一种检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种利用ema-qpcr法检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法。

背景技术：

传统生猪养殖过程中，饲料中添加抗生素虽然能促进猪的生长，并预防疾病，但抗生素的长期使用，造成细菌耐药性和食品安全问题。随着人们生活水平的提高，对食品安全的要求越来越高。为了生产出绿色健康高品质的肉制品，越来越多的企业尝试利用发酵饲料进行生猪养殖。发酵饲料具有较好的适口性，能有效维持猪群肠道微生态平衡，降低猪群腹泻率和死亡率，提高猪肉品质，是饲料业发展的趋势。发酵饲料养猪具有很多优点，但由于发酵饲料成分比较复杂，在我国尚没有一个完善的发酵饲料品质评定体系。当前人们普遍认为乳酸菌含量是评定发酵饲料品质的一项重要指标。乳酸菌能够提高母猪的繁殖性能，显著提高哺乳仔猪的生长性能，降低母猪的发病率，对仔猪腹泻具有明显的改善作用，但是起主要作用的是活乳酸菌，因此通常用发酵饲料中活乳酸菌量评价发酵饲料品质。

目前常用的检测发酵饲料含菌量的方法是平板计数法。平板计数法虽然准确，但是操作过程比较繁琐，用时较长。

因此，提供一种操作简便，用时短且结果准确的检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种利用ema-qpcr法检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法，以乳酸菌为研究对象，建立乳酸菌数量与ct值的标准曲线，通过q-pcr检测样品ct值，计算样品中的乳酸菌量；用叠氮溴乙锭(ethidiumbromidemonoazide，ema)来消除死菌dna扩增造成的误差，提高检测结果的准确性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法，具体步骤如下：

(1)设计特异性引物；

(2)建立标准曲线；

(3)计算乳酸菌数量：

a、将待测发酵饲料样品溶解，加入ema溶液，室温避光孵育5-10min；

b、将孵育完成的样品置于冰上，用碘钨灯照射，使ema与dna充分结合，且未结合的ema完全光解；

c、提取样品dna；

d、q-pcr扩增细菌基因组dna，获得ct值；

e、根据获得的ct值，利用标准曲线计算乳酸菌数量。

采用上述技术方案的有益效果为：本发明以乳酸菌为研究对象，建立乳酸菌数量与ct值的标准曲线，通过q-pcr检测样品ct值，计算样品中的乳酸菌量。用叠氮溴乙锭(ethidiumbromidemonoazide，ema)来消除死菌dna扩增造成的误差。ema为一种核酸染料，能够透过死菌细胞膜，但不能透过活菌细胞膜；在曝光条件下ema与dna发生共价结合，没有结合的ema则被光解，从而在扩增过程中抑制死菌dna的扩增，提高检测结果的准确性，为后续发酵饲料品质评定提供技术支持。

进一步，步骤(1)所述特异性引物的引物序列为：

上游引物f：5’-tccggatttattgggcgtaaagcga-3’；seqidno.1；

下游引物r：5’-tcgaattaaaccacatgctcca-3’；seqidno.2。

进一步，步骤(2)所述标准曲线为y＝-3.3491x+38.457，相关系数r²＝0.9938。

进一步，步骤a将待测发酵饲料样品溶解，加入ema溶液，使ema的终浓度为3ug/ml-4ug/ml，室温避光反应至ema与dna充分结合。

进一步，步骤b：将反应完成的样品置于冰上，用碘钨灯在距样品20cm处照射10-20min使ema光解。

进一步，步骤d所述q-pcr扩增的反应体系为：2×taqsbyrgreenmix10μl，上游引物0.8ul，下游引物0.8ul，dna2ul，ddh2o6.4ul。

进一步，步骤d所述q-pcr扩增的反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃34sec，40个循环。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用ema-qpcr法检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法，ema试剂能够有效的抑制死菌dna的扩增，排除了由于死菌dna扩增所造成的误差，建立了乳酸菌对数值与ct值之间的标准曲线，线性关系良好；通过对8份发酵饲料进行检测，结果与平板计数符合度较高处于同一数量级；与传统的平板计数法相比较，ema-qpcr法能将检测时间从近30h，缩减至5h，在缩减了检测时间的同时，还在很大程度上减少了检测的工作量，极大提高了检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明ema终浓度与死菌ct值的柱形图；

图2附图为本发明ema终浓度与活菌ct值的柱形图；

图3附图为本发明ct值与活菌浓度对数值的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

ema：美国omegabio-tek公司；mrs琼脂培养基、mrs肉汤培养基：青岛科园海博生物技术有限公司；细菌dna提取试剂盒、premixextaq^tmii：takara。鼠李糖乳酸菌的保藏编号为atcc53103。

实施例1

(1)平板计数

用枪头取少许鼠李糖乳杆菌接种于100mlmrs液体培养基中，放入摇床150rmin^-1培养10-12h，获得细菌悬液原液。将细菌悬液原液用生理盐水依次倍比稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，每个浓度取100ul均匀涂于mrs固体培养基上，每个浓度涂3个平板，倒置于37℃厌氧箱中培养24-36h，选择合适的浓度进行平板计数，计数结果取三个平板的平均值，平板计数乳酸菌量为6.33×10⁸cfu/ml。

取1ml细菌悬液原液置于100℃水中煮10min制备死菌悬液。

(2)ema处理样品

无水乙醇配制100ug/ml的ema母液，-20℃避光保存。在菌液中加入一定浓度的ema，室温避光反应10min，将菌液置于冰上，用碘钨灯(500w)在距样品20cm处照射10min使ema光解，用细菌基因组dna提取试剂盒，提取样品dna，用50μl的elitiombuffer洗脱dna。

(3)q-pcr扩增细菌基因组dna

采用20ul的反应体系：2×taqsbyrgreenmix10μl，上游引物0.8ul，下游引物0.8ul，dna2ul，ddh2o6.4ul。反应条件：95℃30sec；95℃5sec，60℃34sec，40个循环。

其中，引物序列如下：

(4)ema浓度的确定

在1ml(5.5×10⁸cfu/ml)活细菌悬液中加入一定量的ema(100ug/ml)，使其最终浓度为3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、10ug/ml，按照上述步骤处理样品，进行q-pcr。在1ml(5.5×10⁸cfu/ml)死细菌悬液中加入一定量的ema(100ug/ml)，使ema最终浓度为2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、10ug/ml，按上述步骤处理样品，进行q-pcr，结果如表1和图1-图2所示。

表1ema浓度与ct值

结果表明，当ema浓度大于3ug/ml时，能够有效抑制5.5×10⁸cfu/ml的细菌dna扩增，ct值处于较高的水平；当ema浓度小于4ug/ml时，5.5×10⁸cfu/ml的活菌dna扩增没有影响。ema的最终浓度为3ug/ml-4ug/ml，本发明采用3ug/ml。

(5)活菌/死菌混和液的配制及标准曲线的建立

平板计数乳酸菌量为6.33×10⁸cfu/ml，分别取活菌和死菌进行10倍梯度稀释按照表2进行混合，经过ema处理，进行q-pcr，ct值结果如表3所示。

表2活菌/死菌混合液的配制

表3q-pcr实验ct值

以表3活菌浓度的对数值为横坐标，ct值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2，ct值与活菌浓度呈线性关系，方程式：y＝-3.3491x+38.457，相关系数r²＝0.9938。

(6)混合菌液中乳酸菌数量的检测分析

分别利用平板计数、emaq-pcr、q-pcr检测混合菌液中乳酸菌的数量，结果如表4所示。

表4：平板计数、emaq-pcr、q-pcr检测乳酸菌的数量

表4的结果表明：经ema处理后的q-pcr的ct值计算出的乳酸菌数量与平板计数的乳酸菌数量更接近，故emaq-pcr能较为准确的反应乳酸菌的活菌数量。

实施例2饲料样品检测

从某饲料厂采取发酵饲料7份，实验室制作发酵饲料1份，共计8份样品。每份样品取10g溶于90ml生理盐水中，放入摇床37℃150r活化45min。用双层纱布过滤，取滤液1ml，500r离心5min，取上清加入4ml离心管中，将沉淀用1ml生理盐水溶解，500r离心5min，取上清。重复上述步骤4次，共收集上清4ml。将收集的4ml上清6000r离心10min，弃上清将沉淀溶于1ml生理盐水中。将上述所得溶液按照所构建方法分别进行q-pcr和平板计数，比较两种方法所得结果。结果如表5。

表5：平板计数、emaq-pcr检测乳酸菌的数量

表5的结果表明：经ema处理后的q-pcr的ct值计算出的乳酸菌数量与平板计数的乳酸菌数量接近，本发明建立的emaq-pcr法能较为准确的反应乳酸菌的活菌数量。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>新乡学院

<120>一种检测发酵饲料中乳酸菌数量的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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