检测样本中BAALC基因相对表达量的引物、探针及方法和试剂盒与流程

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中baalc基因的方法、引物、探针和试剂盒，采用荧光pcr技术，检测人类急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)患者体内baalc基因的表达水平。

背景技术：

急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)是最常见的白血病类型，主要由于白血病干细胞克隆性增殖，致骨髓正常造血功能受到抑制所致。aml诊断时存在的细胞遗传学异常是预测疾病预后的重要依据。近年来，采用分子遗传学来评价aml患者的预后，其中包括基因的异常表达和突变。baalc(brainandacuteleukemia，cytoplasmic)基因位于8q22.3，最早在神经外胚层组织中发现其表达。tanner等于2001年在造血前体细胞中亦发现baalc的表达。研究报道baalc在aml患者中呈过表达，且其过表达是正常核型急性髓系白血病(amlwithnormalcytogenetics，cn-aml)患者预后不良的影响因素。国内亦有一些文献报道baalc过表达的临床意义，然而其结果不尽相同。本研究应用实时定量pcr(real—timequantitativepcr，rq-pcr)方法检测中国人群aml患者中baalc的表达情况，并对其临床意义进行探讨。

baalc基因定位于染色体8q22.3，编码一种与任何已知蛋白或功能域均无同源性的蛋白质。baalc主要表达于神经外胚层来源组织和造血前体细胞，成熟的骨髓和外周血单核细胞不表达。aml、急性淋巴细胞自血病(acutelymphocyticleukemia。all)及cml急变期有baalc基因的高表达，而cml慢性期及cll则检测不到。自2001年stephan等发现部分aml、all患者存在baalc基因的过表达。且baalc基因的过表达与aml患者的不良预后相关以来.研究baalc基冈在aml中的表达水平及其与预后的关系成为近来的热点。定性rt—pcr，不利于观察基因表达水平。rq—pcr具有可定量、敏感度高等优点，目前已经成为检测病毒和肿瘤基因表达的一个主要手段。

随着技术的进步，定量pcr技术已广泛应用于基因表达水平的研究。其中实时定量pcr是目前公认的最准确，重复性最好的定量pcr研究方法。其通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板定量及定性的分析，优点如下：l、特异性强，灵敏度高；2、封闭反应，无需pcr后处理；3、定量范围宽，可达到l0个数量级；4、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断；6、可实现一管双检或多检；7、操作安全，缩短时间，提高效率。已成功用于肿瘤基因表达量的研究。常见的方法有sybrgreeni染料法,双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光pcr技术结合taqman探针法应用于baalc基因检测。

技术实现要素：

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量pcr技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因baalc的定量标准曲线，检测目的基因baalc相对于内参基因abl的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足baalc基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。

用于baalc基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：

(1)检测baalc基因的上游引物baalc-f、下游引物baalc-r和探针

baalc-probe，

baalc-f：agtccaagcagaagggcagat；

baalc-r：aggctcagaaggtcccaacaa；

baalc-probe：fam-aattctactgagtccctggcaagac-tamra。

(2)检测内参基因abl的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，

abl-f：gatacgaagggagggtgtacca；

abl-r：ctcggccagggtgttgaa；

abl-probe：fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。

本发明还提供一种检测样本中baalc基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的rna；

(2)将rna逆转录为cdna；

(3)加入cdna到反应管中，利用针对baalc的上、下游引物和探针检测样本中的baalc基因的荧光信号；利用针对abl内参基因的上、下游引物和探针检测样本中的abl内参基因的荧光信号；

baalc-f：agtccaagcagaagggcagat；

baalc-r：aggctcagaaggtcccaacaa；

baalc-probe：fam-aattctactgagtccctggcaagac-tamra

abl-f：gatacgaagggagggtgtacca；

abl-r：ctcggccagggtgttgaa；

abl-probe：fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra；

(4)根据baalc基因的荧光信号和abl内参基因的荧光信号，确定样本中的baalc基因的相对表达量。

本发明最后提供了检测baalc基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr反应液，所述检测体系pcr反应液包括：

(1)检测baalc基因的上游引物baalc-f、下游引物baalc-r和探针baalc-probe，

baalc-f：agtccaagcagaagggcagat；

baalc-r：aggctcagaaggtcccaacaa；

baalc-probe：fam-aattctactgagtccctggcaagac-tamra。

(2)检测内参基因abl的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，

abl-f：gatacgaagggagggtgtacca；

abl-r：ctcggccagggtgttgaa；

abl-probe：fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有baalccdna序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有baalccdna序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述试剂盒还包括样本rna提取试剂，所述样本rna提取试剂包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。

进一步地，所述样本rna提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta。

本发明中的“baalccdna序列”指的是baalc基因经转录后产生的mrna经逆转录后产生的cdna序列，或者根据这种cdna序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的baalccdna序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。

本发明的有益效果：将实时荧光pcr技术结合采用taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和baalc目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内baalc的表达。相比于以往的fish和△△ct法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，可为人类急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)患者的治疗提供参考和依据，有助于个体化医疗方案的制定和疾病预后判断。

附图说明

图1为puc57-t/baalc阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图。

图2为puc57-t/baalc阳性质粒作为标准品在不同浓度下制成的标准图。

图3为100copies/μlpuc57-t/baalc阳性质粒的扩增曲线图。

图4为正常人群血液样本baalc表达量/abl内参表达量数值分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测样本中baalc基因的试剂盒，包括：

(1)红细胞裂解液，包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta。

(2)rna提取试剂，包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。

(3)rna逆转录试剂，revertraaceqpcrrtkit试剂盒(toyobo公司)。

(4)检测体系pcr反应液，thnderbirdprobeqpcrmix(2×)(toyobo公司)。检测体系pcr反应液包括检测baalc基因的上游引物baalc-f、下游引物baalc-r和探针baalc-probe，与检测内参基因abl的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，

baalc-f：agtccaagcagaagggcagat；

baalc-r：aggctcagaaggtcccaacaa；

baalc-probe：fam-aattctactgagtccctggcaagac-tamra。

abl-f：gatacgaagggagggtgtacca；

abl-r：ctcggccagggtgttgaa；

abl-probe：fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。

(5)阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，阳性对照品为含有baalccdna序列的阳性质粒溶液，阴性对照品为不含有baalccdna序列的质粒溶液，空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

本发明所使用的引物和探针seqidno:1～6的碱基序列如表1所示。

表1.引物和探针的序列

实施例2

本发明方法的操作流程：

(1)抽提血液中的组织rna：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulrnase-free水溶解沉淀。

(2)cdna制备：参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将(1)中制备出的rna反转为cdna。

(3)试剂配制：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xul，每人份23ul分装，如表2所示：

x＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

表2baalc反应体系

其中forwardprimer、reverseprimer和tagmanprobe分别选自baalc-f、baalc-r和baalc-probe，或者abl-f、abl-r和abl-probe。

(4)加样：将(3)中配制的检测体系pcr反应液和步骤(2)中制备出的cdna2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。每个样本也需要2个重复以确保结果的稳定。

(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。

实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测

在制备阳性质粒时，先直接合成出baalccdna，再分别插入到事先选择的质粒质粒(这里以puc57-t质粒为例进行说明)中，这样就可制备出puc57-t/baalc阳性质粒。

将制备出的puc57-t/baalc阳性质粒进行梯度稀释，获得拷贝数为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copies/μl的阳性质粒，并以这些不同浓度的阳性质粒作为模板，按实施例2进行检测，结果如图1所示，其中，在图1中各条扩增曲线对应的阳性质粒浓度从左至右分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²。由图1可知，baalc和abl均起线，本发明的引物和探针可用来检测puc57-t/baalc阳性质粒。随后，以不同浓度的阳性质粒对数值作为横坐标，以通过每种浓度的阳性质粒按实施例2进行检测获得的ct值作为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。经计算可知，图2中的标准曲线的斜率为-3.32，扩增效率为99.9％，由此可见发现本发明对阳性质粒的扩增效率能达到要求。

将10²、10¹、10⁰copies/μl的puc57-t/baalc阳性质粒按实施例2进行检测，每种不同浓度的阳性质粒重复检测10次，结果如图3所示，由图3可知，本发明对这种阳性质粒的检测下限为100copies。

实施例4检测临床血液样本

取送检的外周血样本数48例，按实施例2所述方法提取样本rna、配制试剂并检测。每例样本加入检测体系pcr反应液中2ul。同时做阳性、阴性和空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。每个样本2个重复以确保结果的稳定。通过对48例正常人(baalc表达量/abl内参表达量)比值的统计，得到正常人的表达范围。(排除无效样本5例)由此得结果：baalc在正常人群中表达量极低或不表达，浓度比值在0-0.008之间。实验结果如表3和图4所示。

表348例临床血液样本baalcmrna表达水平

本发明可快速检测样本中是否存在baalc基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏，可为人类急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。

序列表

<110>福州艾迪康医学检验所有限公司

<120>检测样本中baalc基因相对表达量的引物、探针及方法和试剂盒

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agtccaagcagaagggcagat21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aggctcagaaggtcccaacaa21

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aattctactgagtccctggcaagac25

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gatacgaagggagggtgtacca22

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctcggccagggtgttgaa18

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gcttctgatggcaagctctacgtctcct28