一种抗His标签的重链抗体及其应用的制作方法

本发明属于分子免疫学领域，具体涉及噬菌体展示文库和纳米抗体重组表达技术，特别涉及一种特异性识别his标签的重链抗体及其应用。

背景技术：

重链抗体(heavychainantibody，hcab)发现于骆驼和鲨鱼类动物体内，是一种天然缺失轻链，只有重链组成的抗体。克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为vhh(variabledomainofheavychainofheavychainantibody)，也称为纳米抗体(nanobody)，它是最小的功能性抗原结合片段。与普通抗体不同，纳米抗体是一条含有大约110个氨基酸的肽链，其分子量约为普通抗体的1/10，纳米抗体与普通抗体及重组单链抗体(singlechainfragmentvariable，scfv)相比，具有分子小、稳定性好、可溶性好、易于表达、生产成本低等优点，在免疫实验、诊断与治疗中，具有广阔的应用前景。

his标签(his-tag)也称为多组氨酸标签或hexa组氨酸标签，是一种位于目标蛋白的c端或n端上由至少6个组氨酸组成的短肽，his标签可以在特定的缓冲液条件下结合到几种固定的离子上(比如镍、钴和铜)，专门设计用于重组蛋白质的亲和层析纯化。his标签可作为亲和标签纯化蛋白的基本原理是固相化金属亲和层析，组氨酸作为电子供体与介质上的金属离子之间发生相互作用，使二者相结合，从而达到容易检测和纯化蛋白的目的。

与其他标签相比，his标签具有相对小的分子量、低免疫原性、亲水性、在去污剂和其他添加剂存在的情况下易变性，还具有工艺成熟、操作简单和可大规模生产使用等优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。

对带有his标签的蛋白质进行检测和纯化时，无需针对目标蛋白质设计特异性的抗体或探针，只需使用抗his标签的抗体即可实现对其的检测，因此，开发抗his标签的抗体对于重组蛋白质的检测、纯化等研究具有重要意义。

目前，已有针对his标签的单克隆抗体或多克隆抗体，但单克隆抗体的研发和生产过程较为繁琐和复杂，多克隆抗体的特异性不高且不稳定，相比之下重链抗体有稳定性高、特异性高、分子量小和可大规模生产等优点，有广阔的应用前景。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种抗his标签的重链抗体及应用，可用于检测、纯化和富集带有his标签的蛋白质。

为此，本发明提供了一种抗his标签的重链抗体，其可变区具有以下互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)：seqidno:1所示的cdr1、seqidno:2所示的cdr2、seqidno:3所示的cdr3。

进一步，本发明所述的重链抗体，其可变区具有以下框架区(frameworkregion，fr)：seqidno:4所示的fr1、seqidno:5所示的fr2、seqidno:6所示的fr3、seqidno:7所示的fr4。

进一步，本发明所述的重链抗体，可选的具有fc段或缺失fc段，优选地，本发明所述重链抗体缺失fc段，形成单域重链抗体或纳米抗体。

进一步，本发明所述的重链抗体的氨基酸序列如seqidno:8所示。

第二方面，本发明提供一种核酸，其编码本发明所述的抗his标签的重链抗体。

本发明所述的核酸，其核酸序列如seqidno:9所示。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的核酸。

第四方面，本发明提供一种细胞，其表达本发明所述的抗his标签的重链抗体，和/或包含本发明所述的核酸或核酸构建体。

第五方面，本发明提供一种生产抗his标签的重链抗体的方法，其包括以下步骤：在允许表达所述抗his标签的重链抗体的条件下培养本发明所述的宿主细胞；和从所得培养物中纯化抗体。

第六方面，本发明还提供所述抗his标签的重链抗体在制备检测、纯化或富集带his标签蛋白质的试剂中的应用。

本发明的有益效果为：本发明不同于现有技术中针对his标签的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明所述重链抗体与多克隆抗体相比对his标签的特异性高、亲和力强，并可通过重组生产、不同批次间性能稳定；本发明重链抗体与普通单克隆抗体相比制备简单、来源可靠，避免了普通单克隆抗体重组表达困难，杂交瘤细胞制备周期长、传代易退化等技术问题。本发明所述重链抗体的上述优点使其相对于现有技术其它抗体或抗体片段更能满足分子生物学试验中通过his标签亲和纯化重组蛋白的需求。另外，本发明提供的重链抗体可特异性识别his标签，与his标签结合时不影响与his标签融合的蛋白质本身的功能。且本发明优选的纳米抗体与his标签的亲和力高达到7.11×10^-8m，本发明所述重链抗体达到甚至超过了完整抗体的性能，为带his标签蛋白质的检测、纯化和富集提供了优异的基因资源和抗体资源。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：

图1为抗his标签的重链抗体的可变区的氨基酸序列及结构域示意图

图2为实施例1中编号为h343的阳性克隆的phage-elisa结合图，横坐标表示按表2加样，其中1为实验组，2为空白对照组，3为阴性对照组，4为阳性对照组，纵坐标表示elisa读数计测定od450nm处吸光度值。

图3为本发明提供的抗his标签的纳米抗体的sds-page图。其中，第3泳道为实施例2制备得到的纯化后的纳米抗体，第4泳道为标准蛋白marker。

图4为实施例3中抗his标签纳米抗体的亲和力检测图，平衡解离常数kd＝7.11×10^-8m。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另外定义，本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1抗his标签纳米抗体的淘选

采用固相亲和淘选的方法从单域重链抗体噬菌体展示文库中淘选针对his标签的单域重链抗体。将带his标签的蛋白用1×pbs溶液稀释至30-100μg/μl，包被到elisa板上，每孔加入100μl，4℃过夜包被；吸出包被液，pbst洗板3次，每孔加入300μl4％的脱脂牛奶，37℃封闭2h；pbst洗板3次后加入噬菌体展示库(约含1×10¹²cfu)，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用pbst洗板5次(逐轮增加洗涤次数，每轮的洗涤次数见表1所示)，再用pbst洗板3次后加入100μl洗脱液(甘氨酸-盐酸溶液，ph2.2)洗脱吸附在板孔中的噬菌体，37℃孵育5min，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗下来，然后加入15μltris-hcl(ph8.8)中和洗脱物，取10μl用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。每轮淘选的条件及噬菌体输出量和特异性噬菌体的富集度见表1所示。

表1固相亲和淘选对噬菌体的富集

在第三轮、第四轮淘选后的测滴度的平板上，随机挑取单克隆用辅助噬菌体m13k07进行救援，分别得到展示目的蛋白的噬菌体颗粒，用phage-elisa测定噬菌体颗粒的结合活性，实验设定阴性对照、空白对照和阳性对照，具体加样表见表2。

表2phage-elisa加样表

经phage-elisa测得阳性率为51％，其中编号为h343的阳性克隆od450值最高(其phage-elisa实验结果如图2所示)，提取测序模板，将其送生物技术服务公司进行测序。根据对h343的测序结果，得到纳米抗体的基因的核酸序列，其序列如seqidno:9所示，其编码抗his标签的纳米抗体，抗体的氨基酸序列如seqidno:8所示。对氨基酸序列进行分析，其具有典型的纳米抗体的稳定结构，其框架区fr区和互补决定区cdr区的氨基酸序列分别如下：

cdr1如seqidno:1所示；cdr2如seqidno:2所示；cdr3如seqidno:3所示；fr1如seqidno:4所示；fr2如seqidno:5所示；fr3如seqidno:6所示；fr4如seqidno:7所示。

实施例2抗his标签纳米抗体的表达和纯化

将实施例1得到的纳米抗体的基因克隆至表达载体pet-25b(由擎科生物公司进行克隆)，构建得到抗his标签纳米抗体表达质粒。将构建好的表达质粒转化至大肠杆菌bl21，挑取单克隆进行诱导表达。将单克隆接种至1llb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养，37℃、220rmp/min震荡培养至菌液od600达到0.5，加入终浓度为0.1mm的iptg，16℃、80rmp/min过夜诱导培养。培养结束后离心收集菌体，用50mlpbs溶液重悬菌体后于冰上进行超声破碎，条件为200w，破碎3s，间歇4s，共30min，在4℃下以8000g离心收集上清液。

将收集得到的上清液进行亲和层析纯化：将上清液过镍柱，用洗涤液(10μm咪唑溶液)洗去杂蛋白，加入洗脱液(250μm咪唑溶液)洗脱纳米抗体，在得到的纳米抗体溶液中加入pbs溶液进行超滤(4000rmp/min，30min)，收集滤液，得到纯化后的纳米抗体，进行sds-page电泳分析(见图3)，测定浓度后加入终浓度20％的甘油，混匀，保存于-80℃冰柜备用。

实施例3抗his标签纳米抗体的亲和力测定

使用octet^@red96分子间相互作用检测系统(fortebio公司)对实施例2制备得到的纳米抗体进行亲和力测定。octet^@red96分子间相互作用检测系统基于生物膜层学干涉(bli)技术，只需微量样本，无需标记即可测量蛋白质与生物分子之间的相互作用。

将带his标签的蛋白质稀释到10μg/ml，实施例2中得到的纳米抗体稀释到50μg/ml，所用的稀释液为pbs+0.1％吐温20+0.1％bsa，按表3进行加样，亲和力检测图见图4。

表3亲和力检测加样表

平衡解离常数(亲和力)kd(m)＝kdis(1/s)/kon(1/ms)

经检测得到：

kdis(1/s)＝0.009213；

kon(1/ms)＝129500；

kd(m)＝kdis(1/s)/kon(1/ms)＝7.11×10^-8m。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>北京大学

<120>一种抗his标签的重链抗体及其应用

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

<211>8

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<213>人工序列

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15

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<213>人工序列

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<210>5

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