一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对及其应用的制作方法

本发明涉及一种辅助筛选具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物。
背景技术：
：小麦是世界第一大粮食作物，在我国为仅次于水稻的第二大粮食作物，其产量高低和品质优劣直接影响到人类食物供应程度和营养水平。淀粉是小麦籽粒中含量最多而且也是最重要的碳水化合物，约占粒重70%以上，籽粒淀粉含量、直/支比例、淀粉粒度分布以及淀粉糊化特性等决定小麦的产量和品质。淀粉的生物合成在造粉体中通过一系列酶促反应完成。研究表明造粉体不仅仅是合成和储藏淀粉的场所，同时具有广阔的代谢功能，可能通过调控碳氮代谢等来影响淀粉的合成。李三峰（2017）认为造粉体的发育直接影响到淀粉含量和复合淀粉颗粒的形态，最终影响稻米产量。myers（2011）对玉米opaque5突变体的研究发现编码mgdg合酶基因的突变影响胚乳的发育，表明造粉体在淀粉粒形成中起重要的调控功能。在水稻上的研究表明，叶片中mgdg与光合作用关系紧密，可以提高叶片的光合速率。造粉体膜与淀粉含量及特征形成有关，而糖脂是造粉体膜的主要成分，其中单半乳糖甘油二酯（mgdg）、双半乳糖甘油二酯（dgdg）占淀粉表面总极性脂的95%左右。单半乳糖甘油二酯合成酶（mgd）是合成mgdg的关键酶。关于tamgd与籽粒粒重的关系未见相关报道。功能标记（functionalmarker）是一类基于基因特征序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性，在mas中有着广泛应用前景。而小麦千粒重是一个数量性状，受基因型、环境及其互作的影响。因此，克隆和开发小麦tamgd基因对小麦高产育种具有重要意义。技术实现要素：本发明针对现有技术不足，提出一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物，并将之用于辅助筛选具有不同千粒重性状小麦及小麦育种。本发明采用的技术方案：一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325f/r，由序列表的序列3所示的单链dna片段和序列表4所示的单链dna片段组成。所述引物对325f/r的应用如下：（1）鉴定待测小麦携带基因型是tamgd-b1a基因还是tamgd-b1b基因；（2）辅助筛选携带tamgd-b1a基因或是tamgd-b1b基因的小麦品种；（3）辅助鉴定/测定待测小麦的千粒重；（4）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；（5）用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒；所述等位基因tamgd-b1a如序列表的序列1所示；所述等位基因tamgd-b1b如序列表的序列2所示。以待测小麦的基因组dna为模板，用权利要求1所述引物对325f/r扩增得到的dna片段：所述dna片段为序列表1自5’末端2508-2782所示的核苷酸或序列表2中自5’末端2506-2830所示的核苷酸；所述dna片段的应用，为如下（a）或（b）：（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。序列表1所示的dna分子；序列表2所示的dna分子。等位基因tamgd-b1a和tamgd-b1b的应用，为如下：（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。所述等位基因tamgd-b1a如序列表的序列1所示；所述等位基因tamgd-b1b如序列表的序列2所示。一种利用所述引物对325f/r辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，包括以下步骤：以小麦基因组dna为模板，用引物对325f/r进行pcr扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为tamgd-b1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为tamgd-b1b，具有较低千粒重。发明有益效果：本发明首次公开了普通小麦tamgd基因的等位变异序列tamgd-b1a和tamgd-b1b，提供了鉴定tamgd-b1a和tamgd-b1b等位变异的功能标记及其与粒重的关系。本发明还开发了辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325f/r，通过该分子标记对小麦dna进行pcr扩增，用于鉴定和筛选具有较高千粒重的小麦品种或品系。本发明标记可用于小麦育种材料的早代选择，不受环境和栽培条件的限制，选择目标清晰准确，节省时间和资源，加快育种进程，有利于高产小麦的选育，同时高千粒重小麦籽粒有利于磨粉品质的改善。附图说明图1为来源于普通小麦的2个籽粒粒重相关基因tamgd-b1a与tamgd-b1b的序列对比；图中下划线部分为外显子，加粗部分为差异片段，加粗且加下划线部分为引物序列；图2为引物对325f/r对16个不同粒重材料的多态性检测，m：500bpdnamaker。具体实施方式下面通过具体实施方式，对本发明技术方案做进一步的详细描述。以下各实施例仅用于说明本发明，不应当构成对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在现有技术范围内，采用惯用技术手段的置换以及和现有技术进行简单组合，均不脱离本发明保护范围。实施例1一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325f/r，所述引物对325f/r由：上游引物325f所示单链dna片段：5’-cccttgtctattcattactgcc-3’（序列表3）以及下游引物325r所示单链dna片段：5’-accacaaatgacaacaagctg-3’组成（序列表4）。所述引物对325f/r的可应用于：（1）鉴定待测小麦携带基因型是tamgd-b1a基因还是tamgd-b1b基因；（2）辅助筛选携带tamgd-b1a基因或是tamgd-b1b基因的小麦品种；（3）辅助鉴定/测定待测小麦的千粒重；（4）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；（5）用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒；实施例2本实施例为利用前述引物对325f/r辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，包括以下步骤：以小麦基因组dna为模板，用引物对325f/r进行pcr扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为tamgd-b1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为tamgd-b1b，具有较低千粒重。实施例3本实施例公开了获得基因型tamgd-b1a和tamgd-b1b基因的方法，采用小麦品种许科316和郑麦366进行dna提取及mgd序列分析：1、tamgd-b1a与tamgd-b1b基因的获得根据中国春mgd基因序列（geneid:triae_cs42_6bl_tgacv1_499471_aa1583540.1）设计特异性引物mgd-bf/r（表1），分别扩增许科316和郑麦366小麦籽粒mgd基因。引物设计采用primierprimer5软件。表1用于扩增小麦mgd基因全长的引物序列pcr反应以郑麦366和许科316基因组dna为模板，50µlpcr反应体系为：模板dna200ng，phanta®maxsuper-fidelitydnapolymerase（南京诺唯赞生物科技有限公司）1µl，上下游引物（10μmol·l-1）各2µl，2×buffer25µl，ddh2o补充反应体系至50µl。引物对mgd-bf/rpcr反应的退火温度为62℃（除预变性和变性温度修改为98℃外，其余程序均参照说明书设置）。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶纯化回收克隆至zt4-blunt载体（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），测序由北京六合华大基因完成。图1所示为来源于普通小麦的2个籽粒粒重相关基因tamgd-b1a与tamgd-b1b的序列对比。图中，tamgd-b1a为许科316系列，tamgd-b1b为郑麦366序列；下划线所在碱基部分为外显子，加粗部分为差异片段，加粗且加下划线部分为引物序列。2、郑麦366与许科316mgd基因差异分析许科316品种扩增出的基因型定义为tamgd-b1a（序列如序列表1所示），郑麦366品种扩增出的基因型定义为tamgd-b1b（序列如序列表2所示）。所述等位基因tamgd-b1a和/或tamgd-b1b，可应用于：（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。实施例4本实施例以实验的方式，通过对小麦千粒重性状与基因型的相关性分析，具体阐述了利用引物对325f/r辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法。一、功能标记引物设计根据序列表中的序列1、序列2设计引物对325f/r，pcr产物包含上述50bpindel。325f(上游引物)：5’-cccttgtctattcattactgcc-3’（序列3）325r(下游引物)：5’-accacaaatgacaacaagctg-3’（序列4）用引物对325f/r扩增小麦基因组dna，会得到两种pcr产物类型，类型tamgd-b1a长度为275bp，类型tamgd-b1b长度为325bp，参见图2。二、小麦千粒重性状与基因型的相关性分析试验材料包括136份中国冬小麦栽培品种（2017年种植于河南荥阳）；1、小麦籽粒千粒重的测定2、小麦基因型的测定提取小麦基因组dna，按照以下步骤进行基因型鉴定：①以小麦基因组dna为模板，用引物对325f/r进行pcr扩增。pcr反应体系：模板dna200ng，2×t5superpcrmix（北京擎科新业生物技术有限公司）1µl，上下游引物（10μmol·l-1）各0.5µl，用ddh2o补充反应体系至20ul。pcr反应程序：首先98℃、3min；然后98℃、10s，57℃、10s，72℃、10s，共34个循环；最后72℃、5min。扩增产物于4℃保存。②将pcr产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。图2为16个品种检测结果图。依次为中国春、郑麦366、平安8号、洛麦23、洛麦24、驻麦305、丰德存10号、宁麦9号、许科316，花培8号、周麦22、周麦23、平安0658、西农364、豫农186、新麦2111。材料ⅰ136个样本中，74个样本扩增出275bp片段，基因型为tamgd-b1a类型，62个样本扩增出325bp片段，基因型为tamgd-b1b。136个小麦品种，千粒重测定结果和基因型鉴定结果见表2。表2：136份中国冬小麦的品种、千粒重测定结果和基因型测定结果编号品种名称千粒重片段长度1泰禾麦2号58.73275bp2中保麦1号58.23275bp3泉麦2957.80275bp4西农91657.30275bp5鄂麦17057.20275bp6中农87556.81275bp7周麦2256.74275bp8涡麦6656.72275bp9泛麦707356.62275bp10郑麦769856.52275bp11新麦211156.52275bp12中新1656.33275bp13赛德麦60156.08275bp14郑麦186055.93275bp15豫农50255.88275bp16赛德麦3号55.86275bp17轮选16655.56275bp18泛麦803-155.48275bp19轮选6655.39275bp20洛麦3255.34275bp21存麦18号55.12275bp22周麦2755.00275bp23郑麦93654.91275bp24濮麦116554.41275bp25中育115254.35275bp26中麦17054.03275bp27济麦2253.99325bp28宁08-3053.89325bp29锦绣2153.74325bp30濮兴8号53.73275bp31中育142853.71275bp32泛育麦1753.56275bp33豫农18653.50275bp34金丰20553.43275bp35周麦1853.39275bp36西农18853.23275bp37郑麦61852.91275bp38盛农2号52.79325bp39中农麦400752.78275bp40周麦1652.73275bp41郑麦11952.71325bp42良星6652.64275bp43农大201152.48325bp44豫农21152.36325bp45鄂麦52652.35275bp46周麦2352.29275bp47郑麦134252.13275bp48郑品麦22号52.09275bp49郑麦13652.04325bp50平安060252.04275bp51良星9951.78325bp52平安051851.74275bp53郑16851.71275bp54丰德存麦2051.62275bp55光泰6851.54325bp56兰考38051.52325bp57徐907451.48275bp58瑞泉麦16851.34325bp59郑育麦1651.34325bp60存麦1251.06325bp61郑9951550.93325bp62平安065850.90275bp63郑品麦24号50.84275bp64西农58550.75325bp65郑麦10350.74325bp66中育1250.66275bp67泛区麦1650.62275bp68淮核1201350.29325bp69矮抗5850.17325bp70洛麦2950.17325bp71中农89550.12275bp72百农金光58850.11325bp73新科麦16949.90325bp74农大201149.88275bp75郑品麦25号49.66275bp76豫丰1149.41275bp77百农30749.37325bp78百农41849.32325bp79中育939849.10325bp80中泛15949.09325bp81中麦24749.01325bp82郑麦36948.87325bp83轮选2148.79325bp84濮兴5号48.79275bp85龙科122148.54325bp86郑麦135448.46275bp87西农52948.24275bp88瑞华142648.23325bp89瑞华110148.21275bp90益科麦5号47.95325bp91中泛703947.90275bp92西农36447.74275bp93瑞华05547.71325bp94百农41647.63325bp95中金1347.53275bp96中育930747.52325bp97西农16747.33275bp98龙科121147.23325bp99新麦4547.14325bp100西农52447.11275bp101百农20747.10325bp102中泛42847.06275bp103资0821（r.topm）46.94275bp104泛麦8号46.90325bp105丹麦11846.90325bp106扬辐麦914446.84275bp107兰考19846.82325bp108轮选3346.72275bp109赛德麦4号45.90325bp110pic44745.89275bp111丰德存10号45.81325bp112西农51145.77275bp113新麦3145.61325bp11409m2045.58325bp115nmas02045.08325bp116濮麦806244.46325bp117新麦2643.86275bp118瑞华142643.27325bp119周麦2443.25325bp120望水白43.24325bp121中麦6642.94275bp122封麦6号42.88275bp123新麦3542.19275bp124南农068641.58325bp125洛麦2441.55325bp12610m2041.55325bp127驻麦30541.10325bp128泛麦80340.96275bp129宁麦9号40.20325bp130洛麦2340.16325bp131平安8号39.48325bp132节燕2000-138.39325bp133网9338.34325bp134苏麦3号37.00325bp135苏夫35.00325bp136nmas00134.26325bp表3：小麦tamgd基因等位变异与籽粒粒重高低关系的统计分析结果试验材料等位变异检测材料数目平均千粒重（g）标准差іtamgd-b1a7451.86a4.19tamgd-b1b6247.09b4.76通过对小麦千粒重与基因型的相关性分析，得出以下结论：以小麦基因组dna为模板，用引物对325f/r进行pcr扩增，若产物长度为275bp，说明该小麦材料基因型为tamgd-b1a，具有较高千粒重；若产物长度为325bp，则该小麦材料基因型为tamgd-b1b，具有较低千粒重。本发明引物对325f/r，除了用于小麦基因型的测定，用于辅助鉴定/测定/比较待测小麦/品种的千粒重，还可用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒。采用该引物对325f/r辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦，用于小麦育种，可提高选择效率，加快育种进程。当前第1页12