用于血液、口腔拭子进行PCR的裂解液及试剂盒的制作方法

本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及用于血液、口腔拭子进行pcr的裂解液及试剂盒。

背景技术：

pcr，即聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)是在模板dna、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于dna聚合酶的酶促合成反应技术。该技术自从美国cetus公司人类遗传室karymullis及同事于1958年发明以来，在微生物学、遗传病学和法医等领域中得到广泛应用。

实时荧光定量pcr技术(qpcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出，该技术是指在pcr反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。taqman探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变(snp分型)，其有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。与普通的pcr相比，荧光定量pcr技术检测由于具有特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快和全封闭反应等优点，使其在医学、农学和临床检测学中得广泛使用。

在进行荧光定量pcr检测前，首先要提取样本的核酸。目前核酸提取的主要方法有：磁珠法、离心柱法和酚氯仿抽提法。这些方法均存在一些不足：1)前两者提取成本高，提取效率偏低；2)传统的酚氯仿抽提法存在着提取步骤繁琐及纯度不足的问题。另外，核酸提取过程中，由于受到操作者的熟练程度及实验条件的影响，常造成dna污染或者提取量不足，这将导致后续的研究或者检测不能进行。

因此，寻找不需要核酸提取直接pcr的方法对提高检测效率和质量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于血液、口腔拭子进行pcr的裂解液及试剂盒，本发明试剂盒包含裂解液，全血、口腔拭子裂解后可直接进行pcr，大大优化现有的检测技术：为血液、口腔拭子提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，省略核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于血液、口腔拭子的裂解液，其包含以下浓度的组分：tris-hcl60～70mm、硫酸铵16～17mm、mgcl2·6h2o6～7mm、edta6～7μm、sds1.5～2.5μm和蛋白酶k30～55μg/ml，所述tris-hcl的ph值为8.2～9；裂解液处理后的血液、口腔拭子可直接进行pcr，pcr包括荧光定量pcr。

作为上述技术方案的改进，裂解液包含以下浓度的组分：tris-hcl67mm、硫酸铵16.6mm、mgcl2·6h2o6.7mm、edta6.7μm、sds1.7μm和蛋白酶k50μg/ml，所述tris-hcl的ph值为8.8。

另外，本发明还提供所述的裂解液在pcr中的应用。

作为上述技术方案的改进，所述pcr为荧光定量pcr，裂解液在处理血液或口腔拭子时，裂解液与血液或口腔拭子样本的体积比为19:1；样本与样本混匀后，先95℃加热3min，再65℃加热10min，12000rpm离心1min，上清液即为待检测液。

作为上述技术方案的进一步改进，荧光定量pcr的反应体系为18μl，待检测液为2μl。

作为上述技术方案的进一步改进，荧光定量pcr的反应程序为：95℃10min；95℃15s，65℃1min，40个循环；65℃检测荧光信号。

另外，本发明还提供一种用于血液、口腔拭子进行pcr的试剂盒，其包含所述的裂解液，所述pcr包括荧光定量pcr。

作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括进行荧光定量pcr的反应液。

作为上述技术方案的进一步改进，进行荧光定量pcr的所述反应液包含dna聚合酶、引物、dntps、荧光染料和无核酸酶水。

作为上述技术方案的进一步改进，进行荧光定量pcr的所述反应液包含dna聚合酶、引物、dntps、taqman探针和无核酸酶水。

本发明的有益效果在于：本发明提供用于血液、口腔拭子进行pcr的裂解液及试剂盒，本发明试剂盒包含裂解液，全血、口腔拭子裂解后可直接进行pcr，大大优化现有的检测技术；其具有以下优点：

1)抗干扰能力强，不受血液、口腔拭子中组分影响；

2)样本中dna产量明显高于使用商业化的核酸提取试剂盒；

3)简单易行，大部分实验室均能操作；

4)步骤简单，成本低廉；

5)节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。

附图说明

图1显示实施例4中样本1的snp分型的检测结果；

图2显示实施例4中样本2的snp分型的检测结果；

图3显示实施例4中样本3的snp分型的检测结果；

图4显示实施例5中样本的snp分型的检测结果；其中，i、ii和iii表示1例口腔拭子样本分成3份，上述3条曲线是fam标记的，下面3条曲线是vic标记的；

图5显示实施例6中1号样本的snp分型的检测结果；其中，1fam和1vic标记的曲线采用的方法是提取血液dna后再进行qpcr，1’fam和1’vic标记的曲线是采用发明方法获得；

图6显示实施例6中2号样本的snp分型的检测结果；其中，2fam和2vic标记的曲线采用的方法是提取血液dna后再进行qpcr，2’fam和2’vic标记的曲线是采用发明方法获得；

图7显示实施例6中3号样本的snp分型的检测结果；其中，3fam和3vic标记的曲线采用的方法是提取血液dna后再进行qpcr，3’fam和3’vic标记的曲线是采用发明方法获得；

图8显示实施例7中血液dna的凝胶电泳结果；其中，m为maker，a为商业化核酸提取试剂盒提取的dna，b为本发明裂解液中dna，b的亮度明显高于a的亮度。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种裂解液，其由下浓度的组分组成：tris-hcl67mm、硫酸铵16.6mm、mgcl2·6h2o6.7mm、edta6.7μm、sds1.7μm和蛋白酶k50μg/ml，tris-hcl的ph值为8.8。

实施例2

本实施例提供一种裂解液，其由下浓度的组分组成：tris-hcl70mm、硫酸铵17mm、mgcl2·6h2o7mm、edta7μm、sds2.5μm和蛋白酶k55μg/ml，tris-hcl的ph值为9。

实施例3

本实施例提供一种裂解液，其由下浓度的组分组成：tris-hcl60mm、硫酸铵16mm、mgcl2·6h2o6mm、edta6μm、sds1.5μm和蛋白酶k30μg/ml，tris-hcl的ph值为8.2。

以下样本检测采用实施例1的裂解液，检测中所用的pcr扩增仪器为天隆tl988。

取正常人全血样本，对其snp位点进行实时荧光定量pcr检测

实施例4

1)取保存于edta管中3例人全血样本各3μl，分别加入含57μl裂解液的离心管中，分别作为1号样本、2号样本、3号样本，涡旋混匀和短暂离心，95℃加热3min，再65℃加热10min；12000rpm离心1min，上清液即为待检测液；

2)3个样本待检测液各取2μl，分别加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪上进行扩增，95℃15min，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

如图1～3所示，图1、2和3分别为1号样本、2号样本和3号样本的实验结果；结果表明，按照本发明方法进行操作，可以有效准确清晰地对snp进行分型。

重复性检测：取同一人血液样本，分成三份，对其snp位点进行实时荧光定量pcr检测

实施例5

1)取保存于edta管中1例人的血液样本平均分成3份，每份取3μl，分别加入含57μl裂解液的离心管中，分别作为1号样本、2号样本、3号样本，涡旋混匀和短暂离心，95℃加热3min，再65℃加热10min；12000rpm离心1min，上清液即为待检测液；

2)3个样本待检测液各取2μl，分别加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪上进行扩增，95℃15min，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

如图4所示，杂合型样本的的重复性好，本发明方法的检测可重复。

对血液进行核酸提取与本发明进行对比，对其snp位点进行实时荧光定量pcr检测

实施例6

1)取3例人全血样本各3μl，分别加入含57μl裂解液的离心管中，分别作为1号样本、2号样本和3号样本，涡旋混匀和短暂离心，95℃加热3min，再65℃加热10min；12000rpm离心1min，上清液即为待检测液；

2)3个样本待检测液各取2μl，分别加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪上进行扩增，95℃15min，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

如图5～7所示，结果表明，采用本发明裂解液进行操作完全可以省略核酸提取步骤，且能有效准确、清晰地对snp进行分型。

样本dna提取量

实施例7

采用本发明裂解液对血液进行裂解，裂解后进行凝胶电泳；采用市场购买的试剂盒提取血液中dna，提取后进行凝胶电泳。

如图8所示，本发明裂解液中dna的量更高。

以上仅列出本发明实施例1中裂解液进行性能测定，本发明其他实施例中裂解液也可以取得类似的技术效果。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。