丛枝菌根真菌孢子富集筛选方法及装置与流程

本发明涉及一种筛选方法与装置，具体是一种丛枝菌根真菌孢子富集筛选方法及装置，属于微生物领域。

背景技术：

丛枝菌根真菌是一类广泛存在于土壤中的植物根系共生真菌，能够与大部分高等植物根系形成共生关系。丛枝菌根真菌孢子是丛枝菌根真菌的繁殖器官。为了对丛枝菌根真菌孢子进行扩增，利用人工纯培养对丛枝菌根真菌孢子进行扩繁是最有效的技术。目前发现的丛枝菌根真菌孢子种类约250种，隶属于球囊霉门，在大部分逆境环境中都能够见到丛枝菌根真菌孢子的踪迹。为了探究不同逆境环境中丛枝菌根真菌孢子的特性及其抗逆机制，大量分离和筛选具有抗逆特性的丛枝菌根真菌孢子至关重要，这也为后续的单孢扩繁技术以及丛枝菌根真菌菌种的获得奠定了基础。然而丛枝菌根真菌只能通过活体宿主植物根系形成共生关系，才能够完成繁殖过程，而不能够通过纯培养技术获得丛枝菌根真菌孢子，这对于丛枝菌根真菌菌种资源的分离筛选造成了极大的难度。

目前无特定的丛枝菌根真菌孢子筛选富集装置。传统筛选富集丛枝菌根真菌孢子主要是通过普通盆栽试验，将野外根际土和宿主植物进行长期培养，从而实现丛枝菌根真菌孢子的扩繁。然而该方法往往不能够得到大量的丛枝菌根真菌孢子，并且部分种类的孢子由于宿主根系的原因不利于在根系附近进行产孢。近几年也公开了一种通过毛状根扩增丛枝菌根真菌孢子的方法。是将宿主的根系通过发根农杆菌诱导成毛状根，再将菌根真菌的孢子经表面消毒后接种在根系附近的毛状根上。然而野外的丛枝菌根真菌孢子往往活性较低，数量也比较少，容易在培养过程中引入污染造成实验失败，不利于丛枝菌根真菌的大量筛选和富集。目前尚未发现一种既能富集到大量丛枝菌根真菌孢子，并且有效筛选抗重金属、抗干旱、抗盐碱等逆境抗逆特性丛枝菌根真菌孢子的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服目前丛枝菌根真菌孢子筛选方法所存在的效率低并获得丛枝菌根真菌孢子含量少的缺陷，而公开一种丛枝菌根真菌孢子富集筛选方法及装置。

本发明丛枝菌根真菌孢子富集筛选装置的技术方案是：

在上面敞开的箱体内分别垂直设置三道400目滤布6，使箱体自然形成主培养容器1、主富集容器3、主富集容器3与副培养容器2，在主培养容器1与副培养容器2底部分别开有若干个排水孔。

利用上述丛枝菌根真菌孢子富集筛选装置进行筛选的方法如下：

a.在主培养容器1中填充野外逆境环境中采集的新鲜宿主根际土作为培养基质，将无菌的宿主植株种植在培养基质中；

b.在主富集容器3中填充粒径为1-2mm的无菌基质至容积二分之一；

c.在副培养容器2中填充粒径为1-2mm的无菌基质，将无菌的宿主植株种植在无菌基质中；

d.在副富集容器4中填充粒径为1-2mm的无菌河沙至富集容器容积二分之一；

e在植株培养60天内每隔15天向主培养容器1与副培养容器2中浇灌十分之一倍磷浓度的hoagland营养液，保持培养基质湿润；

f.60天后向主富集容器1中施加hoagland营养液至培养基质为湿润状态，将富集容器用pe保鲜膜封口，并间隔30天补充一次营养液；

g.在植株培养120天后向副富集容器4中施加含有逆境因子的hoagland营养液至培养基质为湿润，将富集容器用pe保鲜膜封口，并间隔30天补充一次hoagland营养液；

h.在植株培养240天后保持副培养容器2半干旱状态，并在第270天后收集副富集容器4中的培养基质，通过湿筛倾析法即可得到大量具有抗逆特性的丛枝菌根真菌孢子。

本发明相比于普通盆栽富集方法，通过在培养容器和富集容器之间设立磷梯度，诱导丛枝菌根真菌在富集容器中大量产孢，由于丛枝菌根真菌的繁殖需要充足的空气，因此在主富集容器和副富集容器中预留了一半的空间，以便于丛枝菌根真菌的有氧呼吸过程。副培养容器中的植物由于没有受到胁迫的影响，植物光合作用效率高，可以为副富集容器中的真菌提供充足的碳源。此时副富集容器中还含有一定程度的逆境胁迫，会对副富集容器中的丛枝菌根真菌产孢起筛选作用，从而得到大量具有抗逆特性的丛枝菌根真菌孢子，以便于后续菌种的分离和研究。本发明所需要的材料，以及培养方式在一般的实验室条件下均可达到，与毛状根繁殖丛枝菌根真菌孢子方法相比，该装置及方法不必考虑孢子污染的问题，操作使用简单，且装置可重复利用，可行性高。

附图说明

附图1是本发明主视结构剖面示意图。

附图2是本发明俯视结构示意图。

附图标记说明如下：

主培养容器1，副培养容器2，主富集容器3，副富集容器4，排水孔5，滤布6。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明，本实施例只是为了解释本发明而不是限制本发明：

本发明丛枝菌根真菌孢子富集筛选装置的技术方案是：

在上面敞开的箱体内分别垂直设置三道400目滤布6，使箱体自然形成主培养容器1、主富集容器3、主富集容器3与副培养容器2；在主培养容器1与副培养容器2底部分别开有六干个排水孔。

利用上述丛枝菌根真菌孢子富集筛选装置进行筛选的方法如下：

a.在主培养容器1中填充重金属污染区、干旱半干旱区或盐碱地的新鲜宿主根际土作为培养基质，将宿主植株种植在培养基质中；

b.在主富集容器3中填充粒径为1-2mm的无菌基质至容积二分之一；

c.在副培养容器2中填充粒径为1-2mm的无菌基质，将无菌的宿主植株种植在无菌基质中；

d.在副富集容器4中填充粒径为1-2mm的无菌河沙至富集容器容积二分之一；

e在植株培养60天内每隔15天向主培养容器1与副培养容器2中浇灌十分之一倍磷浓度的hoagland营养液20ml，保持培养基质湿润；

f.60天后向主富集容器1中施加hoagland营养液50ml至培养基质为湿润状态，将富集容器用pe保鲜膜封口，并间隔30天补充一次营养液20ml；

g.在植株培养120天后向副富集容器4中施加含有高浓度重金属离子（如铅浓度10g/l）、peg6000（15%）或高浓度氯化钠（100mmol）的hoagland营养液50ml至培养基质为湿润状态，将富集容器用pe保鲜膜封口，并间隔30天补充一次hoagland营养液20ml；

h.在植株培养240天后保持副培养容器2半干旱状态，并在第270天后收集副富集容器4中的培养基质，通过湿筛倾析法即可得到大量具有耐重金属、耐干旱或耐盐碱特性的丛枝菌根真菌孢子。

技术特征：

技术总结
本发明丛枝菌根真菌孢子富集筛选装置，是在箱体内分别设置滤布，使箱体形成主培养容器、主富集容器、主富集容器与副培养容器，在主培养容器与副培养容器底部分别开有排水孔。在主培养容器中填充培养基质，将无菌的宿主植株种植在培养基质中；在主富集容器与副培养容器中填充无菌基质并种植宿主植株；在副富集容器中填充无菌河沙并施加含有逆境因子的营养液，收集培养基质并通过湿筛倾析法得到大量具有抗逆特性的丛枝菌根真菌孢子。本发明所需要的材料，以及培养方式在一般的实验室均可达到，与毛状根繁殖丛枝菌根真菌孢子方法相比，该装置及方法不必考虑孢子污染的问题，操作使用简单，且装置可重复利用，可行性高。

技术研发人员：唐明;张翔宇;陈辉;张好强
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2018.12.15
技术公布日：2019.02.19