本发明涉及基因工程领域，特别指一种检测牛肌肉pparγ基因表达量的方法。
背景技术：
复过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomepro-liferators-activatedreceptor，ppar)是一类属于转录因子超家族成员的由配体激活的核转录因子。ppars在哺乳动物中拥有α、δ、γ3个亚型，作为在脂肪细胞分化过程中必不可少的且起着核心的作用的pparγ，主要表达于脂肪组织和免疫系统，具有正向调节脂肪细胞分化的作用。pparγ在c/ebps等相关脂肪因子的相互作用下，通过多条信号通路参与影响脂肪细胞的增殖和分化。不同物种动物在脂肪形成的机制方面并不完全相同，因此，pparγ基因在不同物种动物机体内的分布也有所差异。另外，脂肪细胞的转录调控是一个复杂生理过程，pparγ基因调控在众多脂类代谢的目的基因表达的过程中扮演重要角色，从而认为pparγ是脂肪形成过程中关键因子。同时多种转录因子也可直接或间接影响pparγ的功能，发挥对脂肪细胞增值和分化的调控作用。目前关于该基因在牛肌肉上的报道较少。因此需要开发一种能够准确检测牛肌肉ppar基因表达量的方法，以便于其在肉品质研究中的应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测牛肌肉pparγ基因表达量的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测牛肌肉pparγ基因表达量的方法，具体包括以下步骤：
1)从待检测的牛肉组织中提取总rna，再通过反转录反应制备cdna样品；
2)将制备的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，内参基因gapdh的qpcr扩增反应体系为：
牛pparγ基因的qpcr扩增反应体系为：
3)在定量pcr仪上进行检测，荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品3个重复，计算牛pparγ基因的表达量。
在上述技术方案中，所述的引物对p-f和p-r的序列为：
p-f：5’-gtgaagcccattgaggacat-3’，见序列表seqno.1。
p-r：5’-agctgcacgtgttctgtcac-3’，见序列表seqno.2。
在上述技术方案中，所述的引物对g-f和g-r的序列为：
g-f：5’-cgtgtctgttgtggatctgacctg-3’，见序列表seqno.3。
g-r：5’-caacctggtcctcagtgtagcct-3’，见序列表seqno.4。
在上述技术方案中，所述内参基因gapdh和牛pparγ基因的qpcr扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。
在上述技术方案中，所述g-f、g-r、p-f和p-r的浓度均为20μmol/l。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过设计pparγ基因特异性引物对，内参引物gapdh的qpcr扩增，以及对qpcr结果的相对定量分析，准确、快速地分析了pparγ基因在牛肌肉中的表达情况。本发明所建立的检测pparγ基因表达水平的qpcr检测方法，可用于精确检测不同品种牛肌肉pparγ基因的表达水平。该发明所述方法可用于检测不同品种牛肌肉pparγ基因的表达水平，对深入研究牛pparγ基因功能提供参考，方法简便，易操作。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
一种检测牛肌肉pparγ基因表达量的方法，具体步骤如下：
1)设计pparγ基因序列的特异性引物对p-f和p-r和内参基因引物对g-f和g-r：
参考genbank收录的pparγ基因序列(genbankaccessionno.nm-181024)，内参基因gapdh(genbankaccessionno.0nm-001034034)，利用primerpremier3.0软件设计引物，并通过ncbi中blast功能，检测引物的特异性。
p-f：5’-gtgaagcccattgaggacat-3’，见序列表seqno.1。
p-r：5’-agctgcacgtgttctgtcac-3’，见序列表seqno.2。
所述的引物对g-f和g-r的序列为：
g-f：5’-cgtgtctgttgtggatctgacctg-3’，见序列表seqno.3。
g-r：5’-caacctggtcctcagtgtagcct-3’，见序列表seqno.4。
2)提取待测牛的肌肉组织总rna并合成组织cdna；
样品采集：3岁蒙古牛和西门塔尔牛各6头，屠宰后采集各试验牛左侧胴体第12至第13肋骨处的背最长肌，液氮冷冻后放于-80℃冰箱保存备用。
牛肌肉组织总rna的提取采用thermofisherscientific公司的总rna提取盒(trizoltmreagent)提取，提取方法参照试剂盒说明书。总rna的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总rna浓度通过nanodrop2000微量紫外分光光度计测定。总rna使用takara逆转录试剂盒(primescripttmrtmastermix)进行逆转录成组织cdna。
3)以待测牛的肌肉组织cdna为模板，以1)所述的引物对g-f和g-r为引物，qpcr扩增内参基因gapdh；以待测牛的肌肉组织cdna为模板，以1)所述的引物对p-f和p-r为引物，qpcr扩增牛pparγ基因；
其中，内参基因gapdh的qpcr扩增反应体系为：
牛pparγ基因qpcr扩增反应体系为：
其中，g-f、g-r、p-f和p-r的浓度均为20μmol/l；
内参基因gapdh和牛pparγ基因的qpcr扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。
其中，为了确保内参基因的准确度，上述两个扩增反应体系中g-f、g-r、p-f和p-r的浓度均为10μmol/l；上述两个扩增反应体系中，
内参基因gapdh和牛pparγ基因的qpcr扩增反应程序相同，均为：95℃预变性30sec，95℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸20sec，40个循环。
其中，按照takara公司生产的
4)检测3)中qpcr的结果，计算表达量。
采用2-δδct值计算目的基因的mrna相对表达量。
δct＝ct(牛pparγ基因循环数)-ct(内参基因gapdh循环数)
ct值：反应体系内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。通过测定值可计算出基因起始的模板量。以管家基因作为内参基因，通过内参基因对目的基因进行标准化，可测定出目的基因转录表达的相对量。采用spssversion20.0软件进行两个品种肌肉样品间的差异显著性检验，采用单因素方差分析，p≤0.05表示差异显著，所有结果均以平均值和标准差来表示。结果如表1所示。
表1牛肌肉pparγ基因mrna相对表达量
通过上述实施例证实了所建立的pparγ基因表达水平的q-pcr检测方法，可用于精确检测不同品种牛肌肉pparγ基因的表达水平。该发明所述方法可用于检测pparγ基因的表达水平，对深入研究牛pparγ基因功能提供参考，方法简便，易操作。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。