类风湿关节炎大鼠模型中CHRNA7基因生物信息分析的试验方法与流程

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法。

背景技术：

α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nachrs)是调节细胞信号传导的重要因子，其在许多不同的非神经元细胞如血管和脑内皮细胞、支气管上皮细胞、角质形成细胞、星形胶质细胞、滑膜细胞、胸腺细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞均有不同程度的表达。几乎所有这些细胞上的α7nachr都直接参与了抗炎作用，例如dc上的α7nachr被激活后可抑制白细胞介素12(il-12)的产生，并且抑制dc对抗原呈递细胞依赖性t细胞的诱导激活作用(内皮细胞和粒细胞上的α7nachr激活可分别抑制黏附分子的表达和促炎因子所介导的趋化作用；单核细胞上的α7nachr被激活后，可抑制cd14和toll样受体4(tlr-4)的表达，它们都是启动免疫反应的重要分子；小胶质细胞上的α7nachr激活也可抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α(tnf-α)的产生。因此，α7nachr介导的抗炎作用是机体调节炎症反应的一个极其重要甚至是必不可少的机制，并且这种调节作用可能还是全身性的。

chrna7是编码α7nachr蛋白的关键基因，是配体门控离子通道超家族的成员，其促进突触处的快速信号传递，其异五聚体由同源亚基组成。chrna7编码的蛋白质形成同源寡聚体通道，对钙离子具有显著渗透性。

目前对于chrna7的研究还不够深入，缺乏相应的理论依据。

技术实现要素：

发明的目的在于提供类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法，本发明以类风湿关节炎雌性大鼠(cia)为研究对象，通过rt-pcr克隆获得chrna7完整cds区，对cia大鼠chrna7基因进行生物信息学分析。为以后研究其作用机制提供理论依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法，包括如下试验材料：wistar雌性大鼠36只、基础日粮、牛二型胶原、甲氨蝶呤，具体试验步骤如下；

s1：试验动物喂食处理

选取36只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：i组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；ii组，模型cia组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；iii组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；

s2：试验动物组织处理

试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组wistar雌性大鼠脾脏的相同部位，放入depc水处理过的ep管，迅速置于液氮中保存；

s3：引物设计及合成

根据ncbi网站提供的参考序列，使用primer5.0软件设计2对特异性引物，用于完整cds区测定；

s4：总rna提取及cdna合成

取出-80℃保存的cia大鼠脾脏组织，按照trizol操作说明提取总rna，核酸蛋白测定仪nd-1000测定总rna浓度和纯度，rna浓度调至1μg.l^-1左右，-80℃保存，根据试剂盒操作说明，反转录；

s5：rt-pcr

15μlpcr反应体系：正反向引物(10μmol.l^-1)各0.6μl，cdna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×estaqmastermix7.5μl；

s6：测序测定

按照说明，将回收出的dna片段连接至t3-cloing-vector，pcr仪25℃恒温10min，使回收产物与t3载体充分连接，连接产物导入感受态细胞，涂布到lb固体培养基，37℃过夜培养，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，lb液体培养基培养12-16h，菌液交由公司测序；

s7：cia大鼠chrna7基因生物信息学分析。

进一步地，s1中所有wistar大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水。

进一步地，s1的试验时间为28d，所有试验wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。

进一步地，s3中的特异性引物使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100pmol/μl，-20℃保存备用。

进一步地，s4的10μl反转录体系为：5×primescriptbuffer(forrealtime)2μl，totalrna1μl，rnasefreeddh2o7.0μl；37℃15min，85℃5s，反转录产物-20℃保存。

进一步地，s6的lb液体培养基含amp。

进一步地，s6的过夜时间为12-16h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法，通过rt-pcr获得chrna7完整cds区，并对其进行生物信息学分析。结果显示，成功获得cia大鼠chrna7完整cds区，长度为1509bp，chrna7蛋白结构不稳定，含有疏水区、跨膜结构、信号肽、潜在的磷酸化位点和2个可能的n-糖基化位点，10个可能的o-糖基化位点。与jak2、akt1、pick1蛋白具有相互作用，表明在神经元发育阶段的细胞中chrna7参与调节神经疾病及类风湿关节炎调控通路的发生，因此，本发明以类风湿关节炎雌性大鼠(cia)为研究对象，通过rt-pcr克隆获得chrna7完整cds区，对cia大鼠chrna7基因进行生物信息学分析，为以后研究其作用机制提供理论依据。

附图说明

图1为本发明的cia大鼠总rna检测结果图；

图2为本发明的cia大鼠chrna7琼脂糖电泳检测结果及测序峰值图；

图3为本发明的chrna7蛋白氨基酸组成及理化性质预测结果图；

图4为本发明的chrna7蛋白疏水性预测结果图；

图5为本发明的chrna7蛋白跨膜区预测结果图；

图6为本发明的chrna7蛋白二级结构预测结果图；

图7为本发明的chrna7蛋白信号肽预测结果图；

图8为本发明的chrna7蛋白糖基化位点预测结果图；

图9为本发明的chrna7蛋白磷酸化位点预测结果图；

图10为本发明的chrna7蛋白三级结构预测结果图；

图11为本发明的chrna7的蛋白相互作用图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法，包括如下试验材料：wistar雌性大鼠36只、基础日粮、牛二型胶原、甲氨蝶呤，具体试验步骤如下：

步骤1：试验动物喂食处理

选取36只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：i组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；ii组，模型cia组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；iii组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；所有wistar大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水，试验时间为28d，所有试验wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d；

步骤2：试验动物组织处理

试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组wistar雌性大鼠脾脏的相同部位，放入depc水处理过的ep管，迅速置于液氮中保存；

步骤3：引物设计及合成

根据ncbi网站提供的参考序列，使用primer5.0软件设计2对特异性引物，用于完整cds区测定，并进行合成，使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100pmol/μl，-20℃保存备用；引物信息见表1

表1本试验中所用引物序列

步骤4：总rna提取及cdna合成

取出-80℃保存的cia大鼠脾脏组织，按照trizol操作说明提取总rna，核酸蛋白测定仪nd-1000测定总rna浓度和纯度，rna浓度调至1μg.l^-1左右，-80℃保存，根据试剂盒操作说明，反转录；10μl反转录体系为：5×primebuffer(forrealtime)2μl，totalrna1μl，rnasefreeddh2o7.0μl；37℃15min，85℃5s，反转录产物-20℃保存；

步骤5：rt-pcr

15μlpcr反应体系：正反向引物(10μmol.l^-1)各0.6μl，cdna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×estaqmastermix7.5μl，反应条件：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，产物经3.0％琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤6：测序测定

按照说明，将回收出的dna片段连接至t3-cloing-vector，pcr仪25℃恒温10min，使回收产物与t3载体充分连接。连接产物导入感受态细胞，涂布到lb固体培养基(含amp)，37℃过夜(12-16h)培养。蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，lb液体培养基(含amp)培养12-16h，菌液交由公司测序；

步骤7：cia大鼠chrna7基因生物信息学分析。

结果与分析

(1)cia大鼠chrna7rt-pcr电泳结果

提取cia大鼠脾脏组织总rna，电泳检测结果如图1所示，5s、18s、28s条带单一、较亮，说明cia大鼠总rna质量较好，无降解。以反转录后的cdna为模板进行chrna7和β-actinrt-pcr进行温度梯度检测，设定温度1-5分别为：60℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、50.7℃，经琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，不同温度梯度下，均检测到扩增产物，且条带单一。表明chrna7引物特异性较强、无引物二聚体出现，可用于序列检测；

(2)cia大鼠chrna7蛋白理化性质分析

chrna7蛋白由502个氨基酸组成(图3a)，分子质量单位：56631.70da，等电点理论值：6.24，酸性氨基酸总数(asp+glu)：50个，碱性氨基酸总数(arg+lys)：45个，理论推测氨基酸分子式为c2561h3958n670o713s34，半衰期：30h，波长280nm时的吸光度(a)值：1.782，不稳定系数：43.72，说明chrna7蛋白结构不稳定(图3)。

(3)cia大鼠chrna7蛋白疏水性分析

疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力，对于保持蛋白质三级结构的形成和稳定起重要作用，是分析蛋白质跨膜区重要一步。本发明的试验采用expasyprotscale对cia大鼠chrna7蛋白疏水性预测，系统自动绘制cia大鼠chrna7蛋白疏水性图，根据kyte-doolittle原则氨基酸亲水标准大于0为疏水区，小于0为亲水区可知，cia大鼠chrna7编码蛋白chrna7含有疏水区域(图4)。

(4)cia大鼠chrna7蛋白跨膜区预测

蛋白含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位在膜上的锚定蛋白或离子通道蛋白。本发明的试验采用tmhmm2.0server程序对毕赤酵母chrna7蛋白进行了跨膜区预测，由图5可见，cia大鼠chrna7蛋白存在跨膜结构。

(5)cia大鼠chrna7蛋白二级结构预测

用hopfield神经网络(hnn)预测chrna7二级结构：α-螺旋31.08％，β转角3.78％，无规则卷曲43.03％(图6)。

(6)cia大鼠chrna7蛋白信号肽预测

信号肽是指导蛋白多肽链合成与穿膜转移的决定因素，引导蛋白的跨膜作用。signalp3.0根据信号肽序列特征对信号肽位置进行预测。如果s-scoremean＞0.5，则预测为分泌蛋白，存在信号肽，预测结果显示：最大c值为23，最大y值为23，最大s值为7，s-scoremean＞0.5，cia大鼠chrna7蛋白存在信号肽(图7)。

(7)cia大鼠chrna7蛋白糖基化位点预测

糖基化主要影响多肽构象，促使其正确折叠，侧链上的多羟基糖还可以影响蛋白的水溶性及所带电荷的性质；增强蛋白稳定性，起细胞识别和保护质膜作用。cia大鼠chrna7蛋白糖基化位点预测发现2个可能的n-糖基化位点，10个可能的o-糖基化位点(图8)。

(8)cia大鼠chrna7蛋白磷酸化位点预测

磷酸化位点是信号传导等发育调控分子中常见结构，在细胞增殖及细胞周期中有着广泛的调节作用。通过netphos软件分析，cia大鼠chrna7蛋白磷酸化位点的预测结果见图9，发现有19个丝氨酸(ser)、9个苏氨酸(thr)和7个酪氨酸(tyr)，存在潜在的磷酸化位点。推测cia大鼠chrna7在类风湿性关节炎信号转导和调控中具有重要作用。

(9)cia大鼠chrna7蛋白三级结构预测

弄清蛋白的三级结构进而理解其结构与功能的关系具有重要作用，利用在线软件构件3d-jigsaw模型，用pymol软件对cia大鼠chrna7蛋白三级结构进行预测分析的结果见图10。

(10)蛋白-蛋白相互作用分析

使用sequencesearchtool识别chrna7编码蛋白与其他蛋白相互作用关系。图11为chrna7的蛋白相互作用图。chrna7编码蛋白与chrna蛋白家族以及参与神经疾病的jak2、akt1、pick1蛋白具有相互作用。表2显示蛋白功能间的相互作用和这些蛋白参与神经系统疾病的介导通路。表明在神经元发育阶段的细胞中chrna7参与调节神经疾病。

表2蛋白功能间的相互作用和参与神经系统疾病的介导通路

通过以上试验分析，得出本发明的结论为：

cia大鼠chrna7完整cds区长度为1509bp，编码502个氨基酸，分子质量单位：56631.70da，等电点理论值：6.24，酸性氨基酸总数(asp+glu)：50个，碱性氨基酸总数(arg+lys)：45个，推测氨基酸分子式：c2561h3958n670o713s34，半衰期：30h，波长280nm时的吸光度(a)值：1.782，不稳定系数：43.72，蛋白结构不稳定，含有疏水区、跨膜结构、信号肽、潜在的磷酸化位点和2个可能的n-糖基化位点，10个可能的o-糖基化位点。与jak2、akt1、pick1蛋白具有相互作用，表明在神经元发育阶段的细胞中chrna7参与调节神经疾病。

综上所述，本发明提出的类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法，通过rt-pcr获得chrna7完整cds区，并对其进行生物信息学分析。结果显示，成功获得cia大鼠chrna7完整cds区，长度为1509bp，chrna7蛋白结构不稳定，含有疏水区、跨膜结构、信号肽、潜在的磷酸化位点和2个可能的n-糖基化位点，10个可能的o-糖基化位点。与jak2、akt1、pick1蛋白具有相互作用，表明在神经元发育阶段的细胞中chrna7参与调节神经疾病及类风湿关节炎调控通路的发生，因此，本发明以类风湿关节炎雌性大鼠(cia)为研究对象，通过rt-pcr克隆获得chrna7完整cds区，对cia大鼠chrna7基因进行生物信息学分析，为以后研究其作用机制提供理论依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。