产生细胞囊和细胞囊管的方法与流程

本发明涉及产生细胞囊和细胞囊管的领域，及其方法和组合物。

背景技术：

细胞边界将细胞与外部环境分开，允许和保护细胞内活动和内容物免受环境因素的不良影响。细胞边界对细胞的感知、迁移、入侵、重定位、增殖、生长、分化、与环境的交流和响应、营养和氧气的摄入、代谢废物的排除以及抵御环境压力至关重要。

多细胞生物体的细胞运动对胚胎发育(ledouarinnm(1984)cellmigrationsinembryos.cell38(2):353-360；reigg,pulgare,&conchaml(2014)cellmigration:fromtissueculturetoembryos.development141(10):1999-2013；richardsonbe&lehmannr(2010)mechanismsguidingprimordialgermcellmigration:strategiesfromdifferentorganisms.natrevmolcellbiol11(1):37-49)、器官稳态(acloqueh,adamsms,fishwickk,bronner-fraserm,&nietoma(2009)epithelial-mesenchymaltransitions:theimportanceofchangingcellstateindevelopmentanddisease.thejournalofclinicalinvestigation119(6):1438-1449)、组织再生(bryantdm&mostovke(2008)fromcellstoorgans:buildingpolarizedtissue.natrevmolcellbiol9(11):887-901)、免疫应答(woodlanddl&kohlmeierje(2009)migration,maintenanceandrecallofmemorytcellsinperipheraltissues.natrevimmunol9(3):153-161；weningerw,birom,&jainr(2014)leukocytemigrationintheinterstitialspaceofnon-lymphoidorgans.natrevimmunol14(4):232-246)、伤口修复(gurtnergc,werners,barrandony,&longakermt(2008)woundrepairandregeneration.nature453(7193):314-321)以及肿瘤扩散(friedlp&alexanders(2011)cancerinvasionandthemicroenvironment:plasticityandreciprocity.cell147(5):992-1009；friedlp&wolfk(2003)tumour-cellinvasionandmigration:diversityandescapemechanisms.natrevcancer3(5):362-374；barbolinamv,etal.(2009)microenvironmentalregulationofovariancancermetastasis.cancertreatres149:319-334)至关重要。三维(3d)微环境中的细胞迁移经历了异质细胞和细胞外基质(ecm)，其为运动方向提供支架和引导线索，同时基本上形成了阻碍细胞运动的环境障碍(thieryjp,acloqueh,huangry,&nietoma(2009)epithelial-mesenchymaltransitionsindevelopmentanddisease.cell139(5):871-890；franzcm,jonesge,&ridleyaj(2002)cellmigrationindevelopmentanddisease.devcell2(2):153-158)。为了促进运动，细胞自适应地产生随时空变化而变化的表面连接的细胞器和隔室，包括板状伪足(murphyda&courtneidgesa(2011)the'ins'and'outs'ofpodosomesandinvadopodia:characteristics,formationandfunction.natrevmolcellbiol12(7):413-426)、丝状伪足(mattilapk&lappalainenp(2008)filopodia:moleculararchitectureandcellularfunctions.natrevmolcellbiol9(6):446-454)、伪足小体(podosome)(taroneg,cirillod,giancottifg,comogliopm,&marchisiopc(1985)roussarcomavirus-transformedfibroblastsadhereprimarilyatdiscreteprotrusionsoftheventralmembranecalledpodosomes.expcellres159(1):141-157)、侵袭性伪足(chenwt(1989)proteolyticactivityofspecializedsurfaceprotrusionsformedatrosettecontactsitesoftransformedcells.jexpzool251(2):167-185)、泡状伪足(facklerot&grosser(2008)cellmotilitythroughplasmamembraneblebbing.jcellbiol181(6):879-884；ridleyaj(2011)lifeattheleadingedge.cell145(7):1012-1022)、黏着斑(wehrle-hallerb(2012)structureandfunctionoffocaladhesions.currentopinionincellbiology24(1):116-124)、树突状伪足突起和ii型上皮桥(zanibg,indolfil,&edelmaner(2010)tubularbridgesforbronchialepithelialcellmigrationandcommunication.plosone5(1):e8930)。因而，多细胞生物体中细胞重定位的机制尚不清楚。

3d细胞迁移中的细胞形态、使用的细胞器以及机制和信号控制通常不同于2d细胞迁移对应的特征(bakerbm&chencs(2012)deconstructingthethirddimension:how3dculturemicroenvironmentsaltercellularcues.jcellsci125(pt13):3015-3024；wuph,giria,sunsx,&wirtzd(2014)three-dimensionalcellmigrationdoesnotfollowarandomwalk.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica111(11):3949-3954；friedlp,sahaie,weisss,&yamadakm(2012)newdimensionsincellmigration.natrevmolcellbiol13(11):743-747)。在富含胶原蛋白的3d基质中运动的细胞不存在板状伪足或丝状伪足，但显示出高度的树突状的伪足突起，这在刚性板的表面上并不存在(jayatilakah,etal.(2017)synergisticil-6andil-8paracrinesignallingpathwayinfersastrategytoinhibittumourcellmigration.naturecommunications8:15584；giria,etal.(2013)thearp2/3complexmediatesmultigenerationdendriticprotrusionsforefficient3-dimensionalcancercellmigration.fasebjournal:officialpublicationofthefederationofamericansocietiesforexperimentalbiology27(10):4089-4099)。

本领域持续需要能够用于理解3d细胞外基质和3d微环境中的细胞运动的方法和组合物。

发明概述

本公开解决了这种需要并且是基于以下发现：即在受控的3d微环境中、例如3d细胞外基质中的细胞，可以产生至少两种类型的新型膜状细胞器，即细胞囊和细胞囊管。细胞囊管提供用于定向细胞运输的管状通路。多个细胞囊管互连并形成管网状网络，用于在不同方向上定向细胞的运输。已发现增强的cap依赖性翻译起始以及包括itgb-2在内的蛋白质表达的增加与细胞囊和细胞囊管的形成和细胞囊管的伸长相关。用于在受控的3d细胞外基质中产生细胞囊和细胞囊管的方法和组合物为理解3d微环境中细胞迁移的机制提供了强有力的工具，这是开发针对与细胞迁移、细胞感应、细胞应激保护、细胞增殖、细胞分化、肿瘤生长、肿瘤发展、肿瘤转移、肿瘤复发和耐药性相关的多种疾病的有效治疗方法的先决条件。

本公开的一个方面提供了一种组合物，其包含3d细胞外基质和细胞囊和细胞囊管。细胞囊和细胞囊管由植入3d基质中或其顶层的细胞产生。

本公开的另一方面提供了一种产生细胞囊和细胞囊管的方法。该方法包括将细胞植入3d基质中或其顶层，并在能够使得细胞产生细胞囊和细胞囊管的条件下孵育植入细胞的3d基质。

本发明的又一方面提供了一种体外生产细胞囊和细胞囊管的方法。该方法包括以下步骤：将单细胞悬浮液中的细胞植入到3d基质的顶层上；在能够使得细胞在3d基质中产生细胞囊和细胞囊管的条件下培养植入细胞的3d基质。

本公开的又一方面提供了一种适于产生细胞囊和细胞囊管的3d基质的制备方法。该方法包括冷冻3d基质，并在合适的温度下解冻3d基质。

应注意，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，如术语“包括”可具有美国专利法中赋予它的含义；例如，它可以表示“包含有”；并且如“基本上由......组成”的术语具有美国专利法中赋予它的含义，例如，它允许未明确引用的元素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本的或新颖的特征的元素。

以下发明详述公开了或者显而易见地可以得到并包含了这些方面和其他实施例。

附图说明

该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。通过结合以下附图对说明性实施例的详细描述，将更全面地理解本发明实施例的前述特征和其他特征及优点，其中：

图1a-1f描绘了产生细胞囊和细胞囊管的图像。图1a显示了产生细胞囊和细长的细胞囊管的图像。在指定条件下，将人乳腺上皮细胞(hmec)植入厚的3dmatrigel凝胶上，产生膜状的细胞质外细胞囊和细长的细胞囊管。图中显示了单个hmec的细胞囊管的荧光图像，其瞬时过表达egfp-pmca2和mcherry-β-肌动蛋白，并显示有细胞囊管。图中显示了hmec(红色箭头)、细胞囊(cc，白色箭头)、细胞囊膜(ccm，橙色箭头)。图1b显示了细胞囊管长度的定量分析。图1c显示了细胞囊的去细胞化的倒置相差明视场显微镜图像。蓝色箭头表示单个hmec产生包裹细胞的大细胞囊(cc，红色箭头)。1小时后，hmec离开细胞囊，剩下脱细胞的细胞囊(ecc，白色箭头)，内部不含细胞。图中显示了细胞囊膜(ccm，橙色箭头)。图1d显示了细胞囊去细胞化的示意图。图1e显示了细胞囊直径尺寸的定量测定。图1f显示了大的膜状的细胞囊(cc，红色箭头)的dic图像(左图)和荧光图像(右图)。比例尺＝10μm。

图2描绘了hmec细胞囊管的网状结构。hmec在细胞囊管中的迁移和网状结构的形成。图中显示了细胞囊管(ct，红色箭头)、细胞囊管连接节点(ctn)、在单个细胞囊管中迁移的多个细胞(橙色箭头)和没有细胞囊管的细胞团(黑色箭头)。

图3a-3b描绘了细胞囊管网络的结构。(图3a)多个bcsc细胞囊管交叉。多个bcsc细胞囊管通过细胞囊管节点(ctn)互连并形成交叉形态。细胞在细胞囊管网络中迁移。(图3b)辐射形态(radicalmorphology)的bcsc细胞囊管(ct，红色箭头)网络。多达五个细胞囊管通过细胞囊管节点(ctn)连接。多个细胞以不同的形态在细胞囊管网络中迁移。比例尺＝10μm。

图4描绘了对bcsc细胞囊管网络系统进行细胞裂解分析的即时成像。通过细胞裂解即时成像得到的细胞囊管网络的明视场图像。图中显示了细胞囊管网络中的嵌套细胞囊管(ct，红色箭头)和细胞囊管节点(ctn)。在细胞裂解缓冲液处理后1-2秒拍摄图像。在裂解缓冲液处理后第3秒，所有细胞囊管和细胞质膜被裂解，并消失。

图5a-5g描绘了细胞囊的融合和细胞进入。(图5a)由两个细胞产生的两个细胞囊管结合的细胞囊管融合后的明视场图像。细胞2位于融合的细胞囊管中。图中显示了融合的细胞囊管(mtp，红色箭头)、融合的细胞囊管膜(mtm，橙色箭头)。(图5b)具有位于融合的大细胞囊中的多个细胞(细胞团)的大细胞囊的融合的dic和荧光显微镜图像。图中显示了融合的细胞囊管膜(mtm，橙色箭头)。(图5c)进入的细胞的定量。(图5d)hmec中内源性合胞素-1的免疫荧光显微镜图像。(图5e)细胞囊管发育期间合胞素-1表达的western印迹图像。(图5f)合胞素-1的敲除降低了hmec细胞囊管的融合。(图5g)合胞素-1的敲除不影响hmec细胞囊管的起始。

图6a-6b描绘了itgb-2调节细胞囊管的伸长。(图6a)在细胞囊管发育期间26个整合素基因的转录变化的热图。(图6b)itgb-2对细胞囊生成和细胞囊管伸长的影响。

发明详述

本发明公开的方面基于迄今未被发现的观察结果，即当细胞在受控的3d细胞外基质中植入和培养时，可以产生两种新的细胞外膜状细胞器，其在本发明中称为细胞囊和细胞囊管。细胞在细胞囊中迁移并产生细胞囊管，其显示出多效生物学功能并为基质内的定向细胞运输提供管状途径。多个细胞囊管形成并互连以产生支持在基质内的不同方向上的定向细胞运输的网状结构。本公开提出了在3d微环境中基于细胞囊管的定向细胞迁移的机制。目前公开的用于产生细胞囊和细胞囊管的方法和组合物将有助于理解多细胞生物胚胎发育、器官稳态、组织再生和免疫应答的机制，以及开发用于治疗和操纵多种疾病和生物学过程的疗法，所述生物学过程包括但不限于细胞迁移、细胞感知、细胞应激保护、细胞增殖、细胞分化、肿瘤生长、肿瘤发展、肿瘤转移、肿瘤复发和耐药性。

如所观察到的，本发明描述的方法中在3d细胞外基质中产生的细胞囊和细胞囊管的生命周期可概述如下。在最初的步骤中，单个/个体细胞产生包围着该细胞的小的、圆形的、胞外的和膜状的细胞囊。随后，细胞囊经历多个发育阶段。第一阶段，细胞囊进行去细胞化。去细胞化的结果是，细胞囊与被脱离的细胞完全分离，并成为无细胞的细胞囊。发明人还观察到细胞囊和被脱离的细胞的不完全分离。在不完全分离的情况下，被驱逐的细胞保持与无细胞的细胞囊的连接，并且可以通过自我进入重新进入所连接的无细胞的细胞囊，并用管腔中的细胞重新封闭细胞囊。第二阶段，细胞囊生长并形成大的(直径/长轴约100-250μm)、圆形的或椭圆形的细胞囊。大的细胞囊可以轻微收缩并形成包围管腔内细胞的收缩的细胞囊。另一方面，来自周围环境的其他细胞可以进入包含细胞的单个大细胞囊，从而形成了包含多个细胞的单个细胞囊。这些大细胞囊的去细胞化产生大的无细胞的细胞囊，其将收缩、瘪掉并形成大的瘪掉的凹盘(或不规则的形态)。第三阶段，细胞在细胞囊中迁移，使细胞囊膜变形并产生细长的细胞囊管。周围细胞的异速生长(alloentry)使得多个细胞进入细胞囊管并在细胞囊管中迁移。均质的和膜封闭的细胞囊管中的细胞迁移(单细胞或多细胞)比由异质细胞外基质(ecm)以及其他细胞和结构组成的异质环境中的细胞迁移更快。据推测，在细胞囊管内，细胞迁移不受ecm、细胞和结构的阻碍。细胞囊管互连并形成分支的、无缝的和膜状的管状网络结构，为在不同方向上定向3d细胞的运输/移动提供管状网络系统。去细胞化的过程产生无细胞的细胞囊和细胞囊管。所有的无细胞的细胞膜和细胞囊管均进行快速的自分解。

根据一个方面，本发明提供了包含3d细胞外基质和细胞囊和细胞囊管的组合物。在一个实施方案中，细胞囊和细胞囊管由植入3d基质中或其顶层的单个细胞产生。在一个实施例中，将细胞植入3d基质的顶层表面。在植入之前，将细胞加工成单细胞悬浮液，密度为约1×10至约1×10⁵个细胞/ml。

根据一个方面，细胞囊和细胞囊管包围着产生细胞囊和细胞囊管的细胞。根据另一方面，细胞囊和细胞囊管包括从周围环境进入细胞囊和细胞囊管的多个细胞。根据另一方面，细胞囊和细胞囊管经历去细胞化并支持封闭的细胞形成没有细胞的无细胞细胞囊和细胞囊管。

根据某些方面，本发明提供了3d基质，其中在近似单个细胞悬浮液中的多个细胞被添加到3d基质中或者其顶层中。在受控条件下孵育细胞植入的3d基质导致单细胞产生细胞囊和细胞囊管。

根据一个方面，3d基质是多孔的。孔隙率可以由用于制备基质材料的分子的聚合和/或交联产生。根据本领域技术人员已知的方法，通过改变交联密度、链长和共聚的支化单体的百分比来控制孔隙率。根据一个方面，3d基质是多孔的，使得额外的试剂可以扩散或以其他方式穿过基质。可以根据本领域技术人员已知的方法制备多孔基质。通过添加额外的交联剂(例如官能化的聚乙二醇)来实现对分子筛尺寸和密度的额外控制。

根据另一方面，3d基质是粘性的。可以根据本领域已知的任何方法调节3d基质的粘度。

根据一个方面，3d基质材料是化学惰性的并且是热稳定的以适应各种温度。根据一个方面，3d基质材料是光学透明的。根据一个方面，3d基质材料是光学透明的，以适用于本领域技术人员已知的3d成像技术。根据一个方面，基质具有足够的光学透明性或者具有适合用于高通量信息读出的深度3d成像的光学性质。

根据一个方面，用于形成基质的材料是可生物降解的。根据另一方面，用于形成基质的材料与各种生物的和非生物的原位样本相容。

根据一个方面，基质的材料可以是半固体培养基，其可以由聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖或交联聚乙二醇制成。在某些方面，半固体培养基可以附着到固体支持物上，例如显微镜载玻片、培养板或流动室上。固体支持物可以附着在半固体培养基的底表面上。

基质的形成材料包括但不限于聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖或交联聚乙二醇。基质的形成材料可通过使用针对于基质形成材料的方法和本领域技术人员已知的方法、试剂和条件聚合和/或交联基质形成材料形成基质。

基质的形成材料还包括但不限于弹性蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角蛋白)和非蛋白聚糖(如透明质酸)。在某些实施方案中，基质的形成材料还可包括蛋白质，包括但不限于原纤维、不连续三螺旋结构的纤维相关胶原(facit)、短链和基底膜蛋白。在其他实施方案中，基质的形成材料可进一步包括信号蛋白，包括但不限于局部粘着斑激酶(fak)、踝蛋白(talin)、纽蛋白(vinculin)、桩蛋白(paxllin)、α-辅肌动蛋白和gtp酶。例如可生物降解的、生物相容的聚合物可以被用作基质材料，包括但不限于乙烯乙酸乙烯酯、聚酐(polyanhydridc)、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(plg)。

根据某些方面，基质与固体支持物结合使用。例如，基质可以以这样的方式聚合，使得基质的一个表面附着到固体支持物(例如，玻璃表面)，而基质的另一个表面暴露或夹在两个固体支持物之间。根据一个方面，基质可以包含在容器内。

本公开的固体支持物可以制成各种形状。在某些实施方案中，固体支持物基本上是平面的。固体支持物的实例包括诸如载玻片、微量滴定板、流动室、盖玻片、微芯片等板，诸如微量离心管、试管等容器，管，片，垫，膜等。另外，固体支持物可以例如是生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合。

已发现基质的某些特征对于在基质中产生细胞囊和细胞囊管是至关重要的。例如，基质的聚合度、蛋白质浓度和粘弹性影响细胞囊和细胞囊管的产生。本公开考虑了从约10％的低聚合到完全100％聚合的广泛程度的基质聚合度。基质聚合度也与基质密度和粘弹性有关。此外，存在于基质中或随后添加到基质中的蛋白质也影响细胞囊和细胞囊管的产生。本公开预期基质内的最终蛋白质浓度为约2-12mg/ml的范围。本发明进一步考虑了ph4-8范围的基质。基质的聚合度、梯度、密度和粘弹性影响基质内细胞迁移的趋化性。在一个实施方案中，3d基质是matrigel。

本公开的细胞包括真核细胞、动物细胞、植物细胞，包括但不限于果蝇细胞、秀丽线虫(c.elegant)细胞等的昆虫细胞。示例性细胞包括任何细胞，人或其他细胞，包括患病细胞或健康细胞。某些细胞包括人细胞、非人细胞、人干细胞、分化细胞、诱导多能干细胞(ipscs)、遗传修饰细胞、人多能细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、肌肉细胞、小鼠干细胞、原代细胞系、永生化细胞系、原代和永生化成纤维细胞、hela细胞和神经元以及肿瘤细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，细胞是人乳腺上皮细胞。在某些实施方案中，细胞是成体的或胚胎的干细胞。在一个实施方案中，细胞是多能干细胞。在另一个实施方案中，细胞是诱导多能干细胞。在又一个实施方案中，细胞是人诱导多能干细胞。根据某些方面，细胞是体外的、体内的或离体的。

根据另一方面，本公开提供了产生细胞囊和细胞囊管的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：将细胞植入3d基质中或其顶层，并在适于产生细胞囊和细胞囊管的温度下孵育植入细胞的3d基质。适合产生细胞囊和细胞囊管的温育温度约为37℃，特定细胞类型之间存在差异。在一个实施例中，在植入之前冷冻3d基质。在某些实施方案中，植入发生在约1-45℃、1-37℃、1-6℃和2-4℃的温度范围内。在其他实施例中，3d基质的厚度在约1-1000μm、2-100μm、5-50μm和5-10μm之间的范围内。

根据某些方面，细胞囊和细胞囊管包围产生细胞囊和细胞囊管的细胞。根据其他方面，细胞囊和细胞囊管允许产生细胞囊和细胞囊管的封闭细胞的排出。根据另一方面，细胞囊和细胞囊管允许多个细胞从周围环境进入。

根据一个方面，在细胞被植入之前，其以约1×10-1×10⁵个细胞/ml的密度呈现为单细胞悬浮液。

细胞囊和细胞囊管的膜具有一定的特征。根据一个方面，细胞囊和细胞囊管的膜包含质膜蛋白ca²⁺atpase2。根据另一方面，syncytin-1(合胞素-1)调节细胞囊管的融合和细胞进入。根据另一方面，生长因子调节细胞囊的生成和细胞囊管的发育。根据另一方面，itgb-2介导细胞囊管中的细胞迁移并调节细胞囊管的伸长。根据另一方面，基质金属蛋白酶介导细胞囊管的伸长。

在某些实施方案中，3d基质包含生物活性的和/或生物非活性的试剂，包括但不限于胶原、matrigel基质材料、弹性蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角蛋白)、非蛋白聚糖(例如透明质酸)、蛋白质(如原纤维、facit、短链和基膜蛋白)和信号蛋白(如fak、踝蛋白、纽蛋白、桩蛋白、α-辅肌动蛋白和gtp酶)。

根据另一方面，本发明提供了一种体外生产细胞囊和细胞囊管的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：将单细胞悬浮液中的细胞植入到3d基质的顶层上；在合适的培养基中和在合适的温度下培养植入的细胞，其中每个单细胞在3d基质中产生细胞囊和细胞囊管。

根据另一方面，本发明提供了一种制备适于产生细胞囊和细胞囊管的3d基质的方法。在一个实施例中，该方法包括：冷冻3d基质，并将3d基质解冻至合适的温度。适于解冻基质的温度在约1-45℃、1-37℃、1-6℃和2-4℃之间。

具体实施方式

给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本发明。本发明的实施例以及本发明所述的方法目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到其中的变化和包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内的其他用途。

实施例1

细胞囊和细胞囊管的产生

为了研究细胞边界和3d细胞运动的机制，将正常的原代人乳腺上皮细胞(hmec)植入3dmatrigel基质中，所述3dmatrigel基质为本公开的某些实施方案中重构的细胞外基质(ecm)替代物。3dmatrigel中的单个球形hmec，而非2d环境中的细胞，产生了圆形/不规则形状和胞外泡状胶囊，其包围细胞，尺寸多变(图1a)。大约96％的单个hmec(在6孔板中1×10³个细胞/孔，n＝3)在12小时时产生了细胞外囊。细胞外球形/椭圆形囊的直径/长轴显著增加，并达到250μm。为了确认囊表面是否为膜状，我们在hmecs中瞬时过表达增强的绿色荧光蛋白(egfp)与质膜蛋白ca²⁺atpase2的融合体(egfp-pmca2)。实际上，egfp-pmca2分布在细胞质膜和细胞外膜囊膜中，证实细胞外囊被膜包围(图1a)。这些细胞外囊可以伸长，形成长度可变的长管(图1b)。随着时间的推移，单个囊自动去细胞化，留下具有绷紧膜的多种形态(球形、椭圆形或不规则形)的无细胞的和封闭的囊(图1c-1d)。这些细胞囊具有各种尺寸，直径可达100μm(图1e)。这些细胞囊是膜状的(图1f)。这些观察结果证明了囊膜独立地位于质膜外部，并且无细胞的囊膜可以在没有细胞的情况下存在。这种以前未被认可的单一哺乳动物细胞产生的细胞外膜状囊被称为细胞囊。

实施例2

细胞囊去细胞化

在大多数情况下，在细胞囊去细胞化后，细胞与其无细胞的细胞囊完全分离。无细胞的细胞囊破裂并形成瘪掉和凹陷的圆盘(图1c)。有时，细胞囊去细胞化导致被脱离的细胞与其无细胞的细胞囊不完全分离。

去细胞化后，无细胞的细胞囊的生长终止，强烈暗示了细胞囊的生成和生长依赖于腔内细胞。同时，质膜和细胞外囊之间的大间隙/距离表明源自腔内细胞的囊组分被释放/递送到质膜外部用于细胞囊的构建(图1c)。随后，无细胞的细胞囊继续收缩和瘪掉，细胞囊膜折叠，形成大的、收缩和凹陷的圆盘，或短的扁平管。约0.5-1h后，无细胞细胞膜的膜被降解，细胞囊自分解。这些观察结果表明，细胞囊的生命周期通过几个连续且不同的阶段进行：从起始、生长、去细胞化、瘪掉和收缩、膜降解到自分解。

高细胞密度下的细胞接触会减少细胞囊的产生并显著增加细胞囊的分解。高细胞密度下的细胞接触抑制不能完全抑制细胞囊的产生或完全诱导细胞囊的分解。高细胞密度的细胞接触会使细胞囊的直径增长下降。

随着时间的推移，单细胞在其细胞囊中双向迁移，使细胞囊膜变形，并产生细长的细胞囊，形成可变长度的膜管(图2)。然后，腔内细胞从细胞囊管中脱离管。细胞囊管的去细胞化产生无细胞的细胞囊管。然后，长的无细胞的细胞囊管自动收缩，并且膜严重折叠，形成瘪掉的、盘绕的、扭曲的和膜凝聚的股线。随后，长收缩的和无细胞的细胞囊管的膜被降解，然后囊管自动分解。单个细胞的细胞囊管的这些顺序发育阶段证明细胞囊管的生命周期逐渐从其细胞囊中的单细胞迁移进行到细胞囊膜变形、细胞囊伸长、细胞囊管形成、去细胞化和无细胞囊管自分解。

单个hmec产生的细胞囊管长度可达820μm。增加的细胞密度降低了平均细胞囊管的长度，但非平均宽度(直径/宽度约为11μm)。此外，高细胞密度导致了细胞囊管的平均寿命缩短。而且，高细胞密度会降低平均的细胞囊管的密度(长度和数量)。一些细胞囊管可以承受密集的微环境。

接着，我们评估了hmler(cd44^high/cd24^low)^fa亚群的乳腺癌干细胞(yit,etal.(2014)quantitativephosphoproteomicanalysisrevealssystem-widesignalingpathwaysdownstreamofsdf-1/cxcr4inbreastcancerstemcells.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica111(21):e2182-2190)的细胞囊生成。在1×10²和1×10³个细胞/孔的低细胞密度下，大约99％的bcsc在3dmatrigel中在15h时产生细胞囊。bcsc细胞囊具有更强的抵抗细胞接触抑制的能力。bcsc细胞囊管在统计学上比hmec长，单个bcsc细胞囊管长度可达1000μm。

实施例3

细胞囊和细胞囊管是外质膜(extra-plasma)细胞器

发明人已经发现，细胞囊和细胞囊管既不是质膜的延伸，也不是细胞表面的连接。它们由单个细胞产生，被它们自己的不同于质膜的生成膜包围，并包围产生它们的细胞。除了多效性生物学功能外，细胞囊和细胞囊管具有独特的特征，包括：包裹细胞的细胞外膜状胶囊(或囊管)，以及允许去细胞化和细胞进入。另一方面，细胞囊管，而非细胞囊，为多个细胞的定向运输提供长管状通道。细胞囊和细胞囊管不是质膜的延伸，而是包裹细胞的胞外膜状细胞器。细胞囊和细胞囊管不存在于2d细胞培养物中。细胞囊和细胞囊管具有多效生物学功能，包括为包裹的细胞提供支持支架和覆盖，允许细胞去细胞化和细胞进入。细胞可以在细胞囊、细胞囊管和细胞囊管网络中迁移。细胞囊和细胞囊管的自分解不影响细胞的存活、增殖和生长。无细胞的细胞囊和细胞囊管可以存在长达98小时。细胞囊和细胞囊管可以容纳多个细胞，例如几十个细胞。细胞囊管互连并形成开放的管状网络，用于在多个方向上定向细胞的移位。细胞囊和细胞囊管的这些特征表明它们是两种新颖的兼性细胞器，它们与所有先前描述的细胞器均不相同。

实施例4

细胞囊管网络的形成

在6h时，单个原发性正常hmec在指定的matrigel基质中产生大的、膜状的和短的细胞囊管(图2)。在10h时，hmec在短的细胞囊管中迁移并产生细长的细胞囊管(图2)。在36h时，多个hmec长细胞囊管相互连接并通过连接节点形成网络。(图2)。在68h时，hmec聚集并形成细胞团，所有hmec细胞囊管分解并且没有细胞囊管残留(图2)。

在4h时，乳腺癌干细胞(bcscs)已在所示的3dmatrigel基质中产生大的和短的细胞囊管(图3a)。bcscs在细胞囊管中双向迁移，使细胞囊膜变形并形成管状形态，并产生长而弯曲的细胞囊管(图3b)。多个bcsc细胞囊管连接并形成各种形态，包括闭环形。许多癌细胞以不同的形式迁移到细胞囊管中，包括流线形和线形(图3)。之后，bcscs聚集并形成球形或不规则形状的肿瘤球。接下来，我们对随着时间变化的bcsc细胞囊管的长度进行定量。bcsc细胞囊管的长度可达1000μm。多个细胞囊管可以连接以形成更长的管。细胞囊管的数量随着时间的推移而减少，表明细胞囊管的长度是动态的且严格控制的(图4)。

上述数据表明细胞囊管通常进行连续但不同的阶段：细胞囊起始、细胞囊中的细胞迁移、细胞囊伸长并形成细胞囊管、多个细胞囊协调连接并形成网络、细胞在细胞囊管网中迁移、细胞聚集和细胞团/簇形成、细胞囊管分解。

两个或更多个可变长度的hmec细胞囊管通过连接节点互连并形成管状网络。在38h时，bcsc发展出比hmec更多的细胞囊管连接节点。此外，bcscs每个连接节点的细胞囊管的平均数量大于hmec的数量。bcsc的细胞囊管密度比hmec高出约3倍。这些数据表明，bcsc具有更强的生成互连细胞囊管网络的能力。具有分离的或连接的细胞的bcsc细胞囊管的寿命比无细胞的bcsc细胞囊管长得多，表明管腔内细胞有助于维持囊管免于分解。与包含细胞的分离的bcsc细胞囊管相比，包含细胞的连接的bcsc细胞囊管在统计学上保持完整的持续时间更长。这些结果表明细胞囊管的维持受到管腔内细胞的严格控制和介导。重要的是，bcsc细胞囊管在体内肿瘤中相互连接并形成管状网络，并且多个细胞在这些管状网络中迁移。这些数据证明，细胞囊管网络为在不同方向上定向细胞的运动提供膜管状网状物。

实施例5

用于细胞运输的细胞囊管交通干道

细胞在膜状细胞囊管网络中迁移，其中管状细胞囊管为细胞移位提供了交通干道(图2-3)。使用快速细胞裂解和即时图像技术，我们检测了细胞囊管网络架构。bcsc细胞囊管广泛且积极地相互连接，显著形成十字形、空心圆形、闭环形和许多其他不规则形态，为癌细胞定向细胞的重新定位到多个方向的远端目的地提供超大管状网络(图4)。与3d环境中相比，单细胞和多细胞在细胞囊管中迁移更快。细胞囊管形成用于定向3d细胞的运输交通干道。

实施例6

合胞素-1(syncytin-1)调节细胞囊管的融合和细胞进入

不同细胞的细胞囊可以融合形成更大的细胞囊，细胞可以进入其他细胞的细胞囊(图5a)。细胞可以进入其他细胞的细胞囊，导致单个大的细胞囊包含多个细胞或细胞团(图5b-5c)。接下来，我们探讨了细胞囊管的融合、合并和细胞进入的分子机制。内源膜融合蛋白合胞素-1在hmec、细胞囊和细胞囊管中表达。在hmec中瞬时敲除合胞素-1显著降低了细胞囊管的伸长、连接，但未降低细胞囊的起始(图5d-5f)。此外，在细胞囊管伸长期间，合胞素-1蛋白的水平增加(图5g)。这些数据证明合胞素-1调节细胞囊管的融合和细胞进入。

实施例7

整合素亚基β-2(itgb-2)促进细胞囊管的发育

整合素是细胞表面支持分子，对细胞粘附、附着、迁移和侵袭至关重要。我们在细胞囊管发育期间检查了bm-msc、hmec和bcsc中的26个整合素基因转录物。itgb-2沿着细胞囊管伸长的过程显著增加(图6a)。此外，具有基因特异性shrna的itgb-2的瞬时敲除导致细胞囊管的伸长显著减少，敲除itga-8无此现象(图6b)。这些数据表明itgb-2介导细胞囊管中的细胞迁移并调节细胞囊管的伸长。

总之，本公开提供了单细胞产生两种新的细胞器，细胞外的和膜状的细胞囊和细胞囊管，并且细胞囊管提供用于3d细胞运输的管状交通干道。多细胞生物体中的细胞运动对胚胎发育、组织形成、器官稳态、免疫应答、伤口愈合、组织再生和肿瘤转移至关重要。

细胞囊和细胞囊管的产生和发育高度依赖于3d环境和细胞活动，并且在研究中，它们仅在3d基质的生物化学的、生物物理的和生物力学的特征(例如聚合、密度和粘弹性)以精确控制的方式时才成为焦点。细胞囊和细胞囊管的时空表现、自我降解和自分解都有助于解决实现和鉴定这些先前未被鉴定出的细胞器的难题。

细胞囊膜提供了大量的支持细胞粘附、附着、脱离、形态转变和运动可塑性的生物膜骨架。另一方面，细胞囊包裹细胞，物理性地将它们与细胞外微环境屏蔽，促使了严格的球形细胞相互转换成松弛的不规则形态，并且可以用作抵抗环境应力的保护性覆盖物。细胞囊管提供膜管，其适应多个细胞的定向迁移和双向运动。更重要的是，细胞囊管相互连接并形成管状网络，这显著增加了细胞迁移方向，放大了细胞扩散区域，并增强了定向3d细胞迁移效率。尽管在高细胞密度下细胞接触抑制减少了细胞囊的产生，增加了细胞囊的分解，并减少了细胞囊管的持续时间，但仍然存在大约1.2‰的正常细胞(hmecs)和高达1.1％的乳腺癌干细胞产生细胞囊，并产生长的囊管用于多个细胞的定向迁移。因此，与所有细胞不可避免地暴露于并且经历来自紧密的和异质的3decm和体内细胞的异质障碍的模式相比，一小部分细胞产生均质膜状细胞囊管并为定向运输多个细胞提供交通干道的模式是一种有效的模式，至少是一种可替代的模式。细胞囊和细胞囊管具有多效生物学功能的潜力，其他功能需要更多的工作来阐明。

细胞囊的增大取决于腔内细胞的活性和无细胞的细胞囊终止生长。另一方面，无细胞的细胞囊和细胞囊管进行快速的自动降解和自分解。除细胞内细胞器外，真核细胞还包含释放或脱落到微环境的细胞外细胞器，如外泌体(kellers,sandersonmp,stoecka,&altevogtp(2006)exosomes:frombiogenesisandsecretiontobiologicalfunction.immunologyletters107(2):102-108)。有趣的是，在细胞囊管腔中存在许多不同的单层膜封闭囊泡。因此，这些膜囊泡可以在功能上与递送/穿梭细胞来源的细胞囊成分的载体或货物连接，并且与包含裂解物的容器连接，所述裂解物的释放会导致细胞囊和细胞囊管的严格控制的自分解。

在去细胞化后，无细胞的细胞囊管收缩、缩小、变瘪、缩短、扭曲的和折叠的现象，与细胞囊管中缺乏腔内支架一致。细胞囊管腔中缺少微丝网络与单个细胞和多个细胞在细胞囊管中的主动迁移是一致的。另一方面，在细胞囊管膜中的微丝骨架的存在与以下事实一致：长细胞囊管可被细胞拖动以穿过ecm表面而没有破损、中断或截留。

其细胞囊中的细胞迁移会驱动细胞囊膜的变形和伸长，以及细胞囊管的形成和伸长。在细胞囊和细胞囊管中构建膜和其他组分需要大量不同的蛋白质，这表明mrna翻译和/或蛋白质生物合成对于细胞囊和细胞囊管的发育是必需的。

总之，本研究中发现的两种新型细胞囊和细胞囊管细胞器呈现出多效生物学功能，包括为细胞的运输、重定位和迁移提供管状通路和网络，这可能为了解细胞保护机制和涉及包括肿瘤转移在内的疾病发展和发病过程的细胞重定位提供了见解。

实施例8

材料和方法

细胞和试剂。从atcc(pcs-600-010^tm)订购原代的正常人乳腺上皮细胞(hmec)。如前所述制备hmler(cd44^high/cd24^low)^fa亚群细胞的bcsc(27)。fitc缀合的抗cd44(bdbiosciences；g44-26)抗体和藻红蛋白缀合的抗cd24(bdbiosciences，ml15)抗体用于流式细胞术的细胞分选。megm^tm乳腺上皮细胞生长培养基bulletkit^tm(clonetics^tmmegm^tm乳腺上皮细胞生长培养基加singlequots^tm试剂盒包)购于lonza(cc-3150)。matrigel^tm膜基质(cb-40234)购自corning。bdmatrigel基质生长因子减少(gfr，目录号356230)购自bdbioscience。

延时dic显微镜、瞬时转染、实时定量pcr和瞬时基因敲除。使用nikonti电动倒置显微镜和具有20×镜头的数字hamamatsuorca-er冷却ccd照相机进行细胞囊伸长和细胞迁移的延时dic(微分干涉对比度)显微镜分析。用tem分析在matrigel基质(>40μm深度)中具有细胞囊的hmec培养物。使用2000将egfp-hpmca2z/b(addgene，#47584)和/或mcherry-β-肌动蛋白(#54967)的质粒共转染到hmec中。使用基因特异性引物(idt公司)、iqgreensupermix(bio-rad)和7900ht快速实时pcr进行实时定量pcr的测定。

试剂和抗体。egfp-hpmca2z/b(#47584)和mcherry-β-肌动蛋白(#54967)的质粒购于addgene。从cellsignalingtechnology订购抗gapdh(目录号2118s，western印迹分析中1：1000稀释)抗体。从kpl订购dapi(4,6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐，在免疫荧光测定中1:1000稀释)。抗-γ-肌动蛋白(γ肌动蛋白，单克隆，ab123034，免疫荧光测定中1:1000稀释)、抗-泛-钙粘附蛋白(多克隆，ab140338，免疫荧光测定中1:1000稀释)抗体购于abcam。

瞬时转染。将hmec与megm在37℃、5％co2的潮湿气氛中培养。根据说明书，使用2000(lifetechnologies，#11668027)将质粒egfp-hpmca2z/(addgene，#47584)和/或mcherry-β-肌动蛋白(#54967)共转染到hmec中。转染两天后，将细胞用于测定。

细胞囊和细胞囊管的发育。将hmec(有/无转染)、bm-msc和hmler(cd44^high/cd24^low)^fa亚群的bcsc以指定的在megm培养基中的细胞密度(或6孔板中5×10²细胞/孔，或在10cm培养皿中1.2×10⁴个细胞，如果没有指定)接种在matrigel基质层上。通过快速添加冷冻的和解冻的matrigel基质(在4℃冷室中冰解冻过夜，蛋白质浓度为4-12mg/ml)至预冷的6孔板(有/无冷的微盖玻片)，制备3dmatrigel层(>40μm深)。然后加入冷的megm(4℃)，在室温(25℃)下置于罩中培养5-25分钟。然后，将细胞植入3dmatrigel凝胶表面并在潮湿的培养箱(37℃，5％co2)中培养。细胞以可变层进入(或侵入)matrigel凝胶，并产生细胞囊和细胞囊管。在该研究中使用了在不同阶段发育的细胞囊和细胞囊管。

延时dic显微镜和视频。使用nikonti电动倒置显微镜和具有20×镜头的数字hamamatsuorca-er冷却ccd照相机进行细胞囊伸长和细胞迁移的延时dic(分化干扰对比)显微镜分析。延时显微镜配备有dic、相衬和epi-荧光光学仪(priorproscaniii电动载物台)和百叶窗(一种完美的聚焦系统)以及一个okolab37℃，5％co2笼式显微镜培养箱(okolab)。在10～36小时的过程中每30秒拍摄一次图像。所有图像均使用metamorph软件获得。使用metamorph和imagej软件获得2小时的细胞囊伸长产生的轨迹。还使用长度和时间测量计算细胞囊的伸长速度。使用通过延时和metamorph软件(每秒15帧，fps)收集的图像制备视频。

成像采集。使用80i直立显微镜和具有20×或40×镜头的数字hamamatsuorca-er冷却ccd相机拍摄固定细胞(有/无细胞囊)的微分干涉对比度(dic)和荧光图像。使用尼康数码相机拍摄明视场相位对比图像。对细胞囊起始率/高性能场(hpf，200×)和伸长的细胞囊/hpf的数量进行定量。所有图像均使用metamorph图像采集软件获得，并用imagej软件分析。

总rna提取和实时定量pcr。在指定的时间用(thermofisherscientific)提取具有和不具有可检测细胞囊的hmec和bcsc(每10cm培养皿1.2×10⁴个细胞)的总rna。使用的样品是在matrigel基质层(约10μm厚)上铺板的样品。如说明书所述提取总rna。根据制造商的说明使用基因特异性引物(idt公司)、iqgreensupermix(bio-rad)和7900ht快速实时pcr进行定量实时pcr测定。gapdh用作对照，并进行三次独立实验。如前所述计算和制备数据分析和热图数据。

westernblotting。使用放射免疫沉淀测定(ripa)缓冲液(25mmtris-hclph7.6，150mmnacl，1％np-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％sds)和蛋白酶抑制剂(roche)，从hmec和指定时间的bcsc(每10cm培养皿1.2×10⁴个细胞)中提取总蛋白质，均包含和不含细胞囊。使用的样品是植入matrigel基质层的样品。通过10％或12％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳将总蛋白质转移到聚偏二氟乙烯固定^tm-p膜上。用一抗(anti-gapdh(cellsignalingtechnology，2118，1：1000)，在4℃下孵育聚偏二氟乙烯膜4小时，然后在0.1％tween/tbs中洗涤。用适当的过氧化物酶偶联的二抗在25℃孵育膜1h，在检测信号前洗涤三次，用ecl^tmwesternblotting检测试剂进行开发。

量化和统计分析

在所有附图中：无显著性，ns，p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

对于本领域技术人员来说，其他实施例将是显而易见的。应该理解的是，前面的描述仅是为了清楚起见而提供的，并且仅仅是示例性的。本发明的精神和范围不限于上述示例，而是包含在权利要求中。以上引用的所有出版物和专利申请均出于一切目的，通过引用其整体并入本发明，其程度等同于每个单独的出版物或专利申请被具体指出通过引用并入本发明。