本发明属于基因诊断领域，涉及一种用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒。
背景技术：
骨质疏松症是一种以骨矿含量减少和骨组织微观结构退化为特征的的全身性骨骼疾病。它最主要的危害是诱发骨质疏松性骨折，后者显著降低患者的生活质量和生存率。据报导，仅髋关节的骨质疏松性骨折其1年内病死率就达20%，生存1年以上者约25%丧失活动能力，具有严重的危害。
骨质疏松症及骨折主要发生在中老年人尤其是绝经后妇女中。随着我国人口的老龄化，骨质疏松症发生率已经跃居常见慢性疾病的第三位。我国目前的骨质疏松症患者高达9000万，而由其导致的骨折发生率超过9%，并呈逐年升高趋势。预计到2020年，仅髋部一个部位的骨折人数就将达到160万，造成900亿元的直接治疗费用以及更高的术后护理费用，给家庭和社会带来沉重负担。基于其严重性和紧迫性，国家从“九五”开始持续将骨质疏松症的防治列入国家支撑课题。
骨质疏松症的检测包括实验室检查指标的检测和辅助检测。
实验室检查指标：
骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换（包括骨形成和骨吸收）状态，在骨的高转换状态（例如i型骨质疏松症）下，这些指标可以升高，也可用于监测治疗的早期反应。但其在骨质疏松症中的临床意义仍有待于进一步研究。这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、1型原胶原肽、尿吡啶啉和脱氧吡啶啉、i型胶原的n-c-末端交联肽。正如前面所提到的，使用生化指标检测骨质疏松症的精确度不够。
辅助检查：包括骨影像学检查和骨密度检测。辅助检查的对象一般都是骨质疏松症的晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。
骨质疏松症在临床上以骨密度为标准诊断。世界卫生组织推荐的骨质疏松症诊断标准为骨密度值低于同性别同种群健康成人峰值骨密度的2.5个标准差，即t值<-2.5。骨密度主要受遗传决定，其遗传力（即遗传因素所占骨密度变化的比重）高达50-80%。因此，实施对骨质疏松症的遗传诊断是临床预防和治疗该疾病的根本途径。发明人在前期发表的文章jointstudyoftwogenome-wideassociationmeta-analysesidentified20p12.1and20q13.33forbonemineraldensity（bone.2018）也证实了骨密度与多种基因以及不同的调控有很大的关系。但是目前，并没有特别好的标志物可以用于骨密度不合格的患者，特别是幼年型骨质疏松症的诊断。
骨质疏松症患者血钙一般可维持在正常范围之内，因此不能根据血钙水平来诊断骨质疏松症。x线平片是诊断骨质疏松症常用的检查方法，骨质疏松x线平片的主要表现有骨骼的透光度增加、骨质疏松性骨折。骨密度检测是公认的诊断骨质疏松症以及了解疾病进展的方法，还可以监测治疗效果。是目前使用最广泛，也是能比较真实地反映骨骼状态的检查手段。是世界卫生组织推荐的骨质疏松症诊断金标准。但是该方法由于需要特殊的仪器，在一些贫困地区并不能够大面积的推广使用。
基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断骨质疏松症发生的方法是亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种通过检测rs1992011来特异性检测幼年型骨质疏松症的试剂盒。
本发明的目的之一是提供一种骨质疏松症易感基因snp分子标记的筛选方法，所述方法为通过分析英国生物样本库（ukbiobank）和国际骨质疏松症遗传因素联盟（gefos）这两个组织所公开的遗传学数据，发现了分子标记位点rs1992011，位置在10号染色体77746653位置（基于ncbigrch37基因组版本），所述突变为t/c与人骨质疏松症直接相关。
本发明根据ncbi上公开的rs1992011分子标记序列提供一种10q22.2染色体上rs1992011分子标记的扩增引物对，所述引物对的上游引物：gctccaaactaagactttct；下游引物：cagatcagataacaccagct；扩增片段大小：261bp。同时提供了一对检测引物对，基因型一荧光探针序列：5’-fam-agatgatgattccagtaaagt-tamra-3’；基因型二荧光探针序列：5’-vic-agatgatgatcccagtaaagt-tamra-3’。
染色体10q22.2上的rs1992011snp检测芯片可用于单独或并行检测染色体10q22.2区段t/c的突变。所述检测芯片采用本领域常规的构建方法制备获得。
本发明提供一种检测骨质疏松症遗传易感性的试剂盒。该试剂盒包括：
检测rs1992011snp多态性基因型的特异性引物对seqidno：2和3所示；pcr反应组件（包括taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、反应缓冲液、去离子水等）。
本发明的主要优点
本发明从染色体10q22.2上鉴定获得rs1992011snp标记可以用于鉴定人骨质疏松症状，所述鉴定具有准确性好，特异性高的优点。
本发明的检测方法步骤简单，snp位点检测可通过一步pcr即可完成，含有snp位点的目标序列的扩增，避免了反复多次pcr等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
具体实施方式
实施例1snp分子标记的获得
1.样本的选择
本专利的snp分子标记分析所用的样本来自于两个骨密度的大规模全基因组关联研究（gwas）：1）英国生物样本库数据集（ukbiobank，ukb)。该数据集的样本量高达142487个个体，每个个体都使用量化超声技术测定了脚后跟骨密度，同时使用高通量基因分型技术获取基因组snp的基因型序列，并使用大规模参考样本的序列数据对没有分型的snp基因型序列进行基因型补缺，从而获取基因组上所有snp的基因型信息。ukb的原始研究分析了每个snp和骨密度的遗传关联，并把分析结果公布在网上，下载网址是（http://www.gefos.org）；2）骨质疏松症遗传因素国际联盟（gefos），该联盟对30个全基因组关联的样本开展了meta分析，总样本量高达66628。每个个体使用双能x射线技术测定了全身骨密度，同时使用大规模基因分型芯片测定基因组snp的基因型信息和开展基因型补缺分析。该联盟的分析结果公布在相同网站（http://www.gefos.org）。这两个数据集的样本有少量的重合。具体地说，1553个来自于ukb数据集的个体参与了gefos研究。
2.snp质控
在ukb的公开数据集里，共有17166350个变异位点记录。首先排除掉1630877个非-snp位点（如，在多于一个碱基位置有多态性）。使用染色体和物理位置做为id，随后排除了1746个不唯一的snp位点。在gefos的公开数据集里，共有18259433个变异位点记录。使用相同的纳排标准，删除掉1967262个非-snp位点以及439850个不唯一的位点。由于gefos的数据集从30个gwasa研究meta分析而来，因此进一步排除具有显著遗传异质性的snp位点（i2>50%或qp值<0.1），共排除1608806个snp位点。经过上述质控后，共有9709677个snp位点同时存在于ukb和gefos数据集中。其中，有5224个位点上的等位基因在两个数据集中不一致（如a/g等位基因对应t/g等位基因），这些位点也被删除。最后，9704453个唯一且共存于两个数据集的snp位点用于下一步分析。
3.遗传关联分析
应用最新开发的一种统计方法mtag开展两个数据集合并的遗传关联分析。mtag集成了两个数据集的信息来评估每一个数据集内每一个snp位点的遗传效应值。它可以校正数据集间的样本重叠问题。分析结果包含了每一个snp位点的效应值以及遗传关联的p值。按照国际惯例，遗传关联的显著性水平定义成p<5.0×10-8。
结论
ukb公开数据集里共有34236个snp与脚跟骨密度在全基因组水平显著关联（p<5.0×10-8），这些snp位点被284个不同的基因组区域覆盖。从每个区域内挑选最显著的snp，共有284个最显著snp。其中，147个（51.8%）snp位点在gefos数据集里也常规显著（p<0.05），表明这些位点能够被重复验证。在mtag分析里，255（89.8%）个基因组区域仍旧在全基因组水平显著（p<5.0×10-8），但剩下的29个位点不再显著。在255个显著关联的位点里，110个位点的关联信号变强了，而145个位点的关联信号变弱了。
gefos公开数据集里共有5460个snp与全身骨密度在全基因组水平显著关联（p<5.0×10-8），这些snp被69个不同的基因组区域覆盖。其中，62个最显著snp在ukb数据集里也常规显著。在mtag分析里，64个位点（92.8%）仍旧在全基因组水平显著相关，而剩下的5个不再相关。
为了鉴定新的基因组区域，在mtag分析结果里把已经鉴定的区域排除掉，评估剩下的达到全基因组水平的所有snp。在ukb的mtag分析里鉴定了163个全基因组水平显著的snp，被13个基因组区域覆盖。同时在gefos的mtag分析里鉴定了544个显著的snp，被14个基因组区域覆盖。这其中有9个基因组区域是重合的。因此，新鉴定的关联基因组区域数是18个。18个最显著snp在ukb和gefos数据集里都常规显著（p<0.05），表明这两个数据集可以相互重复验证。18个snp中包括一个重要的snprs1992011。它的主要结果列在下表1。
表1rs1992011结果数据
从表1的数据可以看出，针对rs1992011位点存在t/c的突变，当其为t的时候，表现为具有骨质疏松症特性，当其为c时不表现出骨质疏松症特性。突变基因型t导致了骨密度的降低，从而最终导致骨质疏松症的发生，这种升高在统计学上是极端显著的，p值低至6.88×10-9，因此可以通过检测该位点基因型来检测骨质疏松症。
上面通过具体实施例详细说明本发明。本领域技术人员应清楚，本发明并不限于此处所列出的实施例，其保护范围由所附权利要求书限定，实施例仅仅是以示例的方式说明本发明，以使本发明更易于理解。
序列表
<110>刘露
<120>一种基于rs1992011检测幼年型骨质疏松症的试剂盒
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
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