以下发明涉及用天然和半合成交联剂交联的透明质酸、其制备方法、以及其作为药物和在美容医学中的用途。
背景技术：
透明质酸是由β-d-葡萄糖醛酸和β-d-n-乙酰氨基葡萄糖的交替重复单元组成的多糖型的线性聚合物，并且其是存在于许多动物组织中的组分。例如，其包含在哺乳动物的结缔组织、在湿疣、在链球菌属(streptococcus)包膜中。
透明质酸，作为动物组织的组分之一，因此是致敏作用小的、最安全、最无害的物质之一。
目前有两种不同的工业制备透明质酸的途径，第一种本质上是从例如湿疣、牛眼球等动物组织中提取的方法，而第二种提供了细菌发酵方法。然而，用这些方法得到的透明质酸含有大量的杂质如蛋白质，特别是内毒素性质的那些。这样的问题例如在皮内填充物组合物即所谓的填充物的情况中极为重要，这是由于成品注射产品中细菌内毒素浓度越低，接受者皮肤组织中的刺激-免疫反应的发生风险越低。这类反应可引起相当严重的肉芽瘤型的炎症反应，以至于欧洲共同体必须在技术法规中对这类产品设定小于0.5eu/ml的内毒素阈值(指令2007/47/ec93/42和93/42/eec医疗器械iii级)
本领域已知许多以减少蛋白质为主要目的的方法，然而其达到的纯度限度远低于上述欧洲标准。
例如，在us3,396,081中，描述了一种用于从蛋白质、抗原和致热原中纯化透明质酸的方法，其包括从动物器官中获得含有透明质酸的粉末形式的原料，下一步提供了这类粉末在碱性水溶液中的悬浮液的形成并且涉及加热以获得蛋白质的变性。最终，通过蛋白水解酶将如此变性的蛋白质分解为相应的氨基酸，将其通过离子交换树脂除去。
us4141973提供了用氯仿处理的透明质酸的脱蛋白步骤。通过该方法，得到了蛋白质残留量等于0.5％的透明质酸。
在wo86/06728中，描述了一种用于透明质酸脱蛋白的方法，其包括从蛋白质水溶液中沉淀透明质酸和蛋白质，其后用醇变性，在溶剂中溶解透明质酸和蛋白质，其中透明质酸为可溶性的且蛋白质被消化。用该方法还得到具有0.5％蛋白质残留量的透明质酸。
通过ep239995中所描述的方法得到从透明质酸中消除蛋白质的略微改进，其提供了以下步骤：通过沉淀法从原料中分离透明质酸，然后通过添加dnase和rnase来进行核苷酸的分解，保持培养直至完全消化核苷酸，然后用1％蛋白酶脱蛋白并且保持培养直至完全消化蛋白质。
在进行核苷酸分解和脱蛋白后，然后通过相关复合物的形成用烷基或芳基型的季铵盐清洗透明质酸，通过添加过量的十二烷基硫酸钠来解络透明质酸并且使透明质酸沉淀。
由此得到的透明质酸具有0.2-0.3％范围内的蛋白质残留量。
基于透明质酸得到的可吸收移植体中的另一个普遍存在的问题是其吸水能力，其为尤其是在所谓填充物或可最小化皱纹的皮内制剂的领域中的一个非常重要的性质。
实际上，吸水能力越大，其与体液接触时增加自身体积的能力越大，并且填充由皱纹或其他皮肤瑕疵导致的皮沟(skingroove)的能力越大。
另一方面，公知可例如通过透明质酸的交联来化学转化透明质酸使得其更易吸水来增加吸水能力。该反应允许得到更具粘弹性并且不易被巨噬细胞攻击的交联的透明质酸。
wo86/00079、us5,827937和wo02/06350描述了在40-50℃下在酸性和/或碱性溶液中用例如丁二醇二缩水甘油醚(bdde)等交联剂进行的透明质酸的交联方法，其后中和反应混合物。
这些交联方法具有一些缺点，主要是由以下的事实引起的：相当高的交联温度可导致透明质酸的破坏和降解，从而损害终产物的性能。
另外，现有技术的方法不可调节交联度，使得可得到具有相同工艺类型的低交联度或过高交联度的产物。
在cn1259363中，描述了一种通过含有以下步骤的方法得到的具有350-650倍吸水能力的透明质酸：
(1)用未指定的蛋白质化剂来进行脱蛋白处理，
(2)在室温下用缩水甘油醚进行交联反应。
关于步骤(1)，根据中国专利中包含的信息，无法理解到实际采用的脱蛋白剂是什么，另外，仍然关于步骤(1)，未提供关于进行了脱蛋白的产物的终纯度的其他数量数据。另外，最终交联产物的结果是被上述交联剂污染，而交联剂必然残留混入至终产物中并且难以去除。
为了克服上述缺点，意大利专利申请mi2008a002015公开了一种用于得到用bdde交联的透明质酸的方法，其由于对透明质酸进行两次脱蛋白作用而具有比现有技术的内毒素含量低得多的内毒素含量：第一脱蛋白作用包括用烷基卤处理透明质酸水溶液，和第二脱蛋白作用包括用生物学上可接受的二价金属硫酸盐处理来自第一脱蛋白作用的水溶液。
虽然该方法相对于以前的方法有所改进，其需要用例如全合成的丁二醇二缩水甘油醚(bdde)等交联剂进行交联。
这类试剂，正因为其为原始全合成的，从长远来看可导致副作用，特别是如果透明质酸在美容医学中非常频繁地用作填充物。
因此，需要具有交联的透明质酸，其除了含有非常低浓度的内毒素外，是从天然或者至多半合成物质中得到的。
技术实现要素：
本申请人现已发现通过使用泛醇作为交联剂交联的透明质酸、或其药学上可接受的盐。
因此，本发明的一个目的是前述交联的酸及其作为药物或在美容医学中的用途。
本发明的另一个目的为制备本发明的交联的透明质酸的方法，其包括用溶解在水醇溶液中的泛醇交联透明质酸的药学上可接受的盐的水性分散液。
具体实施方式
对于本发明的目的，“天然物质”是指天然存在的物质，其是从天然物质中提取的。
对于本发明的目的，“半合成物质”是指天然物质或从天然存在的材料中提取的物质，其已经通过一种或多种有机反应转化为另一种物质。
泛醇，特别是相应的光学活性形式d-泛醇，属于后一类。
泛醇(panthenol)，同样称为pantothenol，其特征在于下式
具有末端羟基的该化合物可与属于两种不同透明质酸分子的两个羧基反应来形成酯基，从而形成可以确保产物稳定性和正确渗透压的交联。
优选地，将光学活性形式d-泛醇用作交联剂。
泛醇是一种被称为前维生素b5的醇，其通过还原泛酸、也被称为维生素b5来得到，后者是作为在各种大分子特别是脂肪酸和类固醇激素的生物合成过程中转移酰基和乙酰基的关键分子的辅酶a的一个非常重要的组分。从皮肤病学的观点来看，该维生素已取得了作为润肤剂、保湿剂、抗炎剂、和作为皮肤成纤维细胞扩增诱导剂的特殊重要性。
为此，其非常适用于中胚层疗法(或生物再生疗法(biorevitalization))–一种基于在指定区域中通过特定注射器(注射枪)皮下递送例如维生素、草药提取物、营养素、顺势疗法药物等特定产品的方法。
从化学上来讲，泛醇，特别是光学活性形式d-泛醇，是泛酸(维生素b5)的还原醇形式，与后者相比，其更稳定并且通常用于化妆品领域。泛醇是水溶性的并且具有有利于其作为保湿剂和润肤剂(特别是如果与甘油相关)的活性的物理化学特性。此外，由于其增强皮肤屏障的能力，其增加了其自身的抗炎、抗瘙痒、和舒缓作用。在许多化妆品制品中添加其以达到减轻香料、防腐剂、表面活性剂的刺激性作用和减轻类维生素a疗法的副作用的目的。从生物化学的角度来讲，其促进了脂质合成、表皮细胞再生(伤口愈合)、和皮肤成纤维细胞扩增。其是一种在许多皮肤化妆品制品(例如用于干燥或受刺激的皮肤的那些)中用于治疗和保护皮肤和头发(例如，减轻由长期暴露于紫外线导致的红斑和皮炎)的成分。事实上，由于其保湿特性，泛醇增加角质层的水合作用并且赋予头发正确量的水分，防止头发变脆并且使其更易梳理。制剂的局部施用可减少动觉刺激的副作用，例如烧伤、咬伤、瘙痒、和刺痛。
根据本发明所述的用泛醇、特别是d-泛醇交联的透明质酸优选与天然和/或半合成多糖衍生物结合。
根据特别优选的实施方案，根据本发明所述的交联的透明质酸与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素结合。
该产品显示出显著的吸水能力，以渗透压表示。实际上，平均渗透压为280-300毫渗透摩尔(milliosmole)/kg水。
琼脂糖，其特征为下式：
其是从琼脂-琼脂中纯化的多糖，而琼脂-琼脂是从藻类中分离出的凝胶状物质。其是由d-半乳糖和3,6-无水-l-半乳糖单元与糖苷键交替连接形成的线性、中性聚合物。琼脂糖是可溶于沸水的糖，同时其冷却时变为固体，由于通过线性链之间的氢键形成的三维基质的形成而形成凝胶。
琼脂糖凝胶广泛用于化妆品领域和dna片段的电泳分离。
不再显示蛋白质部分并且是大多数细菌的食物来源的高度纯化的琼脂糖具有高度生物相容性。即使很少的量(例如1％琼脂糖和99％盐水)，琼脂糖也产生稳定、并且由此可塑的凝胶。
更被广泛称为羟丙甲纤维素或首字母缩写hpmc的羟丙基甲基纤维素是一种用于滴眼液的半合成、惰性、粘弹性聚合物以及能够控制释放口服用活性剂的赋形剂，但其也存在于各种商业产品中。
其具有以下化学式
作为食品添加剂，羟丙甲纤维素用作乳化剂、增稠剂、助悬剂，并且是动物明胶的可行替代品。其根据国际食品法典(alimentariuscode)归类为e464。
hpmc在溶于水时可形成胶体。与甲基纤维素不同，水溶液中的羟丙甲纤维素显示出热凝胶化特性。换言之，当将溶液加热至临界温度时，溶液凝结为非流动、但半挠性的物质。优选地，本发明的交联的透明质酸具有低于0.05eu/ml、优选≤0.025eu/ml的内毒素含量。
根据本发明所述的用泛醇交联的透明质酸，优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素组合，并且甚至更优选具有低内毒素含量，可兼顾用于作为药物的治疗中或用于美容医学中。
当用于治疗时，其优选用于关节疾病的治疗，例如皮肤伤口-愈合剂、或作为眼用润滑剂用于眼科用途。
因此，本发明的另一个目的是关节内可注射药物制剂，其含有用泛醇交联的透明质酸，优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素结合，甚至更优选具有低内毒素含量，与合适的稀释剂和/或赋形剂组合。
本发明的另一个目的是局部眼用制剂，其含有用泛醇交联的透明质酸，优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素结合，甚至更优选具有低内毒素含量，与合适的稀释剂和/或赋形剂组合。
本发明的另一个目的是用于外用的局部药物制剂，其含有用泛醇交联的透明质酸，优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素结合，甚至更优选具有低内毒素含量，与合适的稀释剂和/或赋形剂组合。
当优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素组合并且可具有低内毒素含量的用泛醇交联的透明质酸用于美容医学时，优选将其用作用于皮肤瑕疵并且特别是用于治疗皱纹和皮肤凹陷的填充物或填充剂。
因此，本发明的另一个目的是皮内可注射制剂，其含有用泛醇交联的透明质酸，优选与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素结合，甚至更优选具有低内毒素含量，与合适的稀释剂和/或赋形剂组合。
当本发明的方法用于制备与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素组合的用泛醇交联的透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐特别是钠盐时，将琼脂糖和羟丙基甲基纤维素在交联前添加至水性分散液中。
在添加琼脂糖和羟丙基甲基纤维素中和其后的交联中所采用的水性分散液中的透明质酸钠盐，优选具有2.5重量％和3.0重量％之间的透明质酸浓度。
在这种情况下，本发明的方法提供了，在交联步骤中，在50和70℃之间的温度下相对于透明质酸盐的水溶液，优选以干燥泛醇重量/所述水性分散液的重量的重量比在1:5和3:5之间来添加泛醇。当使用其中透明质酸钠盐具有上述重量浓度范围(2.5-3.0％)的水性分散液时，以相对于所述透明质酸盐的水性分散液的重量的重量比在0.5:5和2:5之间来添加粉末形式的琼脂糖，并且以基于所述水性分散液的重量的重量比在1:5至2.5:5之间来添加粉末形式的羟丙基甲基纤维素。本发明的方法优选在回收交联的透明质酸后包括透析纯化。
当任选地与琼脂糖和羟丙基甲基纤维素组合的本发明的交联的透明质酸具有低内毒素含量时，本发明的方法，在向透明质酸钠水性分散液可能添加琼脂糖和羟丙基甲基纤维素以及其后的透明质酸的交联之前，可包括以下步骤：
a)第一脱蛋白作用，其包括用烷基卤、优选氯仿处理透明质酸的水溶液，
b)第二脱蛋白作用，其包括用生物学上可接受的二价金属硫酸盐、优选硫酸锌处理分离自步骤(a)的透明质酸的水溶液。
在根据本发明所述的方法中，以药学上可接受的盐、优选钠盐的形式使用的透明质酸，通常具有500000和2000000da之间、优选1000000和1500000da之间的平均分子量。
在以下实施例中，提供了与泛醇、琼脂糖、和羟丙基甲基纤维素结合并且具有低内毒素含量的交联的透明质酸的制备方法，其仅用于说明目的并非限制性目的。
实施例1
脱蛋白作用(步骤1)
在分离和表征后，在40℃温度下在行星搅拌器中，将20g透明质酸在去矿物质并且用磷酸盐缓冲液缓冲至ph7.0的水中水合，从而得到0.25％w/w的透明质酸钠溶液(20g透明质酸在7.98kg去矿物质且缓冲的水中)。将由此得到的凝胶转移至另一个不锈钢混合器中，所述不锈钢混合器预先灭菌干燥并且保持相当于0.6g的氯仿(sigma-aldrich)、相当于3％w/w的透明质酸的体积。剧烈搅拌(用中心杆机械搅拌)反应混合物至少30分钟并且优选60分钟并且其后过滤反应混合物，以此方式从母液中分离沉淀物。用真空泵用95％乙醇连续清洗沉淀物3次，其后在30℃下在通风烘箱中干燥直至达到重量恒定。
脱蛋白作用(步骤2)
将根据步骤1中所述方法使用氯仿(步骤1)脱蛋白后得到的透明质酸钠(15g)再水合来得到的透明质酸钠溶液在由不锈钢制成的行星搅拌器中机械搅拌，并且将4.5g的10％w/w的七水硫酸锌水溶液(sigmaaldrich)添加至溶液中。搅拌混合物至少30分钟并且优选60分钟，其后将95％乙醇和氯仿混合物(混合物1:1)添加至溶液/凝胶中并且过滤混合物。用95％乙醇连续清洗3次在滤器上得到并收集的沉淀物，并且最终用真空泵过滤。然后将由此清洗得到的沉淀物在30℃下在通风烘箱中干燥直至达到重量恒定。
实施例2–实施例1中得到的脱蛋白产物的交联
将脱蛋白(步骤1和2)后得到的透明质酸在行星机械混合器中在40℃温度下用去矿物质的且用磷酸盐缓冲液缓冲的水水合，以此方式得到0.25％w/w的凝胶。将6.7kg凝胶(在透明质酸钠中0.25％w/w)置于另一个具有中心杆的机械搅拌器中并且进行剧烈机械搅拌；在用1mhcl溶液酸化直至使ph为3.5后，将1g泛醇添加至凝胶中并且搅拌混合物至少1.5小时，在70℃下的水浴中加热混合物。
在反应结束后，用1m氢氧化钠溶液中和反应混合物，并且其后用95％乙醇和氯仿混合物以1:1比例(总计2l)提取。
将收集的沉淀物用于过滤并且用95％乙醇连续清洗3次，其后在真空下过滤并且在30℃下在通风烘箱中干燥直至达到重量恒定。在磷酸盐缓冲液中水合透明质酸粉末，以此方式达到0.25％w/w溶液和6.8<ph<7.2，并且对由此得到的溶液进行动态透析处理。
最后的操作由以下组成：通过对挤出具有降低的敏感性的过滤膜对透明质酸钠进行尺寸表征。
实施例3–含有透明质酸钠、琼脂糖、和羟丙基甲基纤维素的水性分散液的制备。
将注射用水添加至前一步骤中得到的沉淀物中，从而得到含有2.5重量％的透明质酸钠的水性分散液。
取5重量份的所述水性分散液并且添加1重量份的羟丙基甲基纤维素粉末，剧烈搅拌混合物30分钟，然后添加1.6重量份的琼脂糖粉末，并且整体剧烈搅拌30分钟。
实施例4–用泛醇交联的透明质酸的制备
向实施例3中得到的混合物中添加40重量份的含有2.5重量份d-泛醇的70％乙醇水溶液，在搅拌下使温度达到60℃并使其反应30分钟。对如此从反应器中得到的产物直接进行透析。
这类产物特别适用于可关节内施用的可注射制剂。
通过与实施例1-4中所描述的那些的类似方法制备的适用于美容医学中的制剂的用泛醇交联的透明质酸，唯一的区别在于实施例4中添加了含有2g泛醇的乙醇水溶液。
通过与实施例1-4中所描述的那些的类似方法制备的适用于愈合伤口和眼科领域的局部制剂的用泛醇交联的透明质酸，唯一的区别在于实施例4中添加了含有1.6g泛醇的乙醇水溶液。