一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用的制作方法

本发明涉及分子诊断技术领域，具体地，涉及一种通用型猪细小病毒巢式pcr引物组及其应用。

背景技术：

猪细小病毒(porcinecircovirus2，ppv)是能引起猪的繁殖障碍病，是目前威胁世界养猪业的重要病原之一。ppv主要感染妊娠前期的母猪,引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。ppv可感染各阶段的猪，但除怀孕母猪和仔猪外，其他阶段的猪感染后均无明显临床症状。主要通过呼吸道和消化道感染，也可通过胎盘传给胎儿。感染公猪的精细胞、精索、附睾和副性腺均可分离出病毒，配种时易传给易感母猪。一旦发生本病后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁育失败。该病的发生给养猪业带来重大的经济损失，因此对于ppv感染的诊断和病猪的淘汰成为防治的重点。

猪细小病毒(ppv)属细小病毒科细小病毒属，该病毒为单股线状负链dna病毒，无囊膜，外观呈六角形或圆形，二十面体轴立体对称，核衣由32个壳粒组成。基因组大小约为。ppv目前只有一个血清型。ppv基因组为单股负链dna，大小约5000bp，其中有2个主要开放阅读框，分别编码结构蛋白vp和非结构蛋白ns。近年来，国内外学者建立了血凝试验、血清中和试验，酶联免疫吸附试验，免疫荧光试验，普通pcr诊断，核酸探针，sybrgreen实时荧光定量pcr等技术进行ppv的检测。普通pcr方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。但普通pcr诊断存在灵敏度较低这样的问题，且ppv亚临床感染猪群中病毒含量很低，普通pcr灵敏度较差，易造成漏检。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的普通pcr检测猪细小病毒的缺陷，提供一种通用型猪细小病毒巢式pcr引物组及其应用，本发明所提供的巢式pcr引物组是针对猪细小病毒的结构蛋白vp2中碱基序列设计出的两对特异性引物，并且对多种病原菌进行验证，只有猪细小病毒可以扩增出特异条带，具有特异性。

为了实现上述目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种通用型猪细小病毒巢式pcr引物组，包括外侧引物ppv-o-f、ppv-o-r和内侧引物ppv-i-f、ppv-i-r；其中，所述外侧引物ppv-o-f的序列如seqidno:1所示，所述外侧引物ppv-o-r的序列如seqidno:2所示，所述内侧引物ppv-i-f的序列如seqidno:3所示，所述内侧引物ppv-i-r如seqidno:4所示。

本发明另一方面提供了上述猪细小病毒巢式pcr引物组在检测猪细小病毒以及制备检测猪细小病毒试剂中的应用。

在一种优选的实施方案中，采用上述巢式pcr引物组进行巢式pcr检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：

1)将待测样本提取dna得到样本dna；

2)将所述样本dna进行两次pcr扩增，第一次pcr扩增采用外侧引物ppv-o-f与ppv-o-r，第二次pcr扩增采用内侧引物ppv-i-f与ppv-i-r；每次pcr产物进行电泳检测猪细小病毒。

在一种优选的实施方案中，第一轮扩增的pcr反应体系包括：总体积为25μl，其中：金牌mix12.5μl，ppv-o-f与ppv-o-r各1μl，dna模板1μl，ddh2o补足余量。

在一种优选的实施方案中，第二轮扩增的pcr反应体系包括：总体积为25μl，其中：金牌mix12.5μl，ppv-i-f与ppv-i-r各1μl，以第一轮扩增产物为模板1μl，ddh2o补足余量。

在一种优选的实施方案中，所述第一次pcr的反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。

在一种优选的实施方案中，所述第一次pcr的反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。

在一种优选的实施方案中，所述待测样本为小猪血清样本或脾脏、肺脏、初乳、精液、恶露的组织样本。

在一种优选的实施方案中，第一次pcr扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；第一次pcr扩增的目的条带为716bp。

在一种优选的实施方案中，第二次pcr扩增后的产物进行电泳检测，出现286bp条带即可判断所述样品中存在猪细小病毒。

通过上述技术方案，本发明所提供的巢式pcr检测引物组及检测方法是针对猪细小病毒的结构蛋白vp2中碱基序列设计出的两对特异性引物，并且对多种病毒病原进行扩增，只有猪细小病毒可以扩增出特异条带，具有特异性。本发明所提供的巢式pcr检测方法能从混合模板中扩增出特异性条带，显示检测方法抗干扰性较好。本发明的巢式pcr检测方法对现有流行毒株检测的最低拷贝数可达到10¹个数量级，最低拷贝数为10⁰，比普通pcr检测方法灵敏度高3-5个数量级。

附图说明

图1为本发明实施例2巢式pcr外侧引物特异性检测的凝胶电泳图；

图2为本发明实施例2巢式pcr内侧引物特异性检测的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3巢式pcr外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；

图4为本发明实施例3巢式pcr内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；

图5为本发明实施例3巢式pcr外侧引物干扰性检测的凝胶电泳图；

图6为本发明实施例3巢式pcr内侧引物干扰性检测的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了更好的理解上述技术方案，下面通过具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。应当理解的是，这里所使用的术语“和/或”包括其中一个或更多所列出的相关联项目的任意和所有组合。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

现有技术存在的普通pcr检测猪细小病毒的缺陷，本发明实施例的主要思路是：

一种通用型猪细小病毒巢式pcr引物组，包括外侧引物ppv-o-f、ppv-o-r和内侧引物ppv-i-f、ppv-i-r；其中，所述外侧引物ppv-o-f的序列如seqidno:1所示，所述外侧引物ppv-o-r的序列如seqidno:2所示，所述内侧引物ppv-i-f的序列如seqidno:3所示，所述内侧引物ppv-i-r如seqidno:4所示。

采用上述巢式pcr引物组进行巢式pcr检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：

1)将待测样本提取dna得到样本dna；

2)将所述样本dna进行两次pcr扩增，第一次pcr扩增采用外侧引物ppv-o-f与ppv-o-r，第二次pcr扩增采用内侧引物ppv-i-f与ppv-i-r；每次pcr产物进行电泳检测猪细小病毒。

本发明提供的巢式pcr检测方法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，且可靠性强，克服了普通pcr检测灵敏度低，特异性差等问题，而且与现有的间接免疫荧光、基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短，实用性强。另外，本发明实施例方法结果可靠，提取某养殖场多份血清样品，经过两轮巢式pcr扩增后电泳检测，对检测呈阳性的样品进行测序，测序结果显示均为猪细小病毒基因，证明了本发明方法的可靠性。本发明实施例方法实用性强，可用于对组织样本、血清、血浆和精液等样本的检测，适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

以下将结合具体实施例对本发明进行详细描述。实施例中所用的材料均可通过市售渠道获得。

实施例1：猪细小病毒巢式pcr检测方法的建立

(1)采样与dna提取

a：血清样本处理：前腔静脉采血，1500r/min离心30分钟，收集样本血清，用康维dna提取试剂盒提取dna，测定浓度备用。

b：组织样品处理：取待检测猪只样本的组织器官，剪碎后用康维dna提取试剂盒提取dna，测定浓度备用。

(2)pcr扩增与电泳检测

a：用外侧检测引物ppv-o-f、ppv-o-r进行第一次pcr扩增。pcr反应体系(25μl)为：金牌mix12.5μl，ppv-o-f与ppv-o-r各1μl，dna模板1μl，ddh2o补足余量；pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无716bp条带则进行第二次扩增。

b：用内侧检测引物ppv-i-f、ppv-i-r对第一次扩增产物模板进行第二次扩增。pcr反应体系(25μl)为：金牌mix12.5μl，ppv-i-f与ppv-i-r各1μl，dna模板1μl，ddh2o补足余量；pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测是否有286bp条带。

(3)结果分析

根据巢式pcr扩增结果判定：在第一次pcr扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高；第二次pcr扩增后电泳检测到目标条带的也判断为阳性，表明样品带毒量相对较低；两轮巢式pcr后检测均无目的条带的则报告为阴性。

实施例2：重组阳性质粒pmd20-t-vp2构建

(1)vp2基因的克隆

提取猪细小病毒(ppv)的基因组dna，以该基因组dna为模板，采用巢式pcr外侧引物ppv-o-f和ppv-o-r扩增部分保守vp2基因。pcr反应体系(25μl)为：金牌mix12.5μl，ppv-o-f与ppv-o-r各1μl，dna模板1μl，ddh2o补足余量；pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min，pcr产物于0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约716bp的特异性dna条带，与目标dna片段大小相符。图1中：m为dl2000dnamarker，1-8中的模板分别ppv抗原，猪瘟病毒(csfv)，猪圆环病毒2型(pcv2)，猪伪狂犬病毒(prv)，猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，阴性对照(无dna、rna的ddh2o)。

(2)pmd20-t-vp2阳性质粒构建

将上述pcr产物用omega公司的胶回收试剂盒回收，然后与takara公司的pmd20-t克隆载体进行连接，连接体系为：dna3μl，vector(puc19dna)1μl,sterivizedwater1μl，solution5μl。pcr回收产物716bp；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布amp抗性的lb培养基上；37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。

(3)pmd20-t-vp2阳性重组子鉴定

用引物ppv-o-f和ppv-o-r对挑选的阳性克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定正确的重组子命名为pmd20-t-vp2。

(4)重组质粒pmd20-t-vp2的提取

测序鉴定正确的重组子用lb肉汤进行增菌后采用康为公司的高纯度质粒小提试剂盒pureplasmidminikit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。

实施例3：巢式pcr引物特性检测

(1)特异性试验：提取ppv病原，猪瘟病毒(csfv)，猪圆环病毒2型(pcv2)，猪伪狂犬病毒(prv)，猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，阴性对照(无dna、rna的ddh2o)进行巢式pcr方法的特异性检测，检验该检测方法的特异性。结果如图1，2所示，两对引物均具有良好的特异性和较高的扩增效率。图2中，m为dl2000dnamarker，1-8中的模板分别为ppv抗原,猪瘟病毒(csfv)，猪圆环病毒2型(pcv2)，猪伪狂犬病毒(prv)，猪繁殖与呼吸综合征(prrsv),大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，阴性对照(无dna、rna的ddh2o)。

(2)敏感性试验：对实施例2所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释至个位数拷贝数(4copy)，选取各稀释度质粒当做模板用引物ppv-o-f、ppv-o-r进行第一次pcr扩增，pcr产物用0.8％琼脂糖胶检测，结果如图3所示，第一次pcr扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到基因拷贝数为10¹，且扩增特异性好。图3中：m为dl2000dnamarker，1-9中模板拷贝数依次为1.33×10⁸，1.33×10⁷，1.33×10⁶，1.33×10⁵，1.33×10⁴，1.33×10³，1.33×10²，1.33×10¹，1.33×10⁰。扩增产物作为相应梯度的模板用引物ppv-i-f、ppv-i-r做第二次pcr扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖胶进行检测，结果如图4所示，经过巢式pcr两次扩增后所能检测到的最低10⁰个拷贝数。其中1-9分别以第一次pcr产物为相应模板，1.33×10⁸，1.33×10⁷，1.33×10⁶，1.33×10⁵，1.33×10⁴，1.33×10³，1.33×10²，1.33×10¹，1.33×10⁰。

(3)干扰试验：特异性试验中用到的ppv基因组与伪狂犬基因组取等量进行混合，用引物ppv-o-f、ppv-o-r和ppv-i-f、ppv-i-r分别进行pcr扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带，结果如图5和图6所示，该检测方法均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。其中，图5中m为dl2000dnamarker，1-5ppv与猪伪狂犬病毒(prv)混合样本，6为阴性对照(无dna、rna的ddh2o)。图6中m为dl2000dnamarker，1-5ppv与猪伪狂犬病毒(prv)混合样本，6为阴性对照(无dna、rna的ddh2o)。

(4)符合率试验：为验证巢式引物对各地区流行细小病毒检测的敏感性，提取了jn872448、kf429255、kf913345、jx992846、u44978、fj822038和eu790642等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式pcr扩增后，各类基因组均能检测到10¹个数量级的基因拷贝数，证明本发明方法切实可行。

实施例4：巢式pcr可靠性试验

1、临床样品采集：2018年10月从湖北某家规模化猪场采集小猪血样20份，1500r/min离心30分钟，收集样本血清，按照康维公司的柱式血液样本dna提取试剂盒提取dna。

2、pcr扩增与电泳检测：按实施例1的步骤(2)进行两轮pcr扩增。对扩增后的产物进行电泳检测，20份血清样本共检测到15份阳性，测序结果显示15份阳性产物均为细小病毒基因，证明该方法检测的结果具有可靠性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>长江大学

<120>一种猪细小病毒巢式pcr引物组及其应用

<130>2019

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

taaagttagaataggatgcgaggaa25

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

tgctgcggcgtctgatgga19

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

aaactgccaggtgattt17

<210>4

<211>14

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

tccacggctccaag14