本发明属于生物技术领域中的融合蛋白，特别是涉及一种具有抑制肿瘤进程活性的融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术：
全球肿瘤发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。目前，对于肿瘤的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗及中医药辅助治疗等。困扰肿瘤治疗的根本原因是肿瘤具备一定的耐药性及复发能力。研究表明，导致肿瘤具有耐药性以及复发能力的根本原因在于肿瘤细胞干性的维持与提升，因此，肿瘤细胞干性的靶向性治疗日益成为研究的热点。肿瘤细胞的干性受基因多样性、表观遗传以及肿瘤微环境三个因素调控。鉴于肿瘤微环境因素促进肿瘤细胞干性依赖细胞间交互作用，因此，认识并挖掘促进肿瘤细胞干性的膜蛋白相互作用分子对，筛选抑制该类膜蛋白间相互作用的物质，有望为肿瘤细胞干性的靶向性治疗提供新思路。
肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中存在的巨噬细胞的总称，是肿瘤微环境中浸润免疫细胞的重要组成部分。已有研究显示，肿瘤相关巨噬细胞能够通过多种途径促进肿瘤进程，包括抑制肿瘤免疫反应、促进肿瘤免疫耐受环境的形成、促进肿瘤组织血管生成等。鉴于肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进程现象明确，清除肿瘤相关巨噬细胞、促使肿瘤相关巨噬细胞向免疫激活方向转化已成为潜在的肿瘤治疗方法。
lsectin(liversinusoidalendothelialcellslectin)是ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人类19p13.3，是c型凝集素家族的新成员。已知lsectin蛋白功能包括在黑色素瘤中负调节t细胞免疫反应，促进埃博拉病毒引发的炎性反应，抑制ctl依赖的hbv病毒清除，促进结肠癌肿瘤细胞肝转移，发明人贺福初、唐丽等之前发现lsectin可能作为黑色素瘤免疫治疗的靶点(cn104906575a，2014100898325)；治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点(cn107019703a，2016100731468)；抗丙型肝炎病毒感染药物作用靶点(cn101152558，2007101755278)；还发现lsectin或含有lsectin的融合蛋白可应用于制备抑制癌细胞向肝转移的药物，lsectin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，成为抗粘附治疗肿瘤肝转移的一个新靶标(cn101732715a，2008102257147)。
技术实现要素：
本发明提供了一种能够阻断lsectin与btn3a3之间的相互作用的融合蛋白，从而抑制肿瘤的发生与发展(抑制肿瘤进程)。
本发明所提供的具有抑制肿瘤进程活性的融合蛋白，命名为btn3a3-ig，是将人btn3a3与人igg1通过连接肽连接后获得的重组蛋白。
具体来讲，所述融合蛋白btn3a3-ig是下述氨基酸残基序列之一：
1)序列表中的序列1；
2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制肿瘤进程活性的蛋白质；
3)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制肿瘤进程活性的蛋白质，新蛋白质与序列1同源性达到80％或更高。
其中：序列表中的序列1由490个氨基酸残基组成，自氨基(n)端第1位为起始密码子，自氨基端第2-15位为信号肽，自氨基端第16-262位为人btn3a3，自氨基端第263-266位为连接肽(linker)，自氨基端第267-490位为人igg1。
编码权利要求上述融合蛋白btn3a3-ig的基因，命名为btn3a3-ig，也属于本发明的保护范围。
具体来讲，编码上述融合蛋白的基因btn3a3-ig，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中序列2的dna序列；
2)编码序列表中序列1的dna序列；
3)与所编码序列表中序列1的dna序列有一个或几个碱基变化且具有抑制肿瘤进程活性的核苷酸序列；
4)所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列2且具有抑制肿瘤进程活性的核苷酸序列；
5)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的dna序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液在65℃下洗膜。
其中：序列表中的序列2由1470个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1470位碱基，编码具有序列表中1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第46-786位碱基编码人btn3a3，自5’端第787-798位碱基编码连接肽(linker)，自5’端第799-1470位碱基编码人igg1。
含有本发明融合基因btn3a3-ig的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增融合基因btn3a3-ig中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述融合蛋白btn3a3-ig的方法。
本发明所提供的融合蛋白btn3a3-ig的表达方法，可包括以下步骤：
1)构建重组表达载体：将融合基因btn3a3-ig连接入表达载体中，得到含有融合基因btn3a3-ig的重组表达载体；
2)表达融合蛋白btn3a3-ig：将含有融合基因btn3a3-ig的重组表达载体pires2-egfp-btn3a3-ig转化或转染宿主细胞及其后代细胞，培养重组宿主细胞，使融合基因btn3a3-ig获得表达；
3)纯化：对重组表达蛋白进行纯化，得到融合蛋白btn3a3-ig。
在上述融合蛋白btn3a3-ig的表达方法中，所述步骤1)中将融合基因btn3a3-ig连接入载体pires2-egfp中的nheⅰ和salⅰ酶切位点之间，得到重组表达载体，命名为pires2-egfp-btn3a3-ig。
所述步骤2)中的宿主细胞为可表达外源基因的细胞，如293t细胞、293细胞或cho-s细胞等，优选为293t细胞。
所述步骤2)中培养含有融合基因btn3a3-ig的重组宿主细胞的培养基为适于宿主细胞生长的培养基，如无血清培养基m293ti、cdcho或cdoptichotm等，优选为无血清培养基m293ti。
所述步骤2)中含有融合基因btn3a3-ig的重组宿主细胞的培养条件为适于宿主细胞生长的培养条件，如36.5-37.5℃培养24-120小时，优选为37℃培养96小时。
所述步骤3)中可使用如proteingsepharose柱(蛋白g琼脂糖凝胶柱)、proteina/gsepharose柱(蛋白a/g琼脂糖凝胶柱)、或proteinasepharose柱(蛋白a琼脂糖凝胶柱)等对重组表达蛋白进行纯化，优选为proteingsepharose柱，纯化方法为：将细胞(含有融合基因btn3a3-ig的重组宿主细胞)培养上清加入平衡缓冲液(20mmpbs，150mmnacl，ph8.0)至ph8.0，将细胞上清加入已经用平衡缓冲液平衡好的proteingsepharose柱中，用平衡缓冲液洗柱，直到流出液中检测不到杂蛋白为止，用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集流出液，立即用中和缓冲液(1mtris·hcl，ph9.0)中和，用ph7.20.01mol/lpbs透析72h，得到融合蛋白btn3a3-ig。
本发明能够阻断lsectin与btn3a3之间的相互作用的融合蛋白btn3a3-ig作为活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用，融合基因btn3a3-mig、融合基因btn3a3-ig的表达载体、转基因细胞系或宿主菌在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明内容。优选的，所述肿瘤为肿瘤相关巨噬细胞表达lsectin且肿瘤细胞表达btn3a3的肿瘤。所述肿瘤相关巨噬细胞表达lsectin且肿瘤细胞表达btn3a3的肿瘤包括但不限于乳腺癌、骨髓瘤、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、骨巨细胞瘤、肾癌、喉癌和腮腺癌。
本发明的融合蛋白btn3a3-ig通过药学可接受的、适合于给药的药物载体制备成药物组合物，合适的药物载体为本领域技术人员熟知的，包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有融合蛋白btn3a3-ig的药物载体可通过常规方法制备。
本发明融合蛋白btn3a3-ig的药物组合物可以通过各种给药途径施用有效剂量于人类或其它哺乳动物，给药途径包括但不限于静脉注射(iv)、静脉滴注(infusion)、肌肉注射(im)、皮下注射(sc)和口服(po)等。对于不同的疾病，可以选择不同的给药途径。
本发明融合蛋白btn3a3-ig基于小鼠模型的给药剂量一般为0.5-2.5μg/g，疗程一般为15-30天。实际应用中的剂量和疗程可以根据实际情况进行调整。
本发明提供了一种具有抑制肿瘤进程活性的融合蛋白btn3a3-ig。该融合蛋白主要由两个功能部分组成：人btn3a3和人igg1，能够阻断lsectin与细胞表面表达的btn3a3之间的相互作用，从而抑制肿瘤的发生与发展。实验证明，融合蛋白btn3a3-ig与lsectin蛋白具有结合活性，融合蛋白btn3a3-ig能够阻断lsectin与细胞表面表达的btn3a3之间的相互作用，融合蛋白btn3a3-ig能够阻断lsectin促进肿瘤细胞的干性，融合蛋白btn3a3-ig可以抑制肿瘤进程，融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤进程依赖lsectin。本发明的融合蛋白btn3a3-ig为肿瘤的免疫蛋白治疗提供了一个新的思路，应用前景广阔。
附图说明
图1为重组表达的融合蛋白btn3a3-ig的考马斯亮蓝染色结果图片；
图2为重组表达的融合蛋白btn3a3-ig的westernblot检测结果图片；
图3为融合蛋白btn3a3-ig与lsectin蛋白结合活性的elisa检测结果曲线；
图4为融合蛋白btn3a3-ig阻断lsectin蛋白与膜形式btn3a3之间相互作用的粘附实验检测结果散点图；
图5为自发乳腺癌模型小鼠肿瘤体积的检测结果曲线；
图6为自发乳腺癌模型小鼠肿瘤灶个数的检测结果曲线；
图7为自发乳腺癌模型小鼠肺脏肿瘤转移灶个数的检测结果柱状图；
图8为融合蛋白btn3a3-ig阻断lsectin促进肿瘤细胞干性的检测结果柱状图；
图9为融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤进程的检测结果曲线；
图10为融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤进程依赖lsectin的检测结果曲线；
图11为实施例9实验药物作用后心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏组织切片图，显示融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤无毒副作用检测结果图片。
具体实施方式
现有技术中已披露某些肿瘤如黑色素瘤中存在的lsectin蛋白能促进肿瘤发展，在肿瘤免疫治疗的研究中，发明人进一步了解到肿瘤相关巨噬细胞表达的lsectin蛋白也具有促进肿瘤形成与发展的特性，还首次发现lsectin能够与肿瘤细胞表面表达的btn3a3相互作用，从而促进肿瘤细胞的干性，并且促进肿瘤的发生与发展。
btn3a3(嗜乳脂蛋白3-a3，butyrophilinsubfamily3membera3)为ⅰ型跨膜糖蛋白，位于人类6p22.2，是b7超家族的成员。已有文献提示btn3a3蛋白有可能负调节淋巴细胞活性，并且编码btn3a3蛋白的基因突变与肿瘤易感性相关(peedicayil,a.,etal.riskofovariancancerandinheritedvariantsinrelapse-associatedgenes.plosone5,e8884(2010).)，专利文献cn105457024a(2014105357180)公开的抗butyrophilin-3人源化抗体能够同时识别btn3a1，btn3a2和btn3a3，对治疗疾病(例如肿瘤、自身免疫性疾病和免疫排斥性疾病)是有益的。
发明人的最新研究结果显示，肿瘤相关巨噬细胞表面高表达lsectin，并能够通过与其膜受体——肿瘤细胞表面表达的btn3a3(butyrophilinsubfamily3membera3)相互作用促进肿瘤细胞干性的维持。因此，筛选并挖掘阻断lsectin与btn3a3相互作用的物质，有望成为肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤干性的靶向性药物，为肿瘤的治疗提供新思路。
因此，本发明旨在提出一种物质以能阻断lsectin与btn3a3之间的相互作用，从而抑制肿瘤的发生与发展，抑制肿瘤进程。本发明提供的该物质为一种融合蛋白，主要由人btn3a3和人igg1两个功能部分组成，能够阻断lsectin与细胞表面表达的btn3a3之间的相互作用，该融合蛋白命名为btn3a3-ig。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecularcloning:alaboratorymanual》sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、融合蛋白btn3a3-ig的表达
本发明融合蛋白btn3a3-ig的表达方法，包括以下步骤：
1)构建融合基因btn3a3-ig：根据基因库中搜索到的人btn3a3基因序列
(genbank号：bt007251.1)和人igg1基因序列(genbank号：ay623427.1)，选择btn3a3胞外区蛋白(本发明考虑lsectin与btn3a3胞外区相互作用，封闭其相互作用的蛋白需要与膜形式btn3a竞争结合lsectin，因此选择btn3a3胞外区蛋白)，再选择合适的连接肽编码序列，用人工合成的方法获得融合基因btn3a3-ig，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其编码序列为自5’端第1-1470位碱基，编码具有序列表中1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第46-786位碱基编码人btn3a3，自5’端第787-798位碱基编码连接肽(linker)，自5’端第799-1470位碱基编码人igg1；
2)构建重组表达载体：将融合基因btn3a3-ig连接入载体pires2-egfp(购自clotech公司)中的nheⅰ和salⅰ酶切位点之间，得到重组表达载体pires2-egfp-btn3a3-ig；
3)表达融合蛋白btn3a3-ig：将含有融合基因btn3a3-ig的重组表达载体pires2-egfp-btn3a3-ig转染293t细胞(来源于国家实验细胞资源共享平台)，用无血清培养基m293ti(购自北京义翘神州科技有限公司，用0.45μm滤膜(pn4614，pall)过滤，冰上保存)在37℃(±0.5℃)下培养重组293t细胞，每24小时收集细胞上清并更换培养基，至96小时(24-120小时均可)培养结束，使融合基因btn3a3-ig获得表达；
4)纯化：用proteingsepharose柱(购自康为世纪生物科技公司)(蛋白g琼脂糖凝胶柱天然蛋白g(proteing)是一种分离自g型或c型链球菌属的细胞表面蛋白，主要通过与免疫球蛋白(ig)的fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的igg。天然蛋白g具有白蛋白和细胞表面结合域，重组proteing去除了白蛋白和细胞表面结合域，以减少非特异性结合，该蛋白与sepharose偶联后可用于纯化igg。)对重组表达蛋白进行纯化，纯化方法为：将细胞(含有融合基因btn3a3-ig的重组293t细胞)培养上清加入平衡缓冲液(20mmpbs，150mmnacl，ph8.0)至ph8.0，将细胞上清加入已经用平衡缓冲液平衡好的proteingsepharose柱中，用平衡缓冲液洗柱，直到流出液中检测不到杂蛋白为止，用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集流出液，立即用中和缓冲液(1mtris·hcl，ph9.0)中和，用ph7.20.01mol/lpbs透析72h，得到融合蛋白btn3a3-ig，与预期结果相符。该融合蛋白btn3a3-ig氨基酸序列如序列表中的序列1所示，序列1由490个氨基酸残基组成，自氨基(n)端第1位为起始密码子，自氨基端第2-15位为信号肽，自氨基端第16-262位为人btn3a3，自氨基端第263-266位为连接肽(linker)，自氨基端第267-490位为人igg1。取样在紫分光光度计上测od260、od280，用bca蛋白定量试剂盒(购自康为世纪生物科技公司)计算蛋白质含量，结果为1mg/ml，分装后于-80℃保存。
实施例2、融合蛋白btn3a3-ig的考马斯亮蓝染色及westernblot检测
一、融合蛋白btn3a3-ig的考马斯亮蓝染色
收集实施例1重组表达的btn3a3-ig融合蛋白样品，配制10％sds-page凝胶，电泳，进行考马斯亮蓝染色。对照为细胞(含有融合基因btn3a3-ig的重组293t细胞)裂解液。
考马斯亮蓝染色结果如图1所示，经表达获得了分子量约55kd的蛋白，与预期结果相符。
二、融合蛋白btn3a3-ig的westernblot检测
收集实施例1重组表达的btn3a3-ig融合蛋白样品，配制10％sds-page凝胶，电泳，转膜，用含有5％脱脂奶粉的tbst溶液封闭，用抗anti-cd277(该抗体说明书指明能够识别btn3a3)(购自赛默飞)进行一抗孵育，用mouseigghrp-conjugatedantibody(购自r&d，haf007)进行二抗孵育。实验对照蛋白为人igg(购自r&d)。
westernblot检测结果如图2所示，可以看出，实施例1重组表达的融合蛋白btn3a3-ig可以与抗人btn3a3抗体特异结合，而对照蛋白人igg则无法识别，表明btn3a3-ig蛋白能够从上述蛋白表达及纯化体系中获得。
实施例3、elisa检测融合蛋白btn3a3-ig与lsectin蛋白的结合活性
用1μg/ml浓度包被lsectin蛋白(2947-cl，r&d)，4℃过夜。用pbst以5％脱脂奶粉浓度配制封闭液。洗板后，每孔300μl室温封闭2h。洗板后，以2μg/ml浓度为起始浓度倍比稀释融合蛋白btn3a3-ig并室温孵育3h。洗板后，孵育一抗anti-cd277(该抗体说明书指明能够识别btn3a3)(购自赛默飞)40min。洗板后，孵育二抗mouseigghrp-conjugatedantibody(购自r&d，haf007)30min。洗板，显色，终止，od450读数。实验对照蛋白为人igg。
elisa检测结果如图3所示，lsectin蛋白能够与融合蛋白btn3a3-ig发生直接相互作用，而对照蛋白人igg无法被anti-cd277抗体识别，而btn3a3-ig抗体呈现梯度，表明上述体系纯化出的btn3a3-ig蛋白的纯度较好。
实施例4、粘附实验检测融合蛋白btn3a3-ig阻断lsectin蛋白与膜形式btn3a3之间的相互作用
粘附实验过程中，将纯化后的融合蛋白btn3a3-ig与lsectin蛋白按照物质的量比为1:1的比例混合，孵育bt474过表达btn3a3细胞bt474-btn3a3，然后进行粘附实验，粘附实验方法参照文献：“tangl,yangj,tangx,etal.thedc‐signfamilymemberlsectinisanovelligandofcd44onactivatedtcells[j].europeanjournalofimmunology,2010,40(4):1185-1191.”。实验对照蛋白为人igg。
融合蛋白btn3a3-ig阻断lsectin与btn3a3之间相互作用的检测结果如图4所示，lsectin粘附率的计算方法为lsectin粘附阳性细胞/zsg阳性细胞，加入对照igg时，lsectin与过表达btn3a3细胞的粘附率为33.9％,计算公式为11.5/(11.5+22.4)，加入融合蛋白btn3a3-ig后，lsectin与过表达btn3a3细胞的粘附率仅为3.2％，计算公式为0.969/(0.969+29.3)。检测结果表明btn3a3-ig能够阻断lsectin与btn3a3之间的相互作用。
实施例5、检测巨噬细胞特异性敲除lsectin抑制肿瘤进程
下述实施例中的mmtv-pymt为自发乳腺癌模型小鼠；lyz2cre为lyz2基因cre酶敲入小鼠；lsectinfl/fl为loxp基因敲入小鼠；wt-pymt-lyz2为野生型自发乳腺癌模型小鼠，ko-pymt-lyz2为巨噬细胞lsectin敲除自发乳腺癌模型小鼠。具体获得方法如下：c57bl/6j背景野生型mmtv-pymt自发乳腺癌模型雄鼠与c57bl/6j背景lyz2cre雌鼠交配，经基因型鉴定，获得cre酶敲入的自发乳腺癌模型雄鼠。将该小鼠与c57bl/6j背景lsectinfl/fl雌鼠交配，经基因型鉴定可获得获得cre酶敲入且loxp基因为杂合的自发乳腺癌模型雄鼠。将该小鼠与loxp基因敲入小鼠交配，可获得wt-pymt-lyz2小鼠(mmtv+lyz2cre-lsectinfl/fl)和ko-pymt-lyz2小鼠(mmtv+lyz2cre+lsectinfl/fl)。上述标注中，mmtv代表自发乳腺癌模型转基因，cre-代表cre酶未敲入，cre+代表cre酶敲入，fl/-代表loxp基因敲入杂合子，fl/fl代表loxp基因敲入纯合子。上述cre酶敲入小鼠可从jackson公司购买，loxp基因敲入小鼠可从taconic购买，公众也可从北京蛋白质组研究中心获得。上述c57bl/6j背景野生型mmtv-pymt自发乳腺癌模型小鼠在文献“daviesa,maglioneje,mannerck,etal.effectsoffvb/njandc57bl/6jstrainbackgroundsonmammarytumorphenotypeininduciblenitricoxidesynthasedeficientmice[j].transgenicresearch,2007,16(2):193-201.”中公开过，公众可从北京蛋白质组研究中心获得。
一、自发乳腺癌模型小鼠肿瘤体积的检测
分别将巨噬细胞敲除lsectin的自发乳腺癌模型对照组小鼠wt-pymt-lyz2和实验组ko-pymt-lyz2饲养并繁殖于国家蛋白质组研究中心动物平台。于13周开始测量肿瘤体积。之后每周观察1次，使用游标卡尺分别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，计算肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为0.5*ab2。直到21周，处死小鼠。
自发乳腺癌模型小鼠肿瘤体积的检测结果如图5所示，在第11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21周，wt-pymt-lyz2组小鼠的肿瘤体积分别为0.00±0.000、3.94±7.63、17.16±23.96、34.56±37.33、81.59±79.46、106.29±93.45、188.42±127.41、396.37±181.39、599.75±224.66、814.60±336.65、1227.49±516.97(单位为mm3)；在第11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21周，ko-pymt-lyz2组小鼠的肿瘤体积分别为0.000±0.000、0.000±0.000、3.00±11.25、9.32±15.89、11.01±19.49、34.71±43.83、96.71±98.74、203.46±196.01、272.47±254.20、440.47±315.91、653.70±419.70(单位为mm3)。上述结果表明：ko-pymt-lyz2组小鼠肿瘤体积明显小于wt-pymt-lyz2组小鼠，说明敲除巨噬细胞lsectin可显著抑制小鼠乳腺癌的肿瘤成瘤及肿瘤进程。
二、自发乳腺癌模型小鼠肿瘤灶个数的检测
分别将将巨噬细胞敲除lsectin的自发乳腺癌模型对照组小鼠wt-pymt-lyz2和实验组ko-pymt-lyz2饲养并繁殖于国家蛋白质组研究中心实验动物平台。于14周开始统计单只肿瘤灶个数，之后每隔两周观察1次，直到20周，处死小鼠。
自发乳腺癌模型小鼠肿瘤灶个数的检测结果如图6所示，从图中可以看出，ko-pymt-lyz2单只小鼠肿瘤灶个数明显少于wt-pymt-lyz2小鼠，说明敲除巨噬细胞lsectin可显著抑制小鼠乳腺癌的肿瘤成瘤及肿瘤进程。
三、自发乳腺癌模型小鼠肺脏肿瘤转移灶个数的检测
分别将单只自发乳腺癌模型小鼠wt-pymt-lyz2和单只自发乳腺癌模型小鼠ko-pymt-lyz2饲养并繁殖于国家蛋白质组研究中心动物平台。于25周，处死小鼠，取出肺脏，通过石蜡包埋、组织切片及染色获得he染色结果，并通过计数获得每张切片肺脏转移灶个数的统计结果。
自发乳腺癌模型小鼠肺脏肿瘤转移灶个数的检测结果如图7所示，从图中可以看出，ko-pymt-lyz2单只小鼠肺脏肿瘤转移灶个数明显少于wt-pymt-lyz2小鼠，说明敲除巨噬细胞lsectin可显著抑制小鼠自发乳腺癌向肺部的转移。
实施例6、融合蛋白btn3a3-ig阻断lsectin促进肿瘤细胞干性
将b27(购自life)、bfgf(购自sigma)、egf(购自sigma)、胰岛素(购自sigma)、肝素(购自sigma)和dmem/f12无血清培养基混匀后，得到培养体系，各个组分在培养体系中的浓度为：b27(10ng/ml)、bfgf(20ng/ml)、egf(20ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、肝素(4μg/ml)。
将乳腺癌细胞mda-mb-231(来源于国家实验细胞资源共享平台)制成单细胞悬液，以20,000个/ml铺板，分别加入100ng的btn3a3-ig、lsectin+igg和lsectin+btn3a3-ig，以空白为对照，培养7-10天后，计算直径大于75μm的球体数量并拍照。
检测结果如图8所示，在100ng的lsectin刺激浓度下，lsectin能够促进mda-mb-231细胞球形成，但不能促进加入融合蛋白btn3a3-ig后mda-mb-231细胞球形成，表明融合蛋白btn3a3-ig可阻断lsectin促进肿瘤细胞干性。
实施例7、融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤进程
将10000个人乳腺癌细胞mda-mb-231、基质胶(bd，354230)及pbs(hyclone，sh30256.01)混匀，得到混合物；将混合物分别种植5周雌性裸鼠的下乳腺，建立人-裸鼠乳腺癌移植模型。两个月中每隔一周观测一次，使用游标卡尺分别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，计算肿瘤体积和成瘤率，肿瘤体积计算公式为0.5*ab2，成瘤率计算公式为成瘤(只)/建模总数(只)。
在细胞种植裸鼠建模前1天，按照注射药剂的不同分为如下组：
igg对照组：腹腔注射igg(10μg/只)
btn3a3-ig组：腹腔注射btn3a3-ig(10μg/只)
将mda-mb-231细胞分别接种于上述各组野生型裸鼠中。在建模后，每3天腹腔注射蛋白，通过测量肿瘤体积观测btn3a3-ig对肿瘤进程的抑制效果。
建模后第1、2、3、4、5、6、7、8周肿瘤体积分别如下：
igg组为0±0.35、9.83±9.22、18.13±12.68、41.54±26.64、134.08±66.72、362.16±186.56、661.32±359.54和1089.43±584.70(单位为mm3)；
btn3a3-ig组为0.00±0.00、3.72±5.15、4.25±6.01、6.23±8.53、30.45±9.44、71.80±48.32、125.24±106.49和240.17±255.17(单位为mm3)。
检测结果如图9所示，注射btn3a3-ig组肿瘤体积明显小于注射igg组,表明注射融合蛋白btn3a3-ig能够抑制肿瘤生长，可用于制备抗肿瘤药物及肿瘤的治疗。
实施例8、检测融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤进程依赖lsectin
下述实施例中的lsectin+/+nude-/-为野生型裸鼠，lsectin-/-nude-/-为lsectin敲除裸鼠。具体获得方法如下：将balb/c背景雄性裸鼠lsectin+/+nude-/-(购自维通利华)与balb/c背景雌性lsectin-/-nude+/+小鼠交配，获得lsectin+/-nude+/-小鼠。雄性lsectin+/-nude+/-小鼠与雌性lsectin+/-nude+/-小鼠交配，其子代中的雌性裸鼠，经基因型鉴定可获得lsectin+/+nude-/-(lsectin表达的野生型裸鼠)和lsectin-/-nude-/-(lsectin敲除裸鼠)。上述balb/c背景雌性lsectin-/-nude+/+小鼠信息在文献“zuoy,rens,wangm,etal.novelrolesofliversinusoidalendothelialcelllectinincoloncarcinomacelladhesion,migration[j].gut,2013,62(8):1169-1178.”中公开过，公众可从国家蛋白质组研究中心获得。
按照实施例7中的方法，将mda-mb-231细胞分别接种于上述各组lsectin敲除裸鼠中。在建模后，每3天腹腔注射蛋白，通过测量肿瘤体积观测btn3a3-ig对肿瘤进程的抑制效果。
建模后第1、2、3、4、5、6、7周肿瘤体积分别如下：
igg组为0.00±0.00、14.08±11.03、23.89±21.31、66.90±8.90、143.47±34.76、240.21±42.42和400.47±28.29(单位为mm3)；
btn3a3-ig组为0.00±0.00、9.93±11.47、28.19±32.63、52.12±33.41、100.68±63.98、199.67±78.36和350.12±45.83(单位为mm3)。
检测结果如图10所示，在缺失lsectin的情况下，融合蛋白btn3a3-ig不能发挥抑制肿瘤生长的作用，因此btn3a3-ig发挥抑制肿瘤生长作用依赖机体中的lsectin。
实施例9、融合蛋白btn3a3-ig抑制肿瘤无毒副作用
实验使用实施例7中的预防模型。取实验药物igg或融合蛋白btn3a3-ig治疗后，小鼠中的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏组织，放入福尔马林溶液后，送北京集思佳阳公司进行组织包埋、切片及he染色。
实验药物作用后各组织切片如图11所示，腹腔注射igg或融合蛋白btn3a3-ig后，小鼠中的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏组织无损伤，亦无出现明显的炎性细胞浸润，说明腹腔注射融合蛋白btn3a3-ig无毒副作用。
以上实施例5-实施例9是以乳腺癌细胞mda-mb-231为例进行实验验证，但本发明提出的融合蛋白btn3a3-ig同样适用于其他肿瘤相关巨噬细胞表达lsectin且肿瘤细胞表达btn3a3的肿瘤细胞。发明人已有实验证实：lsectin高表达于乳腺癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、骨髓瘤cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、肺癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、结肠癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、骨巨细胞瘤cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、肾癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、喉癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+cd14+的肿瘤相关巨噬细胞、和腮腺癌cd45+cd3-cd15-cd19-cd56-cd11b+的肿瘤相关巨噬细胞等；以cd45-定义的乳腺癌肿瘤细胞、肺癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细胞、骨巨细胞瘤肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞、腮腺癌肿瘤细胞表面均表达btn3a，多种肿瘤细胞系均表达btn3a3，细胞系包括乳腺癌细胞系：mcf7(3111c0001ccc000013)、zr75-1(3111c0001ccc000090)、bt474(3111c0001ccc000129)、t47d(3111c0001ccc000265)、mda-mb-453(3111c0001ccc000016)、skbr3(3111c0001ccc000085)、mda-mb-468(3111c0001ccc000249)、mda-mb-436(3111c0001ccc000352)；mda-mb-231(3111c0001ccc000013)；肝癌细胞系：bel-7402(3131c0001000700010)、hepg2(3111c0001ccc000035)、hcc-lm3(3142c0001000000316)、hhcc(3111c0002000000069)、hep3b(3111c0001ccc000376)、qgy7701(3131c0001000700042)、smcc7721(3111c0001ccc000087)、huh7(3131c0001000700182)；黑色素瘤细胞系：a875(3111c0001ccc000094)、a375(3131c0001000700004)；胃癌细胞系：mkn28(3111c0001ccc000482)、nci-n87(3111c0001ccc000481)、mgc-803(3111c0001ccc000227)、sgc-7901(3131c0001000700046)；结肠癌细胞系：lovo(3111c0001ccc000164)、sw480(3142c0001000000064)、ls174t(3111c0001ccc000248)、dld-1(3131c0001000700134)，因此肿瘤相关巨噬细胞表达lsectin且肿瘤细胞表达btn3a3的肿瘤包括但不限于乳腺癌、骨髓瘤、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、骨巨细胞瘤、肾癌、喉癌和腮腺癌。
序列表
<110>北京蛋白质组研究中心
<120>具有抑制肿瘤进程活性的融合蛋白btn3a3-ig及其制备方法与应用
<130>cgcnb175140w
<141>2017-11-02
<160>2
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<213>人工序列(artificialsequence)
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