一种含有人工标签的杂交探针的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种含有人工标签的杂交探针。
背景技术：
：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象称为荧光共振能量转移(fret)现象。fret程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生fret，随着距离延长，fret呈显著减弱。fret杂交探针可用于对待测序列进行检测(matthews,jaanalyticalbiochemistry169(1988)1-25)，其特征为同时使用与待测序列同一链互补相邻位点互补的两个单链杂交探针对，两个探针用不同荧光成分标记，当特定波长激发时，第一种成分(供体)将吸收的能量转移到第二种成分(受体)上，通过检测第二种成分的荧光发射量对待测序列的量进行检测。当退火到靶序列时，杂交探针之间必须非常接近，通常第一个探针标记的3`端和第二个探针的5`端间隙为1-5个碱基，约10-100埃。除进行实时pcr外，fret杂交探针还可用于熔解曲线分析，当杂交探针结合到靶序列上时，受体基团通过fret原理发射出荧光，在解链温度时，杂交探针从靶序列上脱离，受体基团的荧光信号降低，通过求导观察荧光信号降低的最大值来判读熔解温度(tm)值，通过tm值来判断杂交序列是否是目标序列。fret杂交探针一般使用两条分别携带供体基团和受体基团的探针顺序杂交在扩增区域的邻近部位，而熔解曲线的tm值则由这两条探针本身的杂交序列决定(一般是取决于tm值较低的那条，因为tm值较低的相比tm值较高的先脱落下来)，当杂交区域出现snp、缺失、插入等突变时，便会造成tm值的变化，影响结果判读。技术实现要素：本发明的目的是提供一种不受扩增区域snp、缺失、插入等突变的影响，能使熔解曲线分析时的tm值保持恒定的含有人工标签的杂交探针。本发明的含有人工标签的杂交探针，包括上游探针和下游探针，其特征在于，包括：a、在上游探针的3’端连有荧光受体基团或荧光供体基团，在下游探针的5’端连有人工标签序列，还含有第三探针，所述的第三探针是与人工标签序列杂交的探针，第三探针的5’端连有荧光供体基团或荧光受体基团，所述的人工标签序列不与上游探针、下游探针和扩增模板杂交，人工标签序列杂交区域的tm值低于上游探针和下游探针与扩增区域杂交部分的tm值；或b、在上游探针的3’端连有人工标签序列，在下游探针的5’端连有荧光受体基团或荧光供体基团，还含有第三探针，所述的第三探针是与人工标签序列杂交的探针，第三探针的5’端连有荧光供体基团或荧光受体基团，所述的人工标签序列不与上游探针、下游探针和扩增模板杂交，人工标签序列杂交区域的tm值低于上游探针和下游探针与扩增区域杂交部分的tm值；或c、在上游探针的3’端连有第一人工标签序列，在下游探针的5’端连有第二人工标签序列，还包括有第三探针和第四探针，所述的第三探针与第一人工标签序列杂交，所述的第四探针与第二人工标签序列杂交，在第三探针的3’端连有荧光受体基团或荧光供体基团，在第四探针的5’端连有荧光供体基团或荧光受体基团，所述的第一人工标签序列和第二人工标签序列不与上游探针、下游探针和扩增模板杂交，第一人工标签序列和第二人工标签序列互相不杂交，第一人工标签序列或第二人工标签序列杂交区域的tm值低于上游探针和下游探针与扩增区域杂交部分的tm值。本发明通过在传统的两条杂交探针(上游探针和下游探针)基础上引入新的不与扩增区域杂交的人工标签序列，并使用额外的专门与人工标签区域杂交的探针提供荧光供体或受体基团。因为人工标签序列杂交区域的tm值低于前两条杂交探针与扩增区域杂交部分的tm值，因此整个体系的tm值仅由人工标签部分的tm值决定，从而使熔解曲线分析时的tm值保持恒定，不受扩增区域snp、缺失、插入等突变的影响，此外，由于一条专门与人工标签序列杂交的探针可以与多个人工标签结合，通过人工标签序列部分碱基的改变获得不同的tm值，因此一个荧光通道上可仅使用一条携带荧光供体基团的探针和/或一条携带荧光受体基团的探针，从而降低整个反应体系的背景荧光强度和节约成本。附图说明：图1是seq1、seq2、seq3、seq4同时杂交后熔解曲线分析图；图2是seq1、seq3、seq4同时杂交后熔解曲线分析图；图3是seq1、seq3、seq4杂交后熔解曲线分析图；图4是杂交原理图；图5是杂交后熔解曲线分析图；图6是杂交后熔解曲线分析图；图7是杂交原理图；图8是杂交后熔解曲线分析图；图9是杂交原理图。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：seq1：tacccggccggaatccctgcgtctagcggacgtccgccataactcaaattgcgattctgtseq2：acagaatcgcaatttgagttatggcggacgtc-bhq1seq3：ccggtcaaggttgagttatgaaggacccgctagacgcagggattccggccgggtaseq4：fam-aaaaaaggtccttcatcgctcagccttcaccgg-c3spacerseq1为人工合成的扩增区域，供上游探针、下游探针杂交。seq2为上游探针，3'端修饰bhq1作为受体基团。seq3为下游探针，5'端携带一段人工标签序列，以下划线注明。seq4为检测探针(第三探针)，5'端修饰fam作为供体基团。按照以下方式进行杂交：1、seq1、seq2、seq3、seq4同时杂交，其杂交后熔解曲线分析如图1所示；2、seq1、seq3、seq4同时杂交，其杂交后熔解曲线分析如图2所示；3、seq1、seq2、seq4同时杂交，其杂交后熔解曲线分析如图3所示；杂交原理图如图4所示。反应体系：人工合成杂交区域seq12pmol携带受体基团探针seq22pmol携带人工标签的杂交探针seq32pmol携带供体基团的荧光探针seq42pmolpcr反应液2xpcr反应缓冲液12.5ulddh2o补充总体积至25ul反应条件：95度10分钟热启动45-80度1度/8秒熔解曲线分析熔解曲线分析从图1可以看出，当修饰受体基团的seq2、和携带人工标签的seq3同时与扩增区域seq1杂交，且携带供体基团的seq4杂交在人工标签上时，可得到设计的熔解曲线峰。从图2可以看出，当携带受体基团的seq2缺失时，由于反应体系内缺乏受体基团，无法发生fret现象，无法得到熔解峰。从图3可以看出，挡携带人工标签的seq3缺失时，由于荧光探针seq4无法杂交到人工标签上，也无法发生fret现象，无法得到熔解峰。实施例2：使用两条杂交探针和一条荧光供体探针，其中一条杂交探针兼做荧光受体探针1、seq5：aacccagtgaatttatgattagca呼吸道合胞病毒a型rsva-正向引物2、seq6：tcccataatatacaagtatgatctcaa呼吸道合胞病毒a型rsva-反向引物3、seq7：ggctcttagcaaagtcaagttgaatgatacactc-bhq1呼吸道合胞病毒a型rsva特异性杂交探针2，同时以bhq1修饰3’端兼做荧光受体探针4、seq8：ccggtcaaggttgagttatgaaggaccaacaaagatcaacttctgtcatccagcaaatac-c3spacer呼吸道合胞病毒a型rsva特异性杂交探针25、seq9：ggtacctcccataatatacaagtatgatctcaatccataaatttcaacacaatattcacacaatctaaaacaacaactctatgcataactatactccatagtccagatggagcctgaaaattatagtaatttaaaattaaggagagatataagatagaagatggggcaaatacaaagatggctcttagcaaagtcaagttgaatgatacactcaacaaagatcaacttctgtcatccagcaaatacaccatccaacggagcacaggagatagtattgatactcctaattatgatgtgcagaaacacatcaataagttatgtggcatgttattaatcacagaagatgctaatcataaattcactgggttggatcc呼吸道合胞病毒a型rsva人工质粒，作为模板反应体系：反应条件：实验结果如图5所示，从图5可以看出，阳性孔(有熔解峰的线，106拷贝作为模板)有tm＝45度的阳性峰，阴性孔(拷贝数为0的模板)没有阳性峰，与实验设计一致。实施例3：使用两条杂交探针、一条荧光供体探针和一条荧光受体探针。1、seq10：ggctcttagcaaagtcaagttgaatgatacactctacttagaccggcgaagtgccaagcgactcc下划线为rsva杂交探针部位，无下划线为荧光受体探针结合部位2、seq11：ggagtcgcttggcacttcgccggtctaagta-bhq1荧光受体探针反应体系：反应条件：实验结果图6，可见阳性孔(有熔解峰的线，106拷贝作为模板)有与目标温度一致的45度的tm峰，阴性孔(拷贝数为0作为模板)没有熔解峰。杂交原理图见图7。实施例4：使用一条杂交探针、一条荧光供体探针和利用一条引物兼作为荧光受体探针1、seq12：aacccagtgaatttatgatt(bhq1)agca呼吸道合胞病毒a型rsva正向引物，倒数第5个碱基修饰荧光受体基团bhq12、seq13：cacatcaataagttatgtggcatgttattaatcacagaagaccggtcaaggttgagttatgaaggacc杂交探针1，下划线部分为rsva特异性杂交序列，无下划线为荧光供体探针结合序列3、seq14：ggtccttcatcgctcagccttcaccggaaaaa-fam荧光供体探针，3‘端修饰荧光供体基团fam反应体系：正向引物seq1220pmol反向引物seq62pmol杂交探针1seq135pmol荧光供体探针seq145pmol模板seq9106拷贝和0拷贝pcr反应液2xpcr反应缓冲液12.5ulddh2o补充总体积至25ul反应条件：实验结果图8，可见阳性孔(有熔解峰的线，106拷贝作为模板)有与预期一致的熔解峰，阴性孔(拷贝数为0作为模板)没有明显熔解峰。杂交原理图见图9。当前第1页12