一种鸭坦布苏病毒的ELISA抗体检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种鸭坦布苏病的elisa抗体检测试剂盒及其应用，本发明属于免疫学技术领域。

背景技术：

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(ducktembusuvirus,dtmuv)引起的一种急性传染病，该病于2010年在我国南方地区首次爆发，随后疾病迅速传播危害到全国各地的鸭养殖场，造成了巨大经济损失。目前针对鸭坦布苏病毒病的诊断方法主要存在两种，第一种是分子生物学诊断方法，它的基本原理是根据病毒核酸序列设计出特异性的扩增引物，以反转录得到病毒的cdna为模板利用pcr技术扩增病毒核酸的目的片段，从而检测病毒的方法，第二种是血清学诊断方法，主要包活间接免疫荧光试验(immunonuorescenceassay,ifa)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)，原理是利用抗体与病毒上相应的抗原部分结合后，再利用特定标记的二抗与已结合的抗体发生作用，通过荧光显微镜观察或读取od值而推知抗原的存在。但是以上两种检测方法均存在不足之处：(1)分子生物学诊断方法对于实验的仪器要求较高，适合实验室进行病原的检测而不适用大规模的临床检测；(2)血清学诊断方法中，间接免疫荧光实验(ifa)对实验材料以及设施同样要求较高，因此一般也不用于临床检测，而elisa诊断方法一般是常用的临床诊断方法，该方法简单、高效，可同时检测大规模的样品，但目前实验室建立的elisa诊断方法以及商品化的试剂盒，大都选用纯化灭活的鸭坦布苏病毒或鸭坦布苏病毒e蛋白作为抗原进行包被，这些方法灵敏度高、敏感性较好，但存在最大一个问题就是交叉反应性，由于鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，而黄病毒属各个病毒e蛋白间的同源性较高，因此无论是利用全病毒或是e蛋白建立的elisa诊断方法都会与黄病毒属其他病毒产生交叉反应现象。

抗原表位(epitope)又称抗原决定簇(antigenicdeterminant,ad)是引起免疫应答的物质基础，能够与血清中的抗体发生特异性的结合，因此利用病毒蛋白特异性的抗原表位建立的血清学elisa诊断方法，有其自身的优点和特殊性，即减少了无关干扰序列的影响，又增强其特异性。鸭坦布病毒e蛋白epitope-elisa诊断方法是一种特异性的检测方法，仅对dtmuv阳性血清具有敏感性，而对鸭其他种类疾病阳性血清(鸭肝炎、鸭瘟、番鸭细小)以及denv、jev、wnv、zikv等阳性血清不具有敏感性。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供检测鸭坦布苏病毒抗体的elisa诊断试剂盒。

本发明的目的在于根据现有的鸭坦布苏病毒病elisa抗体检测方法中存在交叉反应性、特异性不强和检测结果缺乏准确性等问题，提供一种采用鸭坦布病毒e蛋白特异性抗原表位作为检测抗原的鸭坦布苏病毒elisa抗体诊断试剂盒，该试剂盒具有种特异性强和免疫原性强的特点。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，利用本发明人前期制备的两株抗鸭坦布苏病毒e蛋白的单克隆抗体1a5与4e9进行抗原表位的鉴定。针对单克隆抗体1a5和4e9，我们利用亲和层析柱对其进行纯化，并利用噬菌体展示技术鉴定出其抗原表位yaeyi和sgkg。dot-blotting结果显示抗原表位yaeyi与sgkg为鸭坦布苏病毒e蛋白特异性抗原表位，在其他黄病毒血清间不存在交叉反应性，以及与鸭其他病毒病阳性血清也不存在交叉反应性，特异性强，因此两个特异性抗原表位可用于特异性elisa抗体诊断方法的建立。

接下来人工合成抗原表位的核苷酸序列，并且两个表位间加入一个gly-ser(甘氨酸-丝氨酸)柔性肽进行连接，将合成的核苷酸序列连接到pgex-6p-1质粒载体上，用大肠杆菌dh5α筛选高拷贝重组子，将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，从而构建重组大肠杆菌bl21(de3)工程菌，将重组大肠杆菌bl21(de3)工程菌在iptg诱导下进行蛋白表达，经过过柱纯化或切胶进行纯化(由于所筛选的抗原表位为线性抗原表位，不存构象关系，因此切胶纯化不影响其抗原性)，得到融合表达的特异性抗原表位蛋白。

最后，将纯化的重组融合抗原表位蛋白包被酶标板，建立间接elisa检测方法。重组抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定：将重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释不同梯度后每孔100μl包被于96孔板，4℃过夜，鸭坦布苏病毒标准阴、阳性血清进行倍比稀释组成方阵，结果判定p/n值(标准阳性血清od450nm/标准阴性血清od450nm)最大时为最适抗原抗体工作浓度。最佳封闭液选择：分别以5％w/w聚乙烯醇、5％w/w脱脂乳、1％w/wbsa、1％w/w明胶、2％w/w卵清蛋白溶液作为封闭液对elisa板进行封闭，对血清样品进行检测，p/n值最大时则为最佳封闭液。血清与二抗最适工作时间的确定：以最适稀释度的重组抗原包被96孔酶标板，加入最适稀释度的标准阳性血清，将作用时间分别设定为37℃30min、45min、60min、90min，p/n值最大时为血清与抗体最适作用时间。间接elisa阴阳性临界值的确定：据试验确立的elisa最佳反应条件，对25份鸭dtmuv阴性血清样品进行检测，根据结果计算阴性样品的od450nm的平均值和标准差，确定阴阳性标准的临界值，阴阳性临界值＝阴性样品平均值±3×标准差。

在上述研究的基础上，首先，本发明提出了一种鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由seqidno.1所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白与seqidno.2所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。

其中，优选的seqidno.1所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白与seqidno.2所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白通过gly-ser柔性肽进行连接，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

进一步的，本发明还提出了所述的重组融合特异性抗原表位蛋白在制备鸭坦布病毒抗体检测试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种鸭坦布苏病毒的elisa检测试剂盒，所述试剂盒中包括鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的elisa板，所述的重组融合抗原表位蛋白是由seqidno.1所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白与seqidno.2所示的鸭坦布苏病毒e蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。

在所述的elisa抗体检测试剂盒中，优选的，鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白的包被浓度为6.4μg/ml，封闭液为1％w/wbsa溶液。

在所述的elisa抗体检测试剂盒中，还包括洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液。

在所述的elisa抗体检测试剂盒中，所述洗涤缓冲液是含0.5％tween-20的10mmpbst，ph7.4；所述样品稀释液为含有0.05％tween-20的10mmol/lpbst，ph值7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鸭igg；所述底物显色液是0.01％w/w的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述终止液是2m硫酸溶液。

使用所述的elisa抗体检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒抗体检测时，按照以下步骤进行：

(1)将试剂盒中鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的elisa板和各种溶液置于常温下回温；

(2)加样：用样品稀释液稀释待检血清后每孔加入100μl，标准阴、阳性血清作为对照，将酶标板置于37℃作用1h，然后甩干，每孔加300μl洗涤缓冲液洗3～5次；

(3)加酶标二抗：每孔加入用样品稀释液稀释好的hrp标记的羊抗鸭igg100μl，将酶标板置于常温或37℃作用1h，然后甩干，每孔加300μl洗脱缓冲液洗3～5次；

(4)加显色液：每孔加入tmb显色液100μl，将酶标板室温避光显色；

(5)加终止液：每孔加入硫酸终止液100μl；

(6)测od值：将酶标板放入酶联检测仪测定各孔od450nm值；

(7)结果判定。

其中，优选的，步骤(2)中待检血清的最大稀释倍数为1:80；步骤(3)中hrp标记的羊抗鸭igg的稀释度为1:1500；步骤(4)中所述的显色时间为10～30min，优选显色时间为10min；步骤(7)中根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为：若吸光度值大于或等于0.189，则为dtmuv阳性，若吸光度值小于0.189，则为dtmuv阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)特异性强：鸭坦布苏病毒为黄病毒，而黄病毒阳性血清间存在交叉反应性，本发明建立的检测方法由于利用鸭坦布苏病毒e蛋白特异性的抗原表位，特异性强，仅对dtmuv阳性血清具有敏感性，而对鸭其他种类疾病阳性血清如(dhv-i，dev，mdpv)以及denv、jev、wnv、zikv等阳性血清不具有敏感性。

(2)方法简易且安全性高：包被的抗原为抗原表位串联肽段，相对与e蛋白更易于获得，且相对于全病毒包被的方法安全性更高。

附图说明

图1为单抗抗原表位同源性分析结果；

其中：a：单克隆抗体1a5抗原表位同源性分析结果；b：单克隆抗体4e9表位同源性分析结果；

图2为抗原表位与黄病毒阳性血清交叉反应性分析结果；

图3为dtmuv特异性抗原表位与鸭阴性血清elisa反应结果；

图4为特异性试验结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。本领域的普通技术人员可考虑到多种可进行的改进和调整，而不改变本发明的精神或范围。这种改进和调整包括在本发明的范围内。下述实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1重组表位包被抗原的制备

1.抗原表位的鉴定

利用本发明人前期制备的两株抗鸭坦布苏病毒e蛋白的单克隆抗体1a5与4e9进行抗原表位的鉴定。利用亲和层析柱proteing对1a5与4e9抗体进行纯化，利用噬菌体展示技术，以纯化的单克隆抗体1a5和4e9为固相筛选分子，筛选阳性噬菌斑克隆。通过分析阳性噬菌体克隆表面展示的12肽序列得到模拟表位序列。根据噬菌体筛选出的模拟表位序列，合成1a5和4e9的表位的寡核苷酸序列1a5f:5'aattctacgctgaatacatac3'，1a5r:5'tcgagtatgtattcagcgtag3'；4e9f:5'aattctccggaaagggac3'和4e9r：5'tcgagtccctttccggag3'。在正义链5'端引入xholi酶切位点，反义链5'端引入ecori酶切位点。两条互补的寡核苷酸链，退火后可形成双链的dna，可直接与ecori和xhoi酶切处理的pgex-6p-1载体连接。将测序正确的重组质粒进行诱导表位，表达后的样品经sds-page电泳后，电转移到纤维硝酸素(nc)膜上，经western-blot验证，结果成功鉴定单克隆抗体1a5和4e9所针对的线性抗原表位yaeyi(seqidno.1所示)和sgkg(seqidno.2所示)。

从genbank上选取具有代表性的黄病毒属病毒株，利用dnastarlasergeneprogram(dnastarinc,madison,wi,usa)对dtmuv与黄病毒属病毒的e蛋白进行序列比对，以分析筛选到的dtmuve蛋白的线性抗原表位在黄病毒中的同源性，结果筛选到的抗原表位yaeyi与sgkg在鸭坦布苏病毒中具有高度的保守性，无氨基酸位点差异，而在黄病毒属其他病毒中不具有同源性(图1)。

2.抗原表位的交叉反应性分析

用dot-blotting分析筛选到的dtmuve蛋白的线性抗原表位在黄病毒阳性血清间的交叉反应性。方法：将融合表达获得的抗原表位蛋白yaeyi与sgkg，取5μl点于nc膜上，室温干燥30min；用5％脱脂乳(pbs)37℃封闭1h，pbs洗三遍，每遍5min；将dtmuv(鸭源)、jev(兔源)、denv(人源)、wnv(兔源)阳性血清1:10倍稀释，4℃孵育过夜，pbs洗三遍，每遍5min；将辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗人igg、羊抗鸭igg、羊抗兔igg二抗进行1:250倍稀释，37℃孵育1h，pbs洗三遍，每遍5min；dab显色，结果抗原表位蛋白yaeyi与sgkg仅与dtmuv阳性血清发生反应不与其他黄病毒阳性血清发生反应(图2)。

3.重组表达质粒的诱导表达及融合蛋白的获得

接下来人工合成融合抗原表位蛋白的核苷酸序列，正义链5’aattctacgctgaatacataggaagctccggaaagggac3’,反义链5’tcgagtccctttccggagcttcctatgtattcagcgtag3’，两个表位间加入一个gly-ser(甘氨酸-丝氨酸)柔性肽进行连接，同时引入酶切位点ecori与xhoi将合成的核苷酸序列连接到pgex-6p-1质粒载体上，用大肠杆菌dh5α筛选高拷贝重组子，将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，从而构建重组大肠杆菌bl21(de3)工程菌，将重组大肠杆菌bl21(de3)工程菌在iptg诱导下进行蛋白表达，经过过柱纯化或切胶进行纯化(由于所筛选的抗原表位为线性抗原表位，不存构象关系，因此切胶纯化不影响其抗原性)，得到融合表达的特异性抗原表位蛋白，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

实施例2用重组表位蛋白进行间接酶联免疫吸附试验

1、抗原和一抗最佳工作浓度的确定

用矩阵滴定法对抗原表位融合蛋白的最佳包被浓度及dtmuv阳性血清最佳反应浓度进行确定。将实施例1获得的dtmuv抗原表位融合蛋白以碳酸盐缓冲液按照1:10开始进行10倍梯度稀释，包被elisa板上，每孔加100μl的包被液，4℃孵育过夜，用洗涤缓冲液(含0.5％v/vtween-20的10mmpbst，ph7.4)洗三遍。将已包被的elisa板用100μl的1％牛血清蛋白(bsa)封闭1h，再使用洗涤缓冲液彻底清洗三次。得到预包被抗原的酶标板。使用样品稀释液(含有0.05％v/vtween-20的10mmol/lpbst，ph值7.4)将dtmuv阳性与阴性血清以1:20开始进行2倍梯度稀释，每孔加入100μl，37℃孵1h。使用样品稀释液以1:1500倍稀释的hrp标记的羊抗鸭igg进行二抗的孵育，每孔100μl，37℃孵育1h。其他步骤按照elisa程序进行。最后tmb底物显色液，每孔加50μl，在37℃避光的温育显色10min，以2mh2so4终止液中止显色，酶标仪450nm读取od值。判定标准：选取阳性血清(p)/阴性血清值(n)＞2.1，且阳性od450nm值为接近1.0左右的抗原表位蛋白包被浓度和血清的最大稀释倍数为蛋白和血清的最佳工作浓度。结果：6.4μg/ml为表位蛋白最佳包被浓度，1:80为血清最佳稀释倍数(表1)。

表1抗原蛋白和血清最佳稀释度的确定

2.最佳封闭液选择

分别以5％w/w聚乙烯醇、5％w/w脱脂乳、1％w/wbsa、1％w/w明胶、2％w/w卵清蛋白作为封闭液对elisa板进行封闭，血清样品进行检测，结果如表2，结果显示当封闭液为1％w/wbsa时，p/n值为7.8最大，因此所建立的epitope-elisa检测方法中最佳封闭液为1％w/wbsa(表2)。

表2最佳封闭液的确定

3.血清最佳反应时间确定

在确定抗原表位蛋白和血清的最佳工作浓度、最佳封闭液后，将血清孵育时间分别定为37℃45min、37℃60min、37℃75min、37℃90min，结果见表3，当反应时间为1h时，p/n值最大，为7.53。据此，确定血清最佳反应时间为1h(表3)。

表3血清最佳反应时间确定

4.二抗(hrp标记的羊抗鸭igg)最佳反应时间的确定

根据以上反应条件，加入hrp标记的羊抗鸭igg后，孵育时间分别为37℃45min、37℃60min、37℃75min、37℃90min，当二抗作用时间为1h时，p/n值为7.643，高于其他二抗反应时间的检测结果，据此确定二抗最佳作用时间为1h(表4)。

表4酶标二抗最佳反应时间的确定

5.阴阳性临界值确定

根据试验确立的elisa最佳反应条件，对25份鸭dtmuv阴性血清样品进行检测，根据结果计算阴性样品的od450nm的平均值和标准差，确定阴阳性标准的临界值，阴阳性临界值＝阴性样品平均值±3×标准差。结果根据结果阴阳性临界值＝0.125±3×0.0213。最终得出阴阳性临界值为0.189。检测结果≥0.189即为阳性，检测结果＜0.189即为阴性，见图3。

6.特异性试验结果

用已经建立的特异性抗原表位elisa检测方法对dhv-i、dev、mdpv阳性血清以及denv、jev、wnv黄病毒阳性血清检测。dtmuv阳性血清检测结果为阳性，其他病毒阳性血清检测结果均为阴性，od值小于0.189。说明本研究建立的elisa检测方法与其他病毒阳性血清没有交叉反应，特异性比较好，见图4。

实施例3鸭坦布苏病毒elisa抗体检测试剂盒的组成及使用方法

所述的试剂盒包括：

1、鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的elisa板：按照实施例1方法制备；

2、洗涤缓冲液：含0.5％v/vtween-20的10mmpbst，ph7.4；

3、样品稀释液：含0.05％v/vtween-20的10mmpbst，ph7.4；

4、酶标二抗：hrp标记的羊抗鸭igg；

5、底物显色液：0.01％w/w的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(tmb显色液)；

6、终止液：2m硫酸溶液。

鸭坦布苏病毒elisa抗体检测试剂盒的使用方法：

1.将试剂盒中鸭坦布病毒e蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的elisa板和各种溶液置于常温下回温；

2.加样：用样品稀释液按1:80倍数稀释待检血清后每孔加入100μl，标准阴、阳性血清作为对照，将酶标板置于37℃作用1h，然后甩干，每孔加300μl洗涤缓冲液洗3～5次。

3.加酶标二抗：每孔加入用样品稀释液按照1:1500倍稀释好的hrp标记的羊抗鸭igg100μl，将酶标板置于常温或37℃作用1h，然后甩干，每孔加300μl洗脱缓冲液洗3～5次。

4.加显色液：每孔加入tmb显色液100μl，将酶标板室温避光10min。

5.加终止液：每孔加入硫酸终止液100μl。

6.测od值：将酶标板放入酶联检测仪测定各孔od450nm值。

7、结果判定：od450nm检测结果≥0.189即为dtmuv阳性，检测结果＜0.189即为dtmuv阴性。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

哈尔滨维科生物技术有限公司

<120>一种鸭坦布苏病毒的elisa抗体检测试剂盒及其应用

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