基于CD2信号通路的HIV感染阻断组合及方法与流程

交叉引用

本申请明确了美国临时申请编号62/570,947专利的优先收益权，该专利于2017年10月11日提交，其内容在此作为整体参考纳入本申请书。

领域

本声明涉及调节细胞生物活性，包括调节细胞对细菌和/或病毒的易感性，并将化合物和成分(如药物、核酸和蛋白质)递送到细胞内。这里提供了调节细胞生物活性的方法、组合物和类似物。

介绍

cd2(集落分化2,又名t11/leu-5，lfa-2,lfa-3受体,红细胞受体和玫瑰花环受体)是细胞共刺激和表面粘附分子，表达于t细胞和nk细胞(自然杀伤细胞)表面,但不表达于b淋巴细胞,因此,在免疫组化中用于识别t和nk细胞。cd2表达于所有外周血t细胞上，是95％以上胸腺细胞最早表达的t细胞标志物之一。cd2单克隆抗体抑制绵羊红细胞玫瑰花环的形成，提示它可能是红细胞受体或与其密切相关。

cd2还与其他粘附分子如lfa-3/cd58(淋巴细胞功能相关抗原-3)相互作用。cd2的胞外包含免疫球蛋白样结构域，可以介导产生同型二聚体(chenetal.，2002)。cd2与lea-3结合介导t细胞粘附与抗原呈递细胞。类似的cd2刺激也可启动信号转导通路，调节cofilin活性和肌动蛋白细胞骨架，增强t细胞活化。然而，cd2敲除小鼠表现出基本正常的免疫功能(killeenetal.，1992)，人们认为cd2与其他t细胞共刺激分子如cd28在功能上存在一定的冗余(hutchcroftetal.，1998)。cd2还与其他粘附分子如lfa-3/cd58(淋巴细胞功能相关抗原-3)相互作用。cd2的胞外结构域包含免疫球蛋白样结构域，可以介导形成同型二聚体(chenetal.，2002)。cd2通过结合lea-3介导t细胞与抗原呈递细胞的粘附。类似的cd2刺激也可启动信号转导通路，调节cofilin活性和肌动蛋白细胞骨架，增强t细胞活化。然而，cd2敲除小鼠具有基本正常的免疫功能(killeenetal.，1992)，人们认为cd2与cd28等其他t细胞共刺激分子在功能上存在一定的重叠(hutchcroftetal.，1998)。

摘要

在一个方面，这里提供了一种在细胞中阻断hiv感染的方法，包括用抗体、配体或小分子预先刺激cd2受体。

在一个实施案例中，抗体是一种抗cd2抗体，从umcd2、bti-322、cb.219和siplizumab中筛选获得。在另一个实施案例中，配体是从cd58、alefacept以及与cd2结合的蛋白中筛选出的。在另一个实施案例中，小分子是与cd2相互作用的小分子，起激动剂或拮抗剂的作用。在另一个实施案例中，细胞是人类细胞。

另一个方面，这里提供了一种治疗或预防艾滋病毒感染的方法，包括给予预先刺激cd2受体的组合。在一个实施案例中，该组合包括一个抗体、一个配体或小分子。在一个实施案例中，抗体是一种抗cd2抗体，选自umcd2、bti-322、cb.219和siplizumab。在另一个实施例中，配体从cd58、alefacept以及与cd2结合的蛋白中筛选出的。在另一个实施案例中，小分子是与cd2相互作用的小分子，起激动剂或拮抗剂的作用。

在另一个方面，这里提供了用于治疗或预防艾滋病毒感染的组合，其中所述组合预先刺激cd2受体。在一个实施案例中，该组合物包括一个抗体、一个配体或小分子。

在另一方面，本发明提供了阻断免疫细胞中病毒核迁移的方法，包括预先刺激cd2受体的抗体、配体或小分子。在一个实施案例中，该抗体是一种抗cd2抗体，选自umcd2、bti-322、cb.219和siplizumab。在另一个实施案例中，是从cd58、alefacept以及与cd2结合的蛋白中筛选出的。在另一个实施案例中，小分子是与cd2相互作用的小分子，起激动剂或拮抗剂的作用。在另一个实施案例中，细胞是人类细胞。

在另一个方面，这里提供了一种用于在细胞中降解病毒粒子的组合，其中所述预先刺激cd2受体的组合。

在另一方面，本发明提供了增强抗艾滋病毒免疫的方法，包括用抗体、配体或小分子预先刺激cd2受体。在一个实施案例中，该抗体是一种抗cd2抗体，选自umcd2、bti-322、cb.219和siplizumab。在另一个实施案例中，是从cd58、alefacept以及与cd2结合的蛋白中筛选出的。在另一个实施案例中，小分子是与cd2相互作用的小分子，起激动剂或拮抗剂的作用。

需要理解的是，上述一般描述和以下详细描述都只是示例性和解释性的，并不是对发明的限制。

所附的附图被纳入本规范并构成本规范的一部分，附图说明了几个实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

附图简要说明

图1：预刺激cd2抑制hiv感染血液cd4t细胞。

从健康献血员外周血中负选静息cd4t细胞。细胞用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv-1(nl4-3)2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28磁珠(每个细胞4个磁珠)激活。

图2：预刺激cd2抑制hiv感染血液记忆cd4t细胞r5。

从健康献血员外周血中负选静息记忆cd4t细胞(cd45ro+cd45ra-)。细胞用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv-1(ad8)2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28磁珠(每个细胞4个磁珠)激活。

图3：cd58预刺激cd2抑制hiv感染血液cd4t细胞。

从健康献血员外周血中负选静息cd4t细胞。细胞用纯化的cd58蛋白预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv病毒2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28微球(每个细胞4个磁珠)激活。

图4：cd2预刺激不抑制t细胞活化。

从健康献血员外周血中负选静息cd4t细胞。细胞用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)预刺激过夜。刺激后，细胞被抗cd3/cd28微球激活(每个细胞4个微球)。用cd25和cd69的上调衡量t细胞的活化。

图5：cd2刺激后不抑制hiv感染血液cd4t细胞。

从健康献血员外周血中负选静息cd4t细胞。细胞感染hiv-1(nl4-3)2h，洗涤后，用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)刺激。刺激后，细胞培养5天，然后用抗cd3/cd28微球(每个细胞4个磁珠)激活。

详细描述

具体实施案例将附图说明并标注参考文献。

本发明涉及使用cd2受体阻断hiv-1感染的组合和方法。在一个实施案例中，本发明人证明，通过使用抗体、配体或与cd2受体结合的小分子刺激cd2受体，可以使血液cd4t细胞等病毒靶细胞对hiv病毒产生抵抗性。

本发明明确指出预刺激cd2受体可以阻止病毒在免疫细胞中的复制。因此，它可能用于治疗hiv感染，也可能促进细胞内病毒颗粒的降解，促进抗原递呈过程。预刺激cd2可用于增强抗hiv免疫，并可用于促进对艾滋病毒感染或抗艾滋病毒疫苗的免疫反应。

本说明书中的所有技术术语均分别在生物化学、分子生物学和免疫学中常用，本发明领域的技术人员可以理解。这些技术术语可在以下文件中找到:molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.,vol.1-3,ed.sambrookandrussel,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001；currentprotocolsinmolecularbiology,ed.ausubeletal.,greenepublishingassociatesandwiley-interscience,newyork,1988(withperiodicupdates)；shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,5.sup.thed.,vol.1-2,ed.ausubeletal.,johnwiley&sons,inc.,2002；genomeanalysis:alaboratorymanual,vol.1-2,ed.greenetal.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1997；cellularandmolecularimmunology,4.sup.thed.abbasetal.,wbsaunders,1994.

本文指出的组合可以任何有效的路线输入体内，包括但不限于口服、肠外、肠内、腹腔内、局部、经皮(例如,使用任何标准途径)、眼、鼻、局部以及气溶胶喷雾、吸入、经皮(表皮)、皮下、静脉注射、肌内、颊、舌下、直肠、阴道、动脉、粘膜、鞘内等非经口途径。该组合可单独使用，或与任何活性或非活性成分联合使用。

任何个体均能够接受该抗体、配体和/或一个小分子的组合，这些个体包括那些接触过hiv,但还没有发展为hiv感染,以及那些已经发展为hiv感染或已经进展至出现一个或更多的艾滋病毒感染的临床症状(例如,艾滋病)。除了治疗和/或预防人类感染hiv外，这种组合物还可用于治疗其他生物体(例如，非人类灵长类动物、猫等)感染艾滋病毒或艾滋病毒相关病毒(如siv、shiv或fiv)的。因此，可以治疗的对象包括，哺乳动物、人类、猴子、猿、黑猩猩、大猩猩、猫、狗、老鼠、大鼠等。

本文指出的包括抗体、配体,和/或小分子的组合能够用于治疗和/或预防由hiv病毒类型病毒造成的感染，包括但不限于hiv-1(例如a、b、c、d和g亚型,r5和r5x4病毒等等)、hiv-2(如r5和r5x4病毒等等)、猴免疫缺陷病毒(siv)、猴/人类免疫缺陷病毒(shiv)、猫免疫缺陷病毒(fiv),牛免疫缺陷病毒(biv)(wrightetal.,vet.res.commun.,26:239-50,2002)、htlv-1及htlv-2等。

预刺激是指将cd2受体暴露于抗体、配体或小分子，然后再将细胞暴露于病毒感染，如hiv病毒。

刺激后是指将细胞暴露于病毒感染，然后将细胞上的cd2暴露于抗体、配体或小分子。

抗体是指预先刺激cd2受体的抗体，如抗cd2抗体。在一些实施案例中，抗cd2抗体选自umcd2(一种抗人cd2单克隆抗体)、bti-322(bti-322是一种单克隆抗cd2抗体，用于治疗抗类固醇急性移植物抗宿主病)、cb.219(单克隆抗人cd2抗体)；以及siplizumab(单克隆抗人cd2抗体)。

配体是指任何与cd2受体结合的分子。一个明确的配体是cd58。在一些实施案例中，配体为alefacept(alefacept是一种与lfa3(cd58，拥有恒定区域(ch2和ch3)和人类igg1的铰链结构域)的第一胞外结构域结合的融合蛋白。该杂合分子可与cd2结合治疗寻常型银屑病)。

小分子是指与cd2相互作用并起激动剂或拮抗剂作用的小分子物质。

解释性案例列举如下。它们是典型的，但并不仅限制于此。

案例1：预刺激cd2抑制hiv感染血液cd4t细胞

如图1所示，预刺激cd2可抑制血液cd4t细胞感染hiv。从健康献血员外周血中进行负选静息cd4t细胞。细胞用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv-1(nl4-3)2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28磁珠(每个细胞4个磁珠)激活。

cd2介导的抑制并不局限于cxcr4噬性病毒(x4)。当我们测试ccr5(r5)噬性病毒hiv-1(ad8)感染记忆cd4t细胞时，我们观察到类似的hiv-1(ad8)抑制作用，参见图2。此外，当cd4t细胞被cd2配体lfa-3(cd58)预刺激时，我们观察到类似的对hiv感染的抑制作用，参见图3。

案例2：预刺激cd2抑制r5噬性hiv感染血液记忆cd4t细胞

如图2所示，cd2预刺激可抑制r5噬性hiv感染血液记忆cd4t细胞。从健康献血员外周血中进行负选静息记忆cd4t细胞(cd45ro+cd45ra-)。细胞用抗cd2抗体偶联磁珠(每个细胞2个磁珠)预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv-1(ad8)2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28磁珠(每个细胞4个磁珠)激活。

案例3：以cd58预刺激cd2抑制hiv感染血液记忆cd4t细胞

如图3所示，cd58预刺激cd2可抑制血液cd4t细胞感染hiv。从健康献血员外周血中负选静息cd4t细胞。细胞用纯化的cd58蛋白预刺激过夜。刺激后，细胞感染hiv病毒2h，洗涤，培养5天，然后用anti-cd3/cd28磁珠(每个细胞4个磁珠)激活。

cd2刺激对hiv感染的抑制并不是因为可能抑制了t细胞的活化或细胞毒性。首先，如图4所示，当使用anti-cd3/cd28磁珠激活cd2刺激的静息cd4t细胞时，我们没有观察到t细胞激活的缺陷。另外，如图5所示，静息cd4t细胞感染hiv-12小时后，再用抗cd2抗体刺激，则无抑制hiv-1感染的作用。这些结果表明，cd2刺激可特异性地阻断病毒早期感染过程，如病毒核迁移。可能是cd2信号改变了cofilin通路，抑制了病毒的核迁移，因为已经有报道发现hiv介导的cxcr4/cofilin激活是病毒核迁移所必需的(yoderetal.,2008)。

案例4：cofilin磷酸化和去磷酸化水平作为刺激程度的衡量标准

量化使用cofilin磷酸化和去磷酸化的水平来衡量刺激的程度。cofilin通过ser-3位点的磷酸化而失活，然后通过去磷酸化被重新激活。蛋白质磷酸化可以由任何已知的技术方法,包括但不仅限于放射性32p放射性标记、基于molybdate比色测定、磷酸化特异性抗体的免疫印迹或elisa、磷酸化染色试剂以及各种质谱和流式细胞术方法。

参考文献

chen,h.a.,pfuhl,m.,anddriscoll,p.c.(2002).thephdependenceofcd2domain1self-associationand15nchemicalexchangebroadeningiscorrelatedwiththeanomalouspkaofglu41.biochemistry41,14680-14688.

hutchcroft,j.e.,slavik,j.m.,lin,h.,watanabe,t.,andbierer,b.e.(1998).uncouplingactivation-dependenths1phosphorylationfromnuclearfactorofactivatedtcellstranscriptionalactivationinjurkattcells:differentialsignalingthroughcd3andthecostimulatoryreceptorscd2andcd28.jimmunol161,4506-4512.

killeen,n.,stuart,s.g.,andlittman,d.r.(1992).developmentandfunctionoftcellsinmicewithadisruptedcd2gene.emboj11,4329-4336.

yoder,a.,yu,d.,dong,l.,iyer,s.r.,xu,x.,kelly,j.,liu,j.,wang,w.,vorster,p.j.,agulto,l.,etal.(2008).hivenvelope-cxcr4signalingactivatescofilintoovercomecorticalactinrestrictioninrestingcd4tcells.cell134,782-792.

其它的示范例对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明的规格和实施例仅被认为是示例性的。本发明的真实范围和发明核心由下面所附权利要求书表明。