一种D-塔格糖联产乙醇的方法与流程

本发明涉及一种d-塔格糖联产乙醇的方法，具体涉及一种以乳糖或乳清溶液为原料，以β-半乳糖苷酶和l-阿拉伯糖异构酶活力保存、但葡萄糖酵解途径的酶活力丧失的重组大肠杆菌为生物催化剂生产d-塔格糖，以及以酿酒酵母发酵生产乙醇的方法。

背景技术：

d-塔格糖是d-半乳糖的同分异构体，属于一种稀有的己酮糖。因为其具有蔗糖92％的甜度，但卡路里只有蔗糖的30％，且血糖指数很低(葡萄糖的3％、蔗糖的4.4％)，在摄入人体后不易导致血糖升高，因此常被添加到低糖低热量食品中。2001年，美国食品药品监督管理局(fda)将d-塔格糖确定为公认安全食品(gras)。

d-塔格糖的生产多以d-半乳糖为底物，在l-阿拉伯糖异构酶(l-ai，ec5.3.1.4)或者含有l-ai的重组细胞的催化下异构化为d-塔格糖。为了降低成本，在生物催化法生产d-塔格糖时，以价格较为低廉的乳糖或者乳清为原料更为经济。乳糖经β-半乳糖苷酶水解可得到d-半乳糖和d-葡萄糖，其中的d-半乳糖经l-ai催化可生产d-塔格糖。但是，以乳糖为底物利用生物催化法生产d-塔格糖时，产物是d-葡萄糖、d-半乳糖和d-塔格糖的混合物。由于这三种单糖结构类似，致使d-塔格糖的分离纯化非常复杂。将混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖转化成与d-塔格糖结构差异较大的产物，是一种简单可行的分离纯化方法。

现有技术都是利用外源表达β-半乳糖苷酶和l-ai的重组微生物实现乳糖至d-塔格糖的生产。利用只外源表达l-ai的重组大肠杆菌粗酶液实现乳糖至d-塔格糖生产的方法未见报道。现有技术没有重视混合糖液中d-塔格糖的分离纯化，更没有重视d-葡萄糖和d-半乳糖的高值化利用，致使d-葡萄糖在生物催化过程中被微生物细胞进一步代谢为多种发酵产物，这不仅造成碳源浪费，也使得d-塔格糖的分离纯化更为复杂。将混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖选择性转化成某一特定高附加值产品或大宗化学品，同时d-塔格糖不被消耗的方法未见报道。

技术实现要素：

针对已报道的制备方法中d-塔格糖得率低、产物分离纯化困难、以及混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖未能高值化利用的问题，本发明要解决的问题是利用含l-ai的重组大肠杆菌粗酶液催化乳糖或者乳清生产d-塔格糖且不代谢混合糖液中的d-葡萄糖，之后利用酿酒酵母发酵混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖生成乙醇且不代谢d-塔格糖。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种d-塔格糖联产乙醇的方法，以乳糖或乳清(乳清中含有大量乳糖)为底物，β-半乳糖苷酶和l-阿拉伯糖异构酶为催化剂，得到含有d-塔格糖的混合糖液，该混合糖液中还含有d-葡萄糖和d-半乳糖，再利用酿酒酵母将混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖发酵生成乙醇；

其中，所述l-阿拉伯糖异构酶来源于耐热微生物，l-阿拉伯糖异构酶最适温度高于50℃，l-阿拉伯糖异构酶在45～65℃热稳定性良好。所述的l-ai优选来源于嗜热芽孢杆菌cctccno.m2011468或凝结芽孢杆菌dsmno.23183并将其279位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸的l-ai^f279i。

本发明中使用的β-半乳糖苷酶为大肠杆菌内源酶，本发明将得到的粗酶液置于45～65℃水浴中处理0.5～5小时后，仍然可以得到d-塔格糖，说明该酶在45～65℃热稳定性良好，仍然能够催化乳糖分解为d-葡萄糖和d-半乳糖。

所述d-塔格糖联产乙醇的方法具体包括如下步骤：

(1)培养表达l-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌bl21(de3)；

(2)制备包含β-半乳糖苷酶和l-阿拉伯糖异构酶的粗酶液；

(3)对步骤(2)得到的粗酶液进行热变性处理，使β-半乳糖苷酶和l-阿拉伯糖异构酶保存活力，而重组大肠杆菌bl21(de3)中参与葡萄糖酵解途径的酶活力丧失，得到催化剂；

(4)以乳糖或者乳清为底物，步骤(3)得到的含有β-半乳糖苷酶和l-阿拉伯糖异构酶的粗酶液为催化剂，制备含有d-葡萄糖、d-半乳糖和d-塔格糖的混合糖液；

(5)利用酿酒酵母将混合糖液中的d-葡萄糖和d-半乳糖发酵生成乙醇，同时保留d-塔格糖。

其中，所述l-阿拉伯糖异构酶来源于耐热微生物，l-阿拉伯糖异构酶最适温度高于50℃，l-阿拉伯糖异构酶在45～65℃热稳定性良好。

步骤(1)中，所述重组大肠杆菌bl21(de3)的构建方法如下：

将l-阿拉伯糖异构酶核苷酸序列克隆到表达质粒中，l-阿拉伯糖异构酶核苷酸序列优选seqidno.1所示的序列，所述表达质粒为petduet-1，得到重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，既得到所述重组大肠杆菌bl21(de3)。

步骤(3)中，所述的热变性步的方法如下：取步骤(2)制得的粗酶液置于45～65℃水浴中处理0.5～5小时，热变性温度优选为50～55℃，热变性处理时间优选为1～2小时。

步骤(4)中，底物乳糖的浓度为40～400g/l(底物或者为乳糖含量为40～400g/l的乳清溶液)，乳糖浓度优选为100～200g/l，l-阿拉伯糖异构酶的活力为6～16u/g乳糖，l-阿拉伯糖异构酶添加量优选为10～14u/g乳糖，催化温度为45～65℃，ph值为5.5～8.0，ph值优选为6.0～6.5，反应体系中mn²⁺或者co²⁺浓度为1mm，催化时间为0.5～12小时。

步骤(5)中，所述的酿酒酵母能发酵d-葡萄糖和d-半乳糖为乙醇，但不能代谢d-塔格糖。

步骤(5)中，在混合糖液中添加0.8～1.6g/l硫酸铵、0.2～0.6g/l氯化锌、0.2～0.6g/l硫酸镁和0.7～1.3g/l氯化钙，优选在混合糖液中添加1.2g/l硫酸铵、0.4g/l氯化锌、0.4g/l硫酸镁和1g/l氯化钙，接入酿酒酵母cctccay2018004至初始菌体浓度为od600＝10，发酵过程初始ph为6.0，发酵温度为30℃。

有益效果：

(1)重组大肠杆菌只需要外源表达l-ai，操作简单。

(2)以价格低的乳糖或者乳清为底物生产d-塔格糖，成本低。

(3)d-塔格糖得率高。

(3)乳糖水解产物不被大肠杆菌代谢，有利于后续分离纯化。

(4)乳糖水解产物不被大肠杆菌代谢，可后续用于乙醇生产，实现了底物的全值化利用。

(5)酿酒酵母选择性发酵d-葡萄糖和d-半乳糖为乙醇，有利于后续分离纯化。

附图说明

图1是生物催化剂制备过程示意图。

图2是以乳清为原料，d-塔格糖和乙醇联产工艺流程示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不限制权力要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中乳糖、d-半乳糖、d-葡萄糖和d-塔格糖产量的检测方法如下：采用agilent1200液相色谱仪，配备sugar-pak1(6.5×300mm，waters)分离柱，柱温80℃，流动相为去离子水，流速0.4ml/min，进样量10μl，采用示差折光检测器，检测器控温35℃。

以下实施例中乙醇产量的检测方法如下：采用agilent1200液相色谱仪，配备bio-radaminexhpx-87h(7.8×300mm，agilent)分离柱，柱温55℃，流动相为5mmh2so4，流速0.6ml/min，进样量10μl，采用示差折光检测器。

以下实施例中l-ai酶活单位u定义为每分钟生成1μmold-塔格糖所需要的酶量。

实施例1：重组大肠杆菌bl21(petduet-araa^f279i)的构建。

采用常规方法提取嗜热芽孢杆菌cctccno.m2011468的基因组dna，并使用合成的引物以嗜热芽孢杆菌cctccno.m2011468的基因组dna为模板，扩增其编码l-ai的基因araa。

引物序列如下：

上游引物5’-cgcggatccgatgttgaaaataaaaga-3’，下划线为bamhi位点；

下游引物5’-ccggaattctgttaaagaagtgcatc-3’，下划线为ecori位点。

利用常规分子克隆操作手段，将pcr扩增得到的dna片段克隆至大肠杆菌表达载体petduet-1的bamhi和ecori酶切位点，得到重组质粒petduet-araa。利用常规基因点突变手段，将l-ai的279位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸，得到重组质粒petduet-araa^f279i。利用常规大肠杆菌转化操作手段，将重组质粒petduet-araa^f279i转化至大肠杆菌bl21(de3)，所得菌株即为重组大肠杆菌bl21(petduet-araa^f279i)。

实施例2：重组大肠杆菌bl21(petduet-araa^f279i)的诱导表达和生物催化剂的制备将大肠杆菌bl21(petduet-araa^f279i)接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养12h，之后转接至500ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养至细胞od600达到0.4～0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg诱导l-ai^f279i的表达，20℃振荡培养8h。诱导结束后，于10000转/分钟离心5分钟，收集细胞沉淀，使用生理盐水洗涤两次，将细胞沉淀重悬于50mm、ph6.0的磷酸盐缓冲中并调整细胞od600为60。利用超声波破碎细胞，破碎时间为20分钟，破碎液于10000转/分钟离心10分钟，收集上清液，在50℃水浴锅中保温3小时，然后以10000转/分钟离心5分钟，收集粗酶液，即为本发明所用的生物催化剂。

实施例3：以乳糖为底物，利用实施例2制得的生物催化剂制备d-塔格糖

反应总体系为10ml，底物为浓度200g/l的乳糖，加入实施例2得到的生物催化剂，l-ai用量为14u/g乳糖，加入终浓度为1mm的mnso4溶液，反应体系的初始ph为6.0，混匀后在50℃震荡反应12小时。反应结束后，将反应混合物离心去除固体杂质，取上清液检测乳糖消耗量和d-塔格糖生成量。结果显示，乳糖完全水解，d-塔格糖产量为51.2g/l。

实施例4：以乳清为底物，利用实施例2制得的生物催化剂制备d-塔格糖

反应总体系为10ml，底物为含浓度200g/l乳糖的乳清，加入实施例2得到的生物催化剂，l-ai用量为14u/g乳糖，加入终浓度为1mm的mnso4溶液，反应体系的初始ph为6.0，混匀后在50℃震荡反应12小时。反应结束后，将反应混合物离心去除固体杂质，取上清液检测乳糖消耗量和d-塔格糖生成量。结果显示，乳糖完全水解，d-塔格糖产量为48.9g/l。

实施例5：利用实施例3所得混合糖液发酵生产乙醇

在实施例3得到的混合糖液中添加3g/l酵母浸膏、1.2g/l硫酸铵，0.4g/l氯化锌，0.4g/l硫酸镁和1g/l氯化钙，接入酿酒酵母cctccay2018004至初始菌体浓度为od600＝10，发酵过程初始ph为6.0，发酵温度为30℃，在反应过程中间取样检测d-半乳糖、d-葡萄糖、d-塔格糖和乙醇的含量变化。结果显示，d-塔格糖的含量维持不变，d-半乳糖和d-葡萄糖被酿酒酵母完全代谢转化为乙醇。36小时后，乙醇产量为52.8g/l。

实施例6：利用实施例4所得混合糖液发酵生产乙醇

在实施例4得到的混合糖液中添加1.2g/l硫酸铵，0.4g/l氯化锌，0.4g/l硫酸镁和1g/l氯化钙，接入酿酒酵母至初始菌体浓度为od600＝10，发酵过程初始ph为6.0，发酵温度为30℃，在反应过程中间取样检测d-半乳糖、d-葡萄糖、d-塔格糖和乙醇的含量变化。结果显示，d-塔格糖的含量维持不变，d-半乳糖和d-葡萄糖被酿酒酵母完全代谢转化为乙醇。36小时后，乙醇产量为54.9g/l。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种d-塔格糖联产乙醇的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1422

<212>dna

<213>嗜热芽孢杆菌cctccno.m2011468(bacillusthermophiluscctccno.m2011468)

<400>1

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<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgcggatccgatgttgaaaataaaaga27

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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