三-nag-二-glu-nh2(化合物17)。
向包括搅拌棒的1000ml三颈圆底烧瓶加入甲醇(200ml，13体积)。向搅拌的溶剂加入化合物16(15.44g，9.02mmol校正纯度)，然后添加甲醇(200ml，13体积)和三氟乙酸(1.40ml，18.1mmol，2.0当量)。搅拌该混合物约10分钟。向混合物添加10％pd/c(50％湿重为基准计，1.547g，10％w/w)。用氢气(气球)冲洗顶部，允许在环境温度搅拌混合物2小时，通过pr-hplc监测。
75分钟后，采样反应物(100μl)，并在1ml注射器式滤器(10mm,0.1μmghp膜)中与1:1乙腈:h2o(900μl)混合。hplc色谱图显示大于96％面积的纯度，并且没有残留的起始物质。然后用氦气冲洗反应混合物，并用硅藻土床过滤到清洁1000ml圆底烧瓶中。用甲醇(50ml)和二氯甲烷(50ml)漂洗反应容器，还对漂洗物进行过滤。将轻微浑浊的滤液部分真空浓缩。使用甲醇(50ml)和二氯甲烷(50ml)进行额外的硅藻土床清洗；将这些与残余物合并，并用0.2μmghp膜过滤器过滤至另一清洁1000ml圆底烧瓶中。用乙腈(50ml)漂洗膜，从而可以共沸去除甲苯副产物。真空浓缩溶液以提供灰白色泡沫固体17(14.15g，通过hplc的97.3％面积纯度)。
图2e显示化合物17的1hnmr谱。
5)制备三-nag-二-glu-nh-接头(化合物18)。
向装配有磁力搅拌、热电偶和氮气覆盖的500ml三颈圆底烧瓶装入17(93.7％纯，20.00g，11.4mmol)和二氯甲烷(150ml)。向搅拌的溶液添加顺式-4-羟基环己烷-1-羧酸(1.730g，12.0mmol，1.05当量)，然后添加tbtu(4.036g，12.6mmol，1.10当量)。使用冰-盐水浴将溶液冷却至-9℃，并在7分钟内逐滴添加dipea(6.97ml，5.17g，40.0mmol，3.5当量)，保持初始温度低于-5℃。在添加期间观测到1.7℃的放热。一旦dipea的添加完成，在-9℃搅拌混合物90分钟，此时hplc分析(方法b)显示完全消耗17。
110分钟后，反应通过添加饱和的nh4cl(aq)(400ml)淬灭。分离各层，并用二氯甲烷(2x200ml)萃取水性层。用饱和的nahco3(aq)和盐水(400ml)的1:1混合物洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，真空过滤并浓缩至约125ml。使用少量的甲醇以保证溶解度。将产生的油状物以细流加入含有搅拌的mtbe(1600ml)的3l圆底烧瓶形成白色沉淀物。用二氯甲烷(约20ml)和mtbe(约200ml)对于源烧瓶的漂洗物加入浆料，然后允许其陈化1小时，然后用600ml粗孔玻璃烧结漏斗真空过滤。湿饼在漏斗中的mtbe(2x200ml)中再浆料化，过滤并在高真空线上干燥至恒定质量(constantmass)，提供白色粉末的粗物质18(16.22g,86％未校正的产率)。
粗物质18(17.16g，与之前批次合并)在iscocombiflash自动化纯化系统上使用330-giscorediseprfgold二氧化硅柱进行纯化。将粗制物质以8％meoh/ch2cl2中的溶液(约160ml)上样。利用洗脱液a:ch2cl2；洗脱液b:50％meoh:ch2cl2的梯度产生33个组分。将含有多个组分的产物浓缩并产生10.13g的18(98.1％纯度，59％回收率)。将混合的组分汇集以产生额外的6.52g的18(86.1％纯度)，可以对其再次纯化。
图2f显示化合物18的1hnmr谱。
6)制备靶向配体亚磷酰胺(化合物19)
将化合物18(13.0g，7.87mmol)溶解于无水二氯甲烷(195ml)并置于氮气气氛中。在5分钟内向该混合物逐滴添加dipea(4.11ml，23.61mmol)以及无水二氯甲烷(5ml)中的2-氰基乙基-n,n-二异丙基丙基氯磷酰二亚胺(2.45ml,11.02mmol)。室温下搅拌该反应混合物1小时并用hplc监测(<1％sm剩余)。
用饱和水性nahco3(50ml)淬灭反应。分离有机层，用饱和水性nahco3(1x150ml)和盐水(150:1)洗涤有机层，并且用na2so4干燥。过滤干燥机并经由快速色谱这样浓缩并纯化溶液：首先通过用二氯甲烷(+1％三乙胺)处理二氧化硅柱30分钟，然后将粗制最终产物化合物19(其具有本文所述结构1008的化学结构)上样至柱，并使用梯度洗脱(0–20％meoh(+1％tea)/ch2cl2(+1％tea))纯化30分钟，这产生11.1g白色固体物质化合物19(76％产率，纯度96.6％)。
图2显示化合物19的31pnmr谱。图2a显示化合物19的1hnmr谱。图2和图2a与化合物19的结构(本文所述结构1008b)一致。
实施例3.合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1025。
1)制备化合物21。
在0-5℃向化合物20(40g，221mmol，1.00当量)的meoh(350ml)溶液逐滴添加socl2(52.5g，442mmol，32ml，2.00当量)，加热溶液至60℃并搅拌16小时。tlc(dcm/meoh＝5/1和5滴hoac，rf＝0.43)显示起始物质被消耗，且lcms(et12452-6-p1a)显示形成的产物。真空浓缩混合物以得到白色固体的粗制化合物21(52.4g，粗)。1hnmr：(et12452-6-p1cdmsobruker_b_400mhz)δ9.45(s,1h)，8.55(brs,3h)，7.00(brd,j＝8.0hz,2h)，6.72(d,j＝8.0hz,2h)，4.17(brs,1h)，3.67(s,3h)，3.01(qd,j＝14.2,6.5hz,2h)。
2)制备化合物22。
在0℃向化合物21(52.4g，226mmol，1.00当量)的meoh(230ml)溶液逐滴添加tea(68.7g，679mmol，94ml，3.00当量)、boc2o(59.2g，271mmol，62.4ml，1.20当量)，将混合物在0℃搅拌0.5小时，然后在25℃搅拌16小时。tlc(石油醚/etoac＝1/1，rf＝0.80)显示了形成的新的主斑点且大部分起始物质被消耗。浓缩混合物，通过二氧化硅柱纯化(石油醚/etoac＝1:1)以获得白色固体的化合物22(57.4g，86％产率)。1hnmr：(et12452-8-p1gcdcl3bruker_b_400mhz)δ6.97(d,j＝8.5hz,2h)，6.74(brd,j＝8.0hz,2h)，5.65(brs,1h)，5.01(brd,j＝8.0hz,1h)，4.49-4.59(m,1h)，3.72(s,3h),2.92-3.09(m,2h)，1.43(s,9h)。
3)制备化合物23。
向溶解于丙酮(170ml)的化合物22(35g，119mmol，1.00当量)的溶液添加k2co3(21.3g，154mmol，1.30当量)和bnbr(24.3g，142mmol，16.9ml，1.20当量)，将反应混合物至加热回流(60℃)14小时。tlc(石油醚/etoac＝3/1，rf＝0.80)显示了起始物质被消耗和新斑点形成。在5℃将h2o(500ml)添加至混合物，并搅拌0.5小时，然后过滤并用h2o(80ml*3)洗涤，真空干燥以获得白色固体的化合物23(43g，产率88％，纯度93％)。1hnmr：(et12452-9-p1acdcl3bruker_b_400mhz)δ7.31-7.46(m,5h)，7.05(d,j＝8.5hz,2h)，6.91(d,j＝9.0hz,2h)，5.05(s,2h)，4.97(brd,j＝8.0hz,1h)，4.50-4.60(m,1h)，3.72(s,3h)，2.96-3.11(m,2h)，1.43(s,9h)。
4)制备化合物24。
向化合物23(43g，112mmol，1.00当量)的etoac(215ml)溶液逐滴添加hcl/etoac(4m，215ml，7.71当量)，于25℃搅拌混合物9小时。tlc(石油醚/etoac＝3/1，rf＝0.10)显示起始物质被消耗和新斑点形成。将混合物过滤并用etoac(30ml*3)洗涤，真空干燥以获得白色固体的化合物24(35g，产率97％，纯度99％)。1hnmr：(et12452-12-p1ameodvarian_d_400mhz)δ7.40-7.45(m,2h)，7.34-7.39(m,2h)，7.29-7.33(m,1h)，7.17(d,j＝8.8hz,2h)，7.00(d,j＝8.8hz,2h)，5.09(s,2h)，4.26(dd,j＝7.3,6.0hz,1h)，3.81(s,3h)，3.07-3.23(m,2h)。
5)制备化合物26。
将化合物24(15.5g，48.2mmol，1.00当量)溶解于ch3cn(40ml)和naoh(1.5m，70.6ml，2.20当量q)，于15℃添加化合物25(13.4g，96.3mmol，6.94ml，2.00当量)，检测的ph：约2.5。然后添加4nnaoh直到ph＝13。在70℃加热溶液。30分钟后，ph降至6以下，再次用4nnaoh调整(ph11-13)。分批(两次)加入额外的化合物25(6.69g，48.2mmol，3.47ml，1.00当量)，每次将ph调整为11-13。反应混合物在70℃下加热14小时。lcms(et12452-30-p1a，rt＝0.749分钟)显示形成的产物。将混合物冷却至15℃，然后用4nhcl调整至ph，过滤并用h2o(80ml*2)洗涤，干燥。残留物用thf(600ml)溶解，然后用批次et12452-27、et12452-19浓缩成1/6(sixth)，然后用dcm(500ml)搅拌并过滤，干燥过滤物以获得白色固体的化合物26(35.5g，87％产率，97％纯度)。1hnmr:(et12452-30-p1rmeodvarian_d_400mhz)δ7.40-7.45(m,2h)，7.36(t,j＝7.4hz,2h)，7.27-7.32(m,1h)，7.17(d,j＝8.4hz,2h)，6.91(d,j＝8.6hz,2h)，5.49(s,1h)，5.05(s,2h，,3.71(t,j＝7.6hz,1h)，3.61(s,4h)，3.07(dd,j＝14.1,7.5hz,1h)，2.86-2.96(m,1h)，2.03(s,2h)。
6)制备化合物27。
在5℃向化合物26(15g，38.7mmol，1.00当量)、化合物26a(25.7g，155mmol，4.00当量)的吡啶溶液(250ml)添加edci(29.7g，155mmol，4.00当量)。在30℃下搅拌该混合物12小时。lcms(et12452-59-p1a，rt＝1.053分钟)显示大部分的产物。将混合物浓缩，然后用dcm(200ml)溶解，用饱和nahco3(80ml*4)、盐水(80ml*2)洗涤，用na2so4干燥，过滤和浓缩。通过二氧化硅柱(石油醚/etoac＝3:1,rf＝0.75)纯化残留物，以用化合物26a获得产物，然后用dcm(200ml)溶解，用饱和nahco3(80ml*4)和盐水(80ml*2)洗涤，用na2so4干燥，过滤和浓缩以获得灰白色胶状物的化合物27(19.8g，61％产率)。1hnmr：(et12452-59-p1gcdcl3bruker_b_400mhz)δ7.36-7.46(m,4h)，7.30-7.35(m,1h)，7.24(d,j＝8.7hz,2h)，6.97-7.07(m,3h)，6.94(d,j＝8.7hz,2h)，5.05(s,2h)，4.13-4.26(m,5h)，3.25(d,j＝7.5hz,2h)，2.06(s,1h)，1.25-1.29(m,1h)。
7)制备化合物27-2
将化合物27-1(230g，1.53mol，205ml，1.00当量)在n2气氛下溶解于干dcm(1.6l)中。用冰浴将溶液冷却至0℃，并添加tea(232g，2.3mol，318ml，1.50当量)。然后，向冷却的反应混合物添加dcm(500ml)中的toscl(233g，1.22mol，0.80当量)。添加后，将溶液升温至20℃并搅拌5小时。tlc(石油醚/etoac＝1:1，rf＝0.15)显示了起始物质被消耗，而hplc(et12452-15-p1l，rt＝1.71分钟)显示2个峰。反应混合物通过在0℃添加h2o(500ml)淬灭，然后用ch2cl2(800ml)萃取两个反应。用h2o(1l)和盐水(1l)洗涤该合并的有机层，用na2so4干燥，过滤并浓缩。残留物通过二氧化硅柱纯化(石油醚/etoac＝1:1)以获得黄色油状物的化合物27-2(338g，36％产量)。1hnmr：(et12452-15-p1z1cdcl3bruker_b_400mhz)δ7.79(d,j＝8.0hz,2h)，7.34(d,j＝8.5hz,2h)，4.12-4.19(m,2h)，3.67-3.72(m,4h)，3.60(s,4h)，3.55-3.58(m,2h)，2.44(s,3h)，2.32(s,1h)。
8)制备化合物27-3a。
将化合物27-3-1(230g，591mmol，1.00当量)在20℃悬浮于dcm(700ml)，且在n2下添加tmsotf(197g，886mmol，160ml，1.50当量)。混合物的颜色变成粉色。将混合物加热到50℃并且搅拌1.5小时。然后将反应混合物冷却至20℃并搅拌14小时。tlc(dcm/meoh＝20:1，rf＝0.6)显示起始物质被消耗。在0～5℃将混合物倒入水性nahco3(600ml)，并搅拌15分钟。混合物的颜色变成黄色。用dcm(500ml)萃取混合物，用水性nahco3(500ml)、水(500ml*2)和盐水(500ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩以获得棕色油状物的化合物27-3a(189g，粗，92％纯度)。1hnmr：(et12452-28-p1ccdcl3varian_d_400mhz)δ6.00(d,j＝6.6hz,1h)，5.47(t,j＝3.0hz,1h)，4.91(dd,j＝7.5,3.3hz,1h)，4.17-4.28(m,2h)，4.08-4.14(m,1h)，3.97-4.03(m,1h)，2.13(s,3h)，2.05-2.09(m,9h)。
9)制备化合物27-4a。
在n2气氛下向dcm(1.5l)中的化合物27-3a(189g，574mmol，1.00当量)、化合物7-2(140g，460mmol，0.80当量)和4a分子筛(150g)的混合物添加tmsotf(63.8g，287mmol，51.9ml，0.50当量)，在25℃搅拌混合物8小时。tlc(dcm/meoh＝20:1,rf＝0.46)显示起始物质被消耗，而lcms(et12452-35-p1a,rt＝0.76分钟)显示产物形成。过滤混合物以去除筛，然后用冷水性nahco3(1000ml)淬灭，用dcm(800ml*2)提取，用饱和nahco3(800ml)、h2o(800ml*2)和盐水(800ml)洗涤分离的有机层，用na2so4干燥，过滤并浓缩。然后通过二氧化硅柱纯化(dcm/meoh＝20:1)以获得黄色油状物的化合物27-4a(285g，73％产率)。1hnmr：(et12452-35-p1gcdcl3varian_d_400mhz)δ7.81(d,j＝8.4hz,2h)，7.37(d,j＝8.2hz,2h)，6.30(brd,j＝9.5hz,1h)，5.28-5.35(m,1h)，5.08(dd,j＝11.2,3.3hz,1h)，4.81(d,j＝8.6hz,1h)，4.09-4.29(m,5h)，3.86-3.98(m,3h)，3.68-3.81(m,3h)，3.56-3.66(m,5h)，2.46(s,3h)，2.16(s,3h)，2.04(s,3h)，1.98(s,3h)，1.95(s,3h)。
10)制备化合物27-4。
在10℃向dmso(1.4l)的化合物27-4a(285g，450mmol，1.00当量)溶液添加nan3(38.1g，586mmol，1.30当量)，在60℃下搅拌16小时。lcms(et12452-37-p1a,rt＝0.67分钟)显示产物形成和起始物质被消耗。将混合物倒入h2o(1500ml)，用etoac(1l*5)萃取，用h2o(800ml*3)和盐水(800ml*3)清洗，用na2so4干燥，过滤并浓缩以获得红色油状物的化合物27-4(168g，粗)。1hnmr：(et12452-37-p1ccdcl3bruker_b_400mhz)δ6.12(brd,j＝9.4hz,1h)，5.32(d,j＝2.9hz,1h)，5.06(dd,j＝11.3,3.4hz,1h)，4.78(d,j＝8.7hz,1h)，4.08-4.27(m,5h)，3.82-3.94(m,3h)，3.61-3.77(m,10h)，3.45-3.50(m,2h)，2.16(s,3h)，2.05(d,j＝1.5hz,5h)，1.99(d,j＝4.5hz,6h)，1.26(t,j＝7.2hz,2h)。
11)制备化合物27a。
向toac/meoh(4:1)(640ml)中的化合物27-4(79g，156mmol，1.00当量)的溶液添加pd(oh)2/c(7.9g)，在15℃于h2(30psi)气氛下搅拌4小时。tlc(dcm/meoh＝20:1)显示了起始物质被消耗，而lcms(et12452-53-p1c,rt＝2.55分钟)显示产物形成。用硅藻土对2个平行反应进行过滤，并用dcm(500ml*5)和meoh(200ml*3)洗涤，浓缩以获得黑棕色油状物的化合物27a(140g，粗)。1hnmr：(et12452-53-p1ccdcl3varian_d_400mhz)δ7.02(brd,j＝9.3hz,1h)，5.29-5.34(m,1h)，5.09(dd,j＝11.2,3.3hz,1h)，4.80(d,j＝8.6hz,1h)，4.09-4.24(m,3h)，3.82-3.95(m,3h)，3.52-3.70(m,10h)，2.91(td,j＝5.2,2.8hz,1h)，2.15(s,3h)，2.05(s,4h)，1.98(d,j＝6.4hz,6h)。
12)制备化合物28。
将tea(12.1g，119mmol，16.5ml，5.00当量)添加到dcm(160ml)中含有化合物27(19.8g，23.8mmol，1.00当量)和化合物27a(57g，119mmol，5.00当量)的经搅拌的溶液。将其在30℃下搅拌16小时。lcms(et12452-64-p1a，rt＝1.21分钟)显示产物形成。用dcm(100ml)稀释，并用饱和nahco3/饱和盐水(1:1,2x80ml)洗涤。用na2so4干燥有机层，过滤并浓缩以获得棕色固体的粗制产物。
将粗制产物溶解于ac2o(42ml)、ch3cn(62.5ml)和py(82.3g，1.04mol，84ml，23.96当量)中，将该混合物于25℃搅拌12小时。hplc(et12452-65-p1a,rt＝2.54分钟)显示大部分的产物。蒸发ch3cn，然后用dcm(400ml)稀释并用饱和nahco3(100ml*4)洗涤。分离有机层并用0.1mhcl/饱和盐水(1:1，100ml*4)洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩。残留物通过二氧化硅柱纯化(dcm/meoh＝10:1，rf＝0.45)以获得产物，然后通过p-hplc进一步纯化(柱:phenomenexgeminic18250*50mm*10um；流动相：[水(10mmnh4hco3)-acn]；b％:25％-55％,23分钟)以获得黄色固体的化合物28(28.8g，58％产率，98％纯度)。1hnmr：(et12452-65-p1jdmsovarian_d_400mhz)δ8.00-8.09(m,3h),7.81(d,j＝9.0hz,3h)，7.29-7.45(m,5h)，7.10(d,j＝8.6hz,2h)，6.89(d,j＝8.4hz,2h)，5.21(d,j＝3.3hz,3h)，5.04(s,2h)，4.97(dd,j＝11.2,3.3hz,3h)，4.54(d,j＝8.4hz,3h)，4.02(s,9h),3.83-3.92(m,3h)，3.73-3.81(m,3h)，3.53-3.61(m,4h)，3.44-3.52(m,17h)，3.42(brd,j＝4.4hz,2h)，3.35-3.40(m,6h)，3.07-3.27(m,11h)，2.74-2.87(m,2h)，2.09(s,9h)，1.99(s,10h)，1.89(s,9h)，1.77(s,9h)。
13)制备化合物29。
向化合物28(9.7g,5.48mmol,1.00当量)的thf(250ml)溶液添加干pd/c(5.5g,5.48mmol)，在40℃于h2气氛(50psi)下搅拌6.5小时。tlc(dcm/meoh＝10:1，rf＝0.3)显示消耗的起始材料。将2个平行反应过滤并用thf(300ml*4)和dcm(200ml*3)洗涤，浓缩。通过p-hplc(柱：phenomenexlunac18250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％tfa)-acn]；b％:15％-45％,20分钟)以批次et12452-78纯化残留物以获得白色固体的化合物29(14g,63％产率)。1hnmr：(et12452-80-p1jdmsovarian_d_400mhz)δ9.19(s,1h)，7.99-8.10(m,3h)，7.83(d,j＝9.3hz,3h)，6.95(d,j＝8.4hz,2h)，6.62(d,j＝8.4hz,2h)，5.76(s,2h)，5.21(d,j＝3.3hz,3h)，4.97(dd,j＝11.2,3.3hz,3h)，4.54(d,j＝8.6hz,3h)，4.03(s,9h)，3.83-3.92(m,3h)，3.73-3.81(m,3h)，3.53-3.61(m,4h)，3.44-3.52(m,16h)，3.43(brd,j＝4.4hz,3h)，3.36-3.39(m,3h)，3.26-3.33(m,4h)，3.05-3.24(m,9h)，2.65-2.82(m,2h)，2.10(s,9h)，2.00(s,9h)，1.89(s,9h)，1.77(s,9h)。
14)制备化合物30。
将化合物29(8g,4.77mmol,1.00当量)溶解于dcm(65ml)中，并且添加化合物29a(2.88g,9.54mmol,3ml,2.00当量)。将所得溶液冷却至5℃。向该溶液添加2h-四唑(0.45m，11.7ml，1.10当量)。将溶液升温至15℃并搅拌3.5小时。tlc(dcm/meoh＝5:1,rf＝0.52)显示起始物质被消耗，而hplc(et12452-82-p1a,rt＝2.69分钟)显示产物形成。用dcm(50ml)稀释，用nahco3(30ml)淬灭，用dcm(30ml*2)萃取水相，用饱和的nahco3(30ml*2)、h2o(30ml)和盐水(30ml*2)洗涤合并的有机层，用na2so4干燥，过滤并浓缩。用dcm(30ml)溶解残留物，然后在0℃逐滴添加己烷(150ml)并搅拌15分钟，然后冷却，将有机层倾倒并用dcm(30ml)再次将油状物溶解并逐滴添加己烷(150ml)，重复该过程7次，真空干燥以获得白色固体化合物30(5.5g，55％产率)。1hnmr：(et12452-83-p1bdmsovarian_d_400mhz)δ7.97-8.09(m,3h)，7.78(d,j＝9.3hz,3h)，7.06(d,j＝8.2hz,2h)，6.86(d,j＝8.2hz,2h)，5.73(s,2h)，5.18(d,j＝3.3hz,3h)，4.94(dd,j＝11.1,3.4hz,3h)，4.51(d,j＝8.4hz,3h)，3.99(s,9h)，3.79-3.89(m,4h)，3.70-3.78(m,4h)，3.59-3.69(m,2h)，3.49-3.58(m,4h)，3.44(s,16h)，3.40(brd,j＝4.2hz,3h)，3.32-3.37(m,5h)，3.24-3.28(m,1h)，3.05-3.22(m,9h)，2.78(brt,j＝5.8hz,4h)，2.07(s,9h)，1.96(s,9h)，1.86(s,9h)，1.74(s,9h)，1.15(d,j＝6.8hz,6h),1.09(d,j＝6.8hz,6h)。
图3显示化合物30(本文所述结构1025b)的1hnmr谱。
实施例4:合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1014b。
1)制备化合物32。
在25℃搅拌化合物31(24.71g,87.85mmol,1.00当量)、化合物31a、edci(39.07g,203.82mmol,2.32当量)、吡啶(19.39g,245.11mmol,19.79ml,2.79当量)的acn溶液(260.00ml)2小时。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，所需产物；rf＝0.7)显示所需产物形成。将混合物添加到300mletoac，用nahco3(100ml*2)、100ml盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤和浓缩以获得残留物。粗制产物用二氧化硅柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝100/1～3/1)以获得黄色油状物的化合物32(60.00g，79.25mmol，90.20％产率，97.19％纯度)。1hnmr：(et12600-89-p1admsovarian_d_400mhz)δppm7.52(d,j＝8.4hz,1h),7.27-7.38(m,5h),4.99(s,2h),4.26-4.42(m,3h),3.80-4.15(m,8h),2.27(brs,2h),1.78-1.88(m,1h),1.66(brdd,j＝14.4,7.2hz,1h),1.37-1.41(m,35h)。
2)制备化合物33。
在45℃搅拌化合物32(45.00g,61.15mmol,1.00当量)的甲酸(800.00ml)6小时。lcms(et12600-90-p1a，ms＝511)显示所需产物形成。浓缩混合物以获得残留物。用1000mldcm洗涤残留物以获得白色固体的混合物33(30.00g，54.71mmol，89.47％产率，93.27％纯度)。1hnmr：(et12600-90-p1admsobruker_b_400mhz)δ12.75(brs,3h),7.53(brd,j＝8.4hz,1h),7.29-7.38(m,5h),4.99(d,j＝3.6hz,2h),4.27-4.38(m,2h),4.12(brs,2h),3.84-4.07(m,6h),2.30(brt,j＝7.2hz,2h),2.07(s,1h),1.59-1.88(m,2h),1.39(t,j＝5.6hz,1h)。
3)制备化合物34。
向化合物33(15g，29.33mmol，1.00当量)、化合物33a(29.22g，175.98mmol，6.00当量)、吡啶(11.60g,146.65mmol,11.84ml,5.00当量)的溶液添加edci(28.11g，146.65mmol，5.00当量)，然后在25℃下搅拌该混合物1小时。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)显示所需产物形成。向混合物添加500mldcm，用nahco3(200ml*2)、100ml盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩以获得残留物。用二氧化硅柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)以获得黄色固体化合物34(28g)。
4)制备化合物35。
向化合物34(16.57g，15.01mmol，1当量)、化合物34a的dcm溶液(140ml)添加tea(9.12g，90.08mmol，12.49ml，6.00当量)，然后在25℃下搅拌混合物16小时。lcms(et12600-98-p1g)显示所需产物形成。将混合物倾倒于200mldcm，用100mlnahco3、100ml盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤和浓缩以获得残留物。用制备性-hplc(柱：phenomenexgeminic18250*5010u；流动相：[水(10mmnh4hco3)-acn]；b％：15％-45％，20分钟)纯化以获得黄色固体的化合物5(11g，4.65mmol，30.98％产率，99.5％纯度)。1hnmr：(et12600-98-p1a1dmsovarian_d_400mhz)δ8.65-8.71(m,1h)，8.51(brs,1h),8.18-8.25(m,1h)，8.11(brs,1h)，7.80(d,j＝8.8hz,4h)，7.47(brd,j＝7.6hz,1h)，7.28-7.40(m,5h)，5.75(s,4h)，5.22(d,j＝3.2hz,4h)，4.95-5.03(m,6h)，4.55(d,j＝8.4hz,4h)，3.98-4.06(m,15h)，3.88(dt,j＝11.2,8.8hz,7h)，3.78(dt,j＝10,5.2hz,5h)，3.54-3.62(m,6h)，3.46-3.53(m,25h)，3.41(q,j＝5.6hz,9h)，3.23(brdd,j＝11.6,5.6hz,8h)，2.10(s,12h)，2.00(s,12h)，1.89(s,12h)，1.77(s,12h)。
5)制备化合物36。
向化合物35(10g，4.25mmol，1当量)、tfa(484.52mg，4.25mmol，314.62ul，1当量)的meoh溶液(10ml)添加10％pd(oh)2/c(3.00g)，然后在h2(50psi)下20℃搅拌4小时。lcms(et12600-107-p1a，rt＝2.195)显示了所需产物形成，过滤并浓缩混合物以获得黄色固体化合物36(8g，3.60mmol，84.84％产率)。1hnmr：(et12600-107-p1admsovarian_d_400mhz)δ8.68(brt,j＝5.2hz,1h)，8.46(brt,j＝5.2hz,1h)，8.21-8.27(m,1h)，8.15(brd,j＝5.6hz,2h)，7.84(brd,j＝9.2hz,4h)，5.22(d,j＝3.2hz,4h)，4.98(dd,j＝11.2,3.2hz,4h)，4.56(d,j＝8.4hz,4h)，4.24(brs,1h)，3.99-4.14(m,23h)，3.84-3.94(m,7h)，3.74-3.83(m,5h)，3.55-3.62(m,5h)，3.51(s,25h)，3.38-3.46(m,9h)，3.20-3.30(m,9h)，3.17(d,j＝5.2hz,14h)，2.11(s,12h)，2.00(s,13h)，1.89(s,12h)，1.78(s,12h)。
6)制备化合物37。
多个批次是平行的。向化合物36(2g，857.18umol，1.00当量,tfa)、化合物36a(626.23mg，2.14mmol，2.50当量)的dcm溶液(6ml)添加tea(312.26mg，3.09mmol，427.75ul，3.60当量)，然后在25℃下搅拌混合物16小时。lcms显示所需产物形成。将所有的反应混合物组合，溶解于200mldcm，倾倒至30mlnahco3，用30ml盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩以获得残留物。用制备性-hplc(柱：phenomenexgeminic18250*5010u；流动相：[水(10mmnh4hco3)-acn]；b％：15％-45％，20分钟)纯化以获得白色固体的化合物37(7.5g，3.20mmol，93.27％产率)。1hnmr：(et12600-111-p1admsovarian_d_400mhz)δ8.66(s,1h),8.51(brs,1h),8.20(s,1h)，8.08(s,1h),7.91(brd,j＝7.2hz,1h)，7.80(d,j＝9.2hz,4h)，5.22(d,j＝3.2hz,4h)，4.98(dd,j＝11.2,3.2hz,4h)，4.55(d,j＝8.4hz,4h)，4.47(brs,1h)，4.30(s,1h)，4.25(d,j＝3.2hz,1h)，4.03(s,11h)，3.97(brs,2h),3.84-3.92(m,7h)，3.73-3.82(m,6h)，3.55-3.62(m,5h)，3.47-3.54(m,24h)，3.41(q,j＝5.6hz,9h)，3.23(brdd,j＝11.2,5.6hz,8h)，2.19(brs,1h)，2.10(s,12h)，2.00(s,13h)，1.89(s,12h)，1.77(s,13h)，1.61(brs,3h)，1.40(brd,j＝11.2hz,4h)。
8)制备化合物38。
添加dcm(65ml)中的化合物37(4.4g,1.88mmol,1当量)，和化合物37a(1.13g,3.75mmol,1.19ml,2当量)。将所得溶液冷却至5℃。向该溶液添加2h-四唑(0.45m，4.59ml，1.1当量)。将溶液升温至20℃并搅拌2小时。将混合物溶解于100mldcm，用20mlnahco3淬灭，用dcm(50ml*2)萃取，用20mlnahco3、20ml盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩以获得残留物。将残留物溶解于dcm(25ml，0.2％tea)，然后在0℃逐滴加入己烷(125ml，0.2％tea)并搅拌15分钟，然后冷却，倾倒有机层，并将油状物再次溶解于dcm(30ml)并逐滴添加己烷(150ml)，重复该过程3次，真空干燥。将20ml的dcm添加到白色固体，将其在30℃真空干燥以获得白色固体的38(4.8g，1.83mmol，67.34％产率，97.15％纯度)。lcms:[m-ipr2n]+/2,1222.8。1hnmr：(dmso,varian_400mhz)δ8.67(brs,1h),8.52(brs,1h)，8.20(brs,1h)，8.08(brs,1h)，7.98(brd,j＝7.6hz,1h)，7.79(brd,j＝9.2hz,4h)，5.21(d,j＝3.2hz,4h)，4.98(dd,j＝11.2,3.2hz,4h)，4.55(d,j＝8.4hz,4h)，4.47(brs,1h)，4.29(brd,j＝17.6hz,1h)，3.94-4.11(m,16h)，3.83-3.94(m,8h)，3.78(brdd,j＝10.4,5.2hz,6h)，3.64-3.74(m,3h),3.54-3.63(m,8h)，3.50(brs,26h)，3.36-3.44(m,9h),3.14-3.29(m,9h)，2.75(t,j＝5.6hz,2h)，2.15-2.27(m,4h)，2.10(s,13h),2.00(s,13h)，1.82-1.95(m,15h)，1.77(s,14h)，1.59-1.73(m,4h)，1.45(brd,j＝14.4hz,4h)，1.14(d,j＝6.4hz,12h)。
图4显示化合物38(本文所述结构1014b)的1hnmr谱。
实施例5:合成靶向配体亚磷酰胺化合物结构1006b和1007b。
根据下述相同的过程，合成结构1006b和结构1007b的含亚磷酰胺的化合物，唯一的区别是4-顺式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8)用于合成结构1006b，而4-反式-羟基环己烷羧酸(本文化合物8a)用于合成结构1007b。
1)制备化合物41。
在rt下搅拌z-glu-(otbu)-oh39(445mg，1.32mmol),二-亚氨基二乙酸叔丁酯40(340mg，1.39mmol)，edc(319mg，1.66mmol，1.23当量)和py(3当量，0.33ml)的acn溶液(3ml)1小时，用乙酸乙酯稀释，并用nahco3(2x)洗涤。有机层在mgso4干燥并蒸发。然后，将粗物质溶解于dcm(5ml)中，并添加tfa(5ml)。将其在rt下搅拌16小时，然后蒸发。添加乙酸乙酯，蒸发4x直到形成泡沫/沉淀。粗物质41直接用于tfp活化步骤。rt＝3.78分钟，90％纯度。lcms(es，m/z)；379.0[m+h]+。
2)制备化合物42。
在rt下搅拌粗制三酸41(约1.30mmol)、tfp(7当量，9.10mmol，1.51g)、tea(4当量，0.723ml)和edc(3.3当量，4.29mmol，0.82g)的acn溶液(3.5ml)1小时，用dcm(250ml)稀释，然后用饱和nahco3(2x100ml)洗涤。用na2so4干燥有机层，浓缩并于硅柱上离心。用hex中的acoet(5-20％)洗脱产物活化的三-tfp酯，以获得550mg产物，伴有痕量tfp。rt＝7.06分钟。
将tea(400ul，2.9mmol)添加到dcm(6ml)中含三-tfp酯(540mg，0.642mmol)和galnac-peg3-nh2xtsoh(2.89mmol，1.88g)的搅拌溶液。rt下搅拌16小时，用dcm(200ml)稀释，并用饱和nahco3/饱和盐水(1:1，2x150ml)洗涤。用na2so4干燥有机层，蒸发留下白色固体。将固体溶解于dcm中，并于二氧化硅柱纯化。用dcm中的meoh(0-10％)洗脱获得748mg，95.4％纯度和约100mg，80％纯度三-galnac42，36％产率，2-步。lcms(es,m/z)：:1777.5[m]+，rt＝4.67分钟。
3)制备化合物43。
将10％pd/c、活化的基质(30mg)添加至cbz保护的胺42(715mg,0.402mmol)和tsoh(74.5mg,0.402mmol)的thf(4ml)和tfe(4ml)的溶液。.然后，通过抽真空并用氢气回填来建立氢气气氛(球囊)。将其在氢气气氛搅拌20分钟，用硅藻盐过滤，用dcm(2x10ml)洗涤并蒸发，以获得白色固体的醇c。lcms(es,m/z)：1644.2[m+h]+，rt＝4.67分钟。
去保护的中间产物(0.4mmol)和4-顺式-羟基环己烷羧酸的tfp酯(350mg,1.20mmol)溶解于dcm(2.5ml)中，并且添加tea(3.5当量，0.195ml)。将其搅拌16小时。然后，用dcm(100ml)将其稀释，并用饱和nahco3/饱和盐水(1:1，100mlx2)洗涤。用na2so4干燥有机层，浓缩并于二氧化硅柱上离心。用dcm中的meoh(2-20％)洗脱产物一伙的430mg、>95％纯度的43，61％产率。rt＝4.20分钟。lcms：(es，m/z)：1771.26[m+h]+。
4)制备化合物44。
在o℃向无水dcm(2.4ml)中醇43(405mg，0.229mmol，真空干燥)和四唑(0.50当量，0.25ml，0.112mmol，acn中的0.45m)的搅拌溶液添加2-氰乙基n,n,n′,n′-四异丙基磷酰二亚胺(1.5当量，110ul，0.343mmol)。将其在rt下搅拌1，并添加额外的四唑(0.125ml)和2-氰乙基n,n,n′,n′-四异丙基磷酰二亚胺(0.10ml)。继续搅拌30分钟，然后用dcm(200ml)稀释并用饱和的nahco3/饱和的盐水(1:1，200ml)洗涤。用na2so4/mgso4干燥有机层，蒸发，然后溶解于无水dcm中并再次蒸发，留下白色固体44，408mg、hplc纯度92％，83％产率。lcms：(es，m/z)：1870.4[m-ipr2n]+。
图5显示化合物44(本文所述结构1007b)的1hnmr谱。
实施例6:合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1027b。
1)制备化合物45。
将tea(5.3mmol，0.735ml，4.00当量)添加到dcm(9ml)中含化合物27(1.1g，1.32mmol，1.00当量)和化合物45a(3.20g，119mmol，4.00当量)的搅拌溶液。将其在30℃下搅拌16小时。用dcm(100ml)稀释，并用饱和nahco3/饱和盐水洗涤。用na2so4干燥有机层，过滤并浓缩以获得棕色固体的粗制产物。
将粗制产物溶解于ac2o(3ml)、ch3cn(6ml)和py(6ml)中，将该混合物于25℃搅拌16小时。蒸发ch3cn，然后用dcm稀释并用饱和nahco3洗涤4次。分离有机层并用0.1mhcl/饱和盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅柱纯化(dcm/meoh＝10:1，rf＝0.45)以获得白色固体的产物45(1.47g，68％产率，96％纯度)。
4)制备化合物46。
向化合物45(1.425g,0.871mmol,1.00当量)的thf/tfe(1:1，5ml)溶液添加10％pd/c(24mg)，在40℃于h2气氛下搅拌混合物30小时。tlc(dcm/meoh＝10:1，rf＝0.3)显示起始物质被消耗。将其过滤，用thf(5mlx3)、dcm(5mlx3)洗涤并浓缩。在二氧化硅柱上纯化残留物。用dcm/meoh洗脱以获得白色固体的化合物46(1.013g，75％产率，95％纯度)。lcms：(es，m/z)：1547.5[m+h]+。
5)制备化合物47。
将化合物46(970mg,0.627mmol,1.00当量)溶解于dcm(4.2ml)中，并且添加化合物46a(0.941mmol,0.298mmol,1.5当量)。将所得溶液冷却至5℃，并且二氰基咪唑(dci)(23.1mg，0.188mmol，0.3当量)。将溶液升温至15℃并搅拌2小时。tlc(dcm/meoh＝5:1，rf＝0.52)显示起始物质被消耗，且hplc显示产物形成。用dcm(50ml)将其稀释，用饱和nahco3(30ml)、h2o(30ml)和盐水(30ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解于dcm(2ml)，并添加己烷(120ml)。将白色沉淀滤除以获得白色固体的化合物47(0.975g，93％纯度，82％产率)。lcms：(es，m/z)：1747.5[m+h]+。
图6显示化合物47(本文所述结构1027b)的1hnmr谱。
实施例7.合成靶向配体，含亚磷酰胺的化合物结构1026b。
1)制备三酸49。
向4-溴代-dl-苯基丙氨酸盐酸盐(5.0g，17.8mmol)的1.5mnaoh(100ml)溶液中添加溴乙酸(8.17g，58.8mmol)。将溶液加热至60℃1小时，通过添加氢氧化钠粒料保持ph大于12。完成后，将反应冷却至15℃并将ph调整至1.75-2.00，并且将油性悬浮液陈化2小时直到观察到可过滤的固体。将固体过滤并用水洗涤数次，产生白色固体的分离物(6.0g，93％产率)。
2)制备联芳三酸50。
将芳基溴化物49(4.2g,11.6mmol)和硼酸50(2.8g,12.2mmol)溶解于dmf/水的1:1混合物(168ml)中，并进行10分钟的脱气。用碳酸钾(8.0g,116.2mmol)和pdcl2(dppf)(0.476g,0.6mmol)处理该溶液，并且将反应容器置于氮气气氛下且加热至40℃5小时。完成后，将ph调整为12，并用2x(20ml)乙酸乙酯洗涤水相。将ph调整为1.75–2.00，并冷却至15℃。将所得固体过滤并用水洗涤数次以将任何无机物去除以产生51(4.8g，89％产率)。
1)制备三tfp酯52。
将三酸51(5.0g,10.7mmol)和四氟苯酚(6.5g,38.8mmol)的二氯甲烷浆料(50ml)冷却至0℃，并用edc盐酸盐(7.45g,38.8mmol)处理。将浆料升温至环境温度并搅拌18小时。反应完成后，将反应物用水洗涤，并将有机层浓缩至油状物，并于二氧化硅柱上纯化，产生tfp酯52(1.63g,16％产率)。
2)制备三-nag保护的醇54。
将三-tfp酯52(1.00g,1.10mmol)和nag-胺甲苯磺酸酯53(2.15g,3.33mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)冷却至0℃，并用三乙胺(0.66g,6.6mmol)处理。溶液在2小时内升至至室温。完成后，反应混合物用水洗涤并浓缩至油状物。将粗制油状物溶解于无水乙酸(30ml)，并且用1ml三乙胺处理溶液。3小时后，在高真空下将有机物去除，产生油状物54(1.7g，85％产率)。
3)制备酚55。
将受苄基保护的醇54(2.0g，1.08mmol)溶解于乙醇(23ml)，并置于氮气气氛下。向溶液添加10％pd/c(0.7g，30mol％)。在环境温度将浆料搅拌8小时，经由藻土垫去除催化剂。在高真空下将有机物去除，产生油状物55(1.4g，74％产率)。
4)制备化合物56。
将酚55(1.3g，0.74mmol)和亚磷酰胺试剂(0.364mg，1.11mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)冷却至0℃，并用4,5-二氰基咪唑处理，然后在2小时内升温至环境温度。完成后，用饱和碳酸氢钠(10ml)洗涤反应混合物，然后用水洗涤，并将有机层用硫酸钠干燥。减压浓缩有机物，产生白色固体(1.4g，93％产率)。
实施例7的化合物56为本文所述结构1026b。
实施例8.靶向配体，含亚磷酰胺的化合物的物理性质。
不具有本文所公开的刚性接头结构的某些galnac配体亚磷酰胺化合物在许多常用溶剂中显示出胶凝的倾向。所附图7是说明galnac结构性能的照片，所述galnac结构具有与结构1008b相同的靶向部分(n-乙酰基-半乳糖胺)、拴系物和分支点基团，但是其包括peg接头，而不是本文所公开的结构1008b的刚性接头。将peg接头-galnac亚磷酰胺化合物在分子筛上的0.1m稀释度的acn:dmf的3:1混合物中维持12小时。peg接头-galnac在高极性溶剂系统中显示出显著的胶凝。对于该peg接头-galnac亚磷酰胺化合物，有必要使用高达1:1的acn:dmf混合物以维持溶解性。
所附图8是这样的照片，其描述完全溶解于0.05m乙腈的亚磷酰胺化合物结构1008b，不需要高极性溶剂如dmf。不同于peg接头-galnac结构，包括刚性接头结构1008b的亚磷酰胺化合物不具有风险也不需要高极性溶剂来维持溶解性。尽管以较低浓度溶解于瓶中，这说明了包括本文所公开的刚性接头的结构在用于寡核苷酸合成的传统溶剂中更加可溶，并且不需要添加高极性溶剂来阻止胶凝。
实施例9.靶向配体含亚磷酰胺的化合物的纯度。
如实施例2中所述，图2a显示了结构1008b的亚磷酰胺化合物的31pnmr谱图。图2a显示了展示亚磷酰胺校正偏差的的单个峰。并未显示其它峰，包括水解峰，这表示高度纯的化合物。
图9显示了peg接头-galnac结构的31pnmr谱图，其另包括与结构1008b相同的分支点基团、拴系物和靶向部分。获得图9所示谱图的亚磷酰胺的化学结构如图9所示。图9显示多个不纯峰，其包括似乎是经水解的副产物。
实施例10.寡核苷酸组合物合成。
a.合成。在用于寡核苷酸合成的固相上按照亚磷酰胺技术来合成rnai试剂。根据规模，使用
b.支持物上结合的寡聚物的切割和去保护。在固相合成结束后，在30℃下用1:1体积的水中40重量％甲基胺溶液和28％氢氧化铵溶液(奥德里奇公司(aldrich))处理干燥的固体支持物2小时。蒸发溶液并在水中重建固体残留物(见下文)。
c.纯化。通过使用tksgelsuperq-5pw13u柱和shimadzulc-8系统的阴离子交换hplc来纯化粗寡聚物。缓冲液a是20mmtris，5mmedta，ph9.0并含有20％乙腈并且缓冲液b与缓冲液a相同，且添加1.5m氯化钠。记录260nm处的uv踪迹。汇集合适的分级分离部分，然后在使用填充有sephadexg-25介质的gehealthcarexk16/40柱的尺寸排阻hplc上运行，运行缓冲液是100mm碳酸氢铵，ph6.7和20％乙腈。
d.退火。通过在0.2×pbs(磷酸盐缓冲盐水，1×，康宁公司(corning)，cellgro)中混合等摩尔的溶液(正义和反义)来混合互补链以形成rnai试剂。将该溶液置于70℃的热混合器中，加热至95℃，在95℃保持5分钟，并缓慢冷却至室温。一些rnai试剂被冻干并储存在-15至-25℃。通过测量0.2×pbs中uv-vis光谱仪上的溶液吸收来确定双链体浓度。然后将在260nm处的溶液吸收乘以转换因子和稀释因子来确定双链体浓度。除非另外说明，所有转化因子是0.037mg/(ml·cm)。对于一些实验，从实验确定的消光系数来计算转化因子。
实施例11.使用野生型小鼠中的f12表达抑制性寡聚化合物比较用于galnac靶向配体的3’和5’正义链连接位点。
为了评价正义链3'和5'末端之间galnac配体连接位点的差异，制备具有如下表1所示序列的涉及f12的表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)(本文称为f12rnai试剂)：
表1.实施例11的f12表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表1中，使用以下符号：
f12rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
连接至相应的galnac配体(即，(nag15)或(nag18))的f12rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
连接至相应的galnac配体(即(nag15)或(nag18))的f12rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的3mg/kg(mpk)剂量的f12rnai试剂(ad02803或ad02807)两种中的一种。各治疗组存在三(3)只野生型小鼠。如上所示，ad02803包括连接至正义链3'端的(nag15)，而ad2807包括连接至正义链5'端的(nag18)。
在第8、15、22和29天收集来自经处理小鼠的血清样品以监测敲减。通过利用内部研发的mf12
图10显示该研究的结果。最低点时(第22天)，ad02803显示循环f12水平减少约70％，而ad02807显示减少大于80％。该数据还显示敲减作用长度中的差异，如在第29天，ad02803处理的小鼠相较于ad2807处理的小鼠显示出快速回到基线。这些数据支持galnac配体在正义链5'端的连接优于位于3'正义链的连接。
实施例12.使用野生型小鼠中的f12表达抑制性寡聚化合物进一步比较用于galnac靶向配体的3’和5’正义链连接位点。
为了进一步评价galnac配体在双链表达抑制性寡聚护合物(双链rnai试剂)正义链3'和5'末端连接的位点，针对f12基因的组合物被制备成具有如下表2所示的序列：
表2.实施例12的f12表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表2中，使用以下符号：
f12rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
连接至相应的galnac配体(即，(nag20))的f12rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
连接至相应的galnac配体(即，(nag20))的f12rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的3mg/kg(mpk)剂量的rnai试剂(ad02815或ad02816)两种中的一种。各治疗组存在三(3)只野生型小鼠。如表2所示，ad02815包括连接至正义链5'端的(nag20)，而ad02816包括连接至正义链3'端的(nag20)。
在第8、15、22和29天收集来自经处理小鼠的血清样品以监测敲减。通过利用内部研发的mf12
图11显示该实验的结果。最低点时(第22天)，ad02816显示循环f12水平减少约60％，而ad02815显示减少79％。该数据还显示敲减作用长度的不同。在第29天，由生理盐水水平，ad02816处理的小鼠显示40％的敲减，而ad02815处理的小鼠显示71％的敲减。这些数据支持galnac配体在正义链5'末端的连接。
实施例13.lp(a)转基因(tg)小鼠中连接至结构1003的靶向配体的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链lp(a)rnai试剂)，其具有如下表3所示的序列：
表3.实施例13的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表3中，使用以下符号：
(nag29)具有本文结构1003所表示的化学结构。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
使用lp(a)转基因(tg)小鼠(frazerka等1995,naturegenetics9:424-431)评估偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。该小鼠从含有完整lpa基因(编码apo(a)蛋白)且在5'和3'具有额外序列的yac表达人apo(a)，以及人apob-100，从而生成人源化的lp(a)颗粒(其后被称为“lp(a)tg小鼠”)。(callowmj等1994,pnas91:2130-2134)。
连接至相应的galnac配体(即，(nag25)或(nag29))的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
与相应的galnac配体(即，(nag25)或(nag29))在正义链5'端连接的lp(a)rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的1mg/kg(mpk)剂量相应的lp(a)rnai试剂(ad03547或ad03549)。各治疗组存在四(4)只lp(a)tg小鼠。
在第-1(预剂量)、5、11、16、22、29和36天收集来自处理小鼠的血清样品。敲减通过计算血清中lp(a)颗粒水平确定。lp(a)颗粒水平根据生产商的推荐在
结果示于图12。ad03549(nag25)在最低时显示71％的敲减(第16天)，而ad03547(nag29)在最低时显示81％的敲减(第11天)。两种引发剂在最低点之后显示相似的恢复曲线，在第36天敲减少于26％。这些数据支持实施例13中所示galnac配体在采用单一1mg/kg剂量的lp(a)tg小鼠中与初始敲减活性和敲减持续时间方面是相当的。
实施例14.给予连接至靶向配体结构1002和1004的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)后apo(a)转基因(tg)小鼠中的apo(a)敲减。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链lp(a)rnai试剂)，其具有如下表4所示的序列：
表4.实施例14的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表4中，使用以下符号：
此外，(nag25)具有与上文实施例13中所示相同的化学结构。
(nag28)具有本文结构1002所表示的化学结构。(nag20)具有本文结构1004所表示的化学结构。(nag28)包括顺式异构体和反式异构的混合物，而(nag30)仅为反式异构体。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
使用apo(a)转基因(tg)小鼠评估偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。apo(a)tg小鼠(frazerka等1995,naturegenetics9:424-431)从含有完整lpa基因(编码apo(a)蛋白)且在5'和3'均具有额外序列的yac表达人apo(a)(其后被称为“apo(a)tg小鼠”)。
连接至相应的galnac配体(即，(nag25)、(nag28)或(nag30))的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
与相应的galnac配体(即，(nag25)、(nag28)或(nag30))在正义链5'端连接的lp(a)rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的0.5mg/kg(mpk)剂量的相应的rnai试剂(ad03536、ad03538或ad03540)。各治疗组存在三(3)只apo(a)tg小鼠。
在第-1(给药前)、8、15、22和29天收集来自处理小鼠的血清样品。敲减通过使用针对apo(a)的elisa(阿柏堪穆公司(abcam))测试来自小鼠的血清予以确定。为了标准化，将各动物在相应时间点处的apo(a)水平除以该动物中的处理前表达水平(本例中在第-1天)以确定“针对第-1天进行标准化”的表达的比率。然后，通过如下方式使特定时间点处的表达针对盐水对照组进行标准化：将个体动物的针对第-1天进行标准化(“normalizedtoday-1”)的比率除以盐水对照组中全部小鼠的平均“针对第-1天进行标准化”的比率。这产生了针对对照组的表达进行标准化的各时间点的表达。实验误差以平均值的标准误差给出。
结果示于图13。对于测试的所有rnai试剂，最低点为第15天。在最低点时，ad03536显示74％的apo(a)蛋白敲减，ad03538显示74％的apo(a)蛋白敲减，而ad03540显示71％的apo(a)蛋白敲减。在第29天，所有的rnai试剂显示>48％的apo(a)蛋白水平敲减，除了ad03536(含有nag25)显示仅为16％的敲减。这些数据支持nag结构在初始敲减活性方面表现相似，含有接头结构nag28和nag30的rnai试剂在第29天显示数值上更大的敲减。
实施例15.给予连接至靶向配体结构1005和1008的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)后lp(a)tg小鼠中的lp(a)敲减。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链lp(a)rnai试剂)，其具有如下表5所示的序列：
表5.实施例15的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表5中，使用以下符号：
此外，(nag25)具有与上文实施例13中所示相同结构。
(nag31)具有本文结构1005所表示的化学结构。(nag37)具有本文结构1008所表示的化学结构。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
使用lp(a)tg小鼠评估偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。
连接至相应的galnac配体(即，(nag25)、(nag31)或(nag37))的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
连接至相应的galnac配体(即(nag25)、(nag31)或(nag37))的lp(a)rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的3mg/kg(mpk)剂量的相应的rnai试剂(ad03536、ad03629或ad04170)。各治疗组存在四(4)只lp(a)tg小鼠。
在第-1(给药前)、8、15、22、29和36天收集来自处理小鼠的血清样品。敲减通过计算血清中lp(a)颗粒水平确定。lp(a)颗粒水平根据生产商的推荐在
所得数据示于图14。ad03536在最低点(第15天)时显示95％的lp(a)水平的敲减，并且在第36天维持76％的敲减。ad03629在最低点(第8天)时显示97％的lp(a)水平的敲减，并且在第36天维持90％的敲减。ad04170在最低点(第8天)时显示97％的lp(a)水平的敲减，并且在第36天维持78％的敲减。
实施例16.给予连接至结构1005、1008、1025和1027的靶向配体的f12表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)后野生型小鼠中的f12敲减。
制备f12表达抑制性寡核苷酸化合物(双链f12rnai试剂)，其于5'末端经由硫代磷酸酯连接与下述部分偶联：galnac靶向配体(nag25)[ad04162]；(nag37)[ad04623]；(nag31)[ad04512]；(nag33)[ad04650]或(nag38)[ad04651]。各双链rnai试剂针对f12。
下述符号用于galnac靶向配体结构：
(nag31)具有本文结构1005所表示的化学结构。(nag33)具有本文结构1025所表示的化学结构。(nag37)具有本文结构1008所表示的化学结构。(nag38)具有本文结构1027所表示的化学结构。ad04162、ad04623、ad04512、ad04650和ad04651的序列和修饰模式相同，组合物中唯一的区别是位于各f12rnai试剂正义链5'末端的galnac靶向配体结构，如上所示。
f12rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
偶联至相应的galnac配体(即，(nag25)、(nag31)、(nag33)、(nag37)或(nag38))的f12rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
连接至相应的galnac配体(即(nag25)、(nag31)、(nag33)或(nag37))的f12rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的1mg/kg(mpk)剂量的5种双链体(ad04162、ad04623、ad04512、ad04650和ad04651)中的一种。各治疗组存在四(4)只野生型小鼠。如上所示，ad04162包括结构(nag25)，ad04623包括结构(nag37)，ad04512包括结构(nag31)，ad04650包括结构(nag33)，而ad04651包括结构(nag38)。所有的galnac靶向配体在各对应rnai试剂正义链的5'末端连接。
在第-1(给药前)、8、15和22天收集来自处理小鼠的血清样品以监测敲减。通过利用内部研发的mf12
该研究的结果见图15。对于测试的所有rnai试剂，最低点为第8天。在最低点时，ad04162显示90％的mf12敲减，ad04623显示94％的mf12敲减，ad04512显示94％的mf12敲减，ad04650显示92％的mf12敲减，而ad04651显示87％的mf12敲减。在第22天，所有的rnai试剂显示>82％的mf12水平敲减，除了ad04162(含有nag25)显示仅为74％的敲减。这些数据支持nag结构在初始敲减活性方面表现相似，其中含有刚性接头结构或本文所公开的接头替代部分(即，nag31、nag33、nag37和nag38)的rnai试剂在第22天显示数值上更大的mf12敲减。
实施例17.lp(a)tg小鼠中连接至结构1004和1005的靶向配体的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)，其具有如下表6所示的序列：
表6.实施例17的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在表6中，(nag30)与上述实施例14中所示的化学结构一样，而(nag31)与上述实施例15中所示的化学结构一样。
nag30具有本文结构1004所表示的化学结构。nag31具有本文结构1005所表示的化学结构。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
使用如本文所述的lp(a)tg小鼠评估偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。
连接至相应的galnac配体(即，(nag30)或(nag31))的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
与相应的galnac配体(即，(nag30)或(nag31))在正义链5'端连接的lp(a)rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的1mg/kg(mpk)剂量的lp(a)rnai试剂(ad03629或ad03540)。各治疗组存在四(4)只lp(a)tg小鼠。
在第-1(给药前)、8、15、22、29、36和43天收集来自处理小鼠的血清样品。敲减通过计算血清中lp(a)颗粒水平确定。lp(a)颗粒水平根据生产商的推荐在
结果示于图16。对于研究的两种rnai试剂，最低点为第15天。ad03629在最低时显示89％的lp(a)水平敲减，而ad03540在最低时显示85％的lp(a)水平敲减。两种rnai试剂截止第36天显示相似的恢复曲线。然而，在第43天，尽管ad03540显示16％的lp(a)水平敲减，但是ad03629显示55％的lp(a)水平敲减。
实施例18.给予连接至靶向配体结构1007、1025和1026的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)后apo(a)tg小鼠中的apo(a)敲减。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)，其具有如下表7所示的序列：
表7.实施例18的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
在上表7中，使用以下符号：
(nag33)具有本文结构1025所表示的化学结构。(nag34)具有本文结构1026所表示的化学结构。(nag35)具有本文结构1007所表示的化学结构。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
使用apo(a)转基因(tg)小鼠评估偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。
连接至相应的galnac配体(即，nag33、nag34或nag35)的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
偶联相应的galnac靶向配体(即，nag33、nag34或nag35)的lp(a)rnai试剂经由sc注射递送。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上给予200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水或缓冲盐水中的1mg/kg(mpk)剂量的相应的rnai试剂(ad03721、ad03722或ad03723)。各治疗组存在三(3)只apo(a)tg小鼠。
在第-1(给药前)、8、15、22和29天收集来自处理小鼠的血清样品。敲减通过测定血清中循环apo(a)蛋白水平确定。血清中人apo(a)蛋白水平通过使用针对apo(a)的elisa(阿柏堪穆公司)测试来自小鼠的血清予以监测。为了标准化，将各动物在相应时间点处的apo(a)水平除以该动物中的处理前表达水平(本例中在第-1天)以确定“针对第-1天进行标准化”的表达的比率。然后，通过如下方式使特定时间点处的表达针对盐水对照组进行标准化：将个体动物的针对第-1天进行标准化(“normalizedtoday-1”)的比率除以盐水对照组中全部小鼠的平均“针对第-1天进行标准化”的比率。实验误差以平均值的标准误差给出。
所得数据示于图17。对于研究的所有rnai试剂，最低点为第15天。ad03721在最低点时显示91％的apo(a)蛋白水平敲减，ad03722在最低点时显示81％的的apo(a)蛋白水平敲减，而ad03723在最低点时显示90％的apo(a)蛋白水平敲减。处理后apo(a)蛋白水平的回收显示相似的轨迹，ad03721和ad03723处理的小鼠在各时间点显示几乎相同的敲减，而ad03722处理的小鼠在测试的各时间点显示数值上较低的敲减。例如，在第29天，ad03721处理的小鼠显示76％的apo(a)水平敲减，ad03723处理的小鼠显示83％的apo(a)水平敲减，而ad03722处理的小鼠显示61％的apo(a)水平敲减。这些数据支持nag33、nag34和nag35结构在初始敲减活性方面表现相似，含有结构nag33和nag35的rnai试剂在第29天显示数值上更大的敲减。
实施例19.lp(a)tg小鼠中连接至结构1008靶向配体的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)(以1mg/kg和3mg/kg剂量给予)的剂量响应。
使用如本文所述的lp(a)转基因小鼠评估具有偶联n-乙酰基-半乳糖胺配体的双链rnai试剂的体内效力。制造如上实施例15所示针对具有双链体id:ad04170的lp(a)的rnai试剂。如上所示，lp(a)双链体id:ad04170包括在正义链5'末端连接的(nag37)靶向配体(结构1008)。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
连接至靶向配体结构1008的lp(a)rnai试剂被组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
连接至靶向配体结构1008的lp(a)rnai试剂通过皮下(sc)注射给予。在第1天，在肩部之间背部的松弛皮肤上进行200μl溶液/20g小鼠的sc注射，其含有盐水，缓冲盐水中的1mg/kg(mpk)rnai试剂，或缓冲盐水中的3mg/kg(mpk)rnai试剂。
对照血清(预处理)样品取自在第-1天的注射前的小鼠。lp(a)颗粒水平根据生产商的推荐在
结果示于图18。如图18所示，剂量依赖型关系对于所有时间点的lp(a)rnai试剂是明显的。
实施例20:食蟹猴中连接至结构1103和1004的靶向配体的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)。
制备lp(a)表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)，其具有如下表8所示的序列：
表8.实施例20的lp(a)表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
lp(a)rnai试剂ad03547与实施例13所示相同，并且其偶联至(nag29)。lp(a)rnai试剂ad3668偶联于(nag30)。(nag30)具有实施例14中所示的化学结构。(nag29)由本文所述结构1003表示。(nag30)由本文所述结构1004表示。
lp(a)rnai试剂的各链根据亚磷酰胺技术使用
偶联至本文所公开的具有结构1003或结构1004的靶向配体的lp(a)rnai试剂经制备并组合于本领域已知用于皮下(sq)注射的药学上可接受的缓冲剂中。
对照血清(处理前)样品在第-14天、-7天和第1天(给药前)取自注射前的食蟹猴。lp(a)颗粒水平根据生产商的推荐在
在第1天，用连接至本文所公开的靶向配体的lp(a)rnai试剂以3mg/kg的lp(a)rnai试剂ad03668或lp(a)rnai试剂ad03547对食蟹猕猴(食蟹猴)灵长类动物进行皮下注射。向各治疗组中的两(2)只猴给药。
结果如图19所示。偶联至结构1003(ad03547)或结构1004(ad03668)的lp(a)rnai触发剂显示食蟹猴中的敲减。
实施例21:食蟹猴中的连接至结构1008的靶向配体的f12表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)。
f12rnai试剂具有针对f12并且于正义链5'端连接至galnac靶向配体结构1008[(nag37)]的不同序列，其经制造并且组合于本领域已知用于皮下(sc)注射的药学上可接受的缓冲剂中。(nag37)具有与上文实施例16中所示相同化学结构。
在第1天，用3mg/kg的具有不同序列结构和不同修饰模式的以下六(6)种不同的lp(a)rnai之一对蟹猕猴(食蟹猴)灵长类动物进行皮下注射：ad04623、ad04624、ad04625、ad04626、ad04627或ad04628。向各治疗组中的两(2)只猴给药。
在第-7天和第1天(给药前)以及在第8、15和22天采集接受处理的食蟹猴的血清样品以监测敲除。通过利用人f12elisa试剂盒(分子创新公司)对血清中循环猕猴(cyno)f12蛋白(cf12)水平进行定量来测试敲减。将各动物在相应时间点处的cf12水平除以该动物中的处理前表达水平(第-7天和第一天的平均值)以确定“针对给药前进行标准化”的表达的比率。实验误差以标准偏差给出。
表20显示了结果。连接至nag37(结构1008)的各f12rnai试剂在食蟹猴中显示敲减，其中ad04625和ad04623在所有测量的时间点中显示最大的敲减。
实施例22.piz转基因小鼠中的连接至结构1008的靶向配体的α-1抗胰蛋白酶表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)。
为了体内评价针对α-1抗胰蛋白酶(aat)基因的rnai试剂，使用转基因piz小鼠模型(piz小鼠)。piz小鼠具有人pizaat突变等位基因并且模拟人aatd(carlson等,journalofclinicalinvestigation1989)。制备aat表达抑制性寡聚化合物(双链rnai试剂)，其具有如下表9所示的序列：
表9.实施例22的aat表达抑制性寡聚化合物(rnai试剂双链体)。
(nag37)具有与上文实施例16中所示相同化学结构。
在药学上可接受的盐水缓冲液中中制备aatrnai试剂，并且通过皮下(sc)注射在肩部之间背部的松弛皮肤上以200μl溶液/20g小鼠给予piz小鼠，从而评价aat基因表达的敲减。各小鼠接受3mg/kg(mpk)的ad04463的单个sc剂量。向三只小鼠给予aatrnai试剂(n＝3)。
在第-1天、第1天(给药前)、第8天和第15天收集血浆样品并分析aat(z-aat)蛋白质水平。aat水平针对第1天(给药前)aat血浆水平进行标准化。蛋白质水平通过利用elisa试剂盒对血浆中循环人z-aat水平进行定量来测量。
平均标准化的aat(z-aat)水平如图21所示。与本文所述结构1008的靶向配体连接的aatrnai试剂显示出在piz转基因小鼠中的敲减。
其它实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在所附权利要求的范围内。
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