本发明属于天然活性物质提取
技术领域：
，具体涉及一种均一性绿藻活性肽的制备方法。
背景技术：
：多级逆流固液提取技术是一种固相物料和溶剂相对运动方向相反、连续定量加入固相物料和溶剂并导出残留物和提取液的连续分离技术。在有效成分的提取过程中，固体与液体呈反方向流动，含有有效成分的溶剂在流出体系前与新鲜的原料接触，而经过多次提取的原料在流出体系前与新鲜的溶剂接触，从而使有效成分提取完全。与传统的提取方法相比具有显著的优点：(1)有效成分浸出速率快，产品得率高；(2)可连续工作，适用于大规模生产；(3)节省溶剂用量，浸出液浓度高，同时降低了后续处理操作；(4)可有效节约能源，产量大；(5)所需提取温度低，既适合热稳定性好的物料的提取，也适用于热敏性物质的提取。综上，将多级逆流提取工艺制备活性肽是可行的。自2007年以来，我国黄渤海海域连年爆发浒苔绿潮，对海洋运输、海水养殖及旅游观光造成严重影响。绿藻浒苔富含多种营养成分，如多糖、蛋白、不饱和脂肪酸、维生素以及矿物质等。目前海藻提取物比较局限在海藻多糖、海藻胶类产品，经济效益及资源利用率低。海藻活性肽的研究历史较短，大部分研究应集中在大豆蛋白肽、鱼蛋白肽等，主要用于降低胆固醇、降血压以及提高人体免疫力等。海藻活性肽因其特殊的生物活性，越来越受到科学家的关注，我国对于海藻活性肽研究基础较少，工业化产品更少。专利201610488495.6公开了一种从海藻中提取低聚肽制作海藻低聚肽粉的方法，具体步骤包括将海藻洗净、晒干，粉碎，得到海藻粉；加水、磨浆；将海藻浆液加热，调节ph至3.3～4.0，加入果胶酶，搅拌酶解；加入naoh，调节ph至7.0～9.0，加入复合蛋白酶，搅拌酶解；升温灭酶，固液分离，收集液相；采用膜过滤方法处理清液，收集透过液；将透过液进行电渗析、活性炭精制、脱炭，蒸发浓缩、干燥得海藻低聚肽粉，其所得小肽的分子量大多小于2000da。综合分析现有技术，为了提高海藻多肽的提取率，多利用酶解或复合酶解工艺将海藻蛋白降解为小肽，大多低于2000da，而对于抗氧化活性较好小肽定向制备缺乏精准性控制技术，产品的均一性较差，因此，建立高抗氧化活性海藻小肽(如分子量3000-4000da)的关键技术技术，提高绿藻小肽的均一性成为本行业领域亟需解决的技术问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种均一性绿藻活性肽的制备方法，通过建立的多级逆流提取-酶解膜分离集成工艺生产绿藻活性肽，提取率高、可连续生产、活性肽分子量均一可控，抗氧化能力强；提取蛋白后的残渣、滤液可作为原料用于生产海藻肥。为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：本发明所述的一种均一性绿藻活性肽的制备方法，其具体包括以下步骤：(1)以绿藻粉为原料，采用多级逆流提取技术，维持固液比1:5-1:10，温度40-60℃，ph9-11，提取绿藻蛋白；(2)将上述提取液采用蛋白酶酶解3-6h，得到绿藻蛋白酶解液；(3)将上述酶解液通过分子量为3kda和4kda的超滤膜，得浓缩液并高温灭酶；(4)将酶解液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥后活性肽的水分含量≦10％，即得到绿藻活性肽粉末，其中喷雾干燥的进风温度为180-200℃，流速为2-5ml/min。上述步骤(1)中提取溶剂为氢氧化钠弱碱溶液，并添加1％的纤维素酶、0.5％果胶酶。优选地，上述提取绿藻蛋白采用罐组式五级逆流提取技术，维持固液比1:8，温度55℃，ph10。上述步骤(2)中所述蛋白酶为复合蛋白酶，其添加量为绿藻质量比的3％；复合蛋白酶的组成为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，质量比为2:1。优选的，上述步骤(2)采用复合蛋白酶酶解4h，分子量趋于稳定，采用超滤膜分离后，可以提高多肽均一稳定性。优选地，所述步骤(3)中将绿藻蛋白酶解液加热至90℃保温15min灭酶灭菌。本发明申请保护按照上述制备方法制备得到的绿藻活性肽。小肽含量为90％以上，分子量3-4kda。本发明与现有技术相比，其优势在于：1)采用多级逆流提取-酶解膜分离集成工艺，产品得率高可达90％以上，与多糖分离率达95％以上，可连续工作，分子量均一可控，均一度高；2)与现有技术不同的是，提取过程采用罐组式多级逆流提取技术，提取溶剂中加入一定量的纤维素酶和果胶酶，有效成分浸出速率快，产品得率高，可节省溶剂用量，可连续工作，适合大规模生产；3)采用木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶复合酶法制备，反应条件温和，酶解过程易于控制，提取蛋白后的残渣、滤液可作为原料用于生产海藻肥，对环境友好；4)本发明通过建立多级逆流提取-酶解膜分离集成工艺技术生产绿藻活性肽，克服了现有技术中为了提高绿藻多肽提取率而彻底降解多肽的技术弊端，本申请既实现了绿藻多肽的高提取率，而且得到了分子量均一性强、功能活性好的绿藻多肽。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1浒苔活性肽的制备一种浒苔活性肽的制备方法，其具体包括以下步骤：(1)采用浒苔粉为原料，采用罐组式5级逆流提取技术，维持固液比1:8，温度55℃，ph10，提取绿藻蛋白；提取溶剂为氢氧化钠弱碱溶液，并添加1％的纤维素酶、0.5％果胶酶；(2)将上述蛋白液采用木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶复合酶解4h，得到浒苔蛋白酶解液；上述复合酶添加量为绿藻质量比的3％，其中木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，质量比为2:1；(3)将上述提取液通过分子量为3kda和4kda的超滤膜，得浓缩液，加热至90℃保温15min灭酶；(4)将酶解液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥后活性肽的水分含量≦10％，即得到浒苔活性肽粉末，其中喷雾干燥的进风温度为200℃，流速为3ml/min；经检测，本实施例所制得的浒苔活性肽中，提取率为92.4％，酶解率为97.2％，小肽含量达95％以上，分子量为3.25kda。实施例2石莼活性肽的制备方法一种石莼活性肽的制备方法，其具体包括以下步骤：(1)采用石莼粉为原料，采用罐组式5级逆流提取技术，维持固液比1:8，温度55℃，ph10，提取绿藻蛋白；提取溶剂为氢氧化钠弱碱溶液，并添加1％的纤维素酶、0.5％果胶酶；(2)将上述蛋白液采用木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶复合酶解4h，得到石莼蛋白酶解液；上述复合酶添加量为绿藻质量比的3％，其中木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，质量比为2:1；(3)将上述酶解液通过分子量为3kda和4kda的超滤膜，得浓缩液，加热至90℃保温15min灭酶；(4)将酶解液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥后活性肽的水分含量≦10％，即得到石莼活性肽粉末，其中喷雾干燥的进风温度为200℃，流速为3ml/min；经检测，本实施例所制得的石莼活性肽中，提取率为93.7％，酶解率为97.8％，小肽含量达95％以上，分子量为3.41kda。实施例3活性肽抗氧化能力试验将实施例1、2中所制备得到的绿藻活性肽作为抗氧化剂与抗坏血酸进行对比试验，测定其清除dpph、abts、羟自由基能力，试验结果见表1：表1绿藻活性肽抗氧化活性评价由上表可知，将实施例1、2所制备得到的绿藻活性肽作为抗氧化剂用于实施例3的实验，表明本发明绿藻活性肽能有效的清除dpph、abts、羟自由基，具有明显的抗氧化活性。实施例4不同制备工艺对绿藻活性肽提取率的影响进行不同制备工艺对绿藻活性肽提取率及抗氧化活性的影响。其中对照组不经过复合蛋白酶解直接进行膜过滤、喷雾干燥，其余工艺同实施例1；对照实施例1采用木瓜蛋白酶单一酶解，其余工艺条件同实施例1；对照实施例2采用枯草杆菌蛋白酶单一酶解，其余工艺条件同实施例1；实验结果如表2所示：表2不同制备工艺对绿藻活性肽提取率的影响组别实施例1对照组对照实施例1对照实施例2提取率(％)92.428.368.342.7由表2可知本申请采用的复合酶解显著提升了绿藻多肽的提取率，说明木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶具有显著的协同增效作用。此外，在本发明创造过程中试验结果表明木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的配比对活性肽的提取率和抗氧化活性均具有显著的影响(p<0.01)。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12