一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及临床检测技术领域，具体涉及一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒。

背景技术：

血流感染(bloodstreaminfection，bsi)，是临床上重症感染性疾病之一，根据症状不同可分为败血症、脓毒症和脓毒性休克，具有较高的发病率和致死率，其常见感染源包括细菌、真菌。现阶段，血流感染诊断的金标准是血培养，通过生化方法或显微镜观察确定病原体，但该方法耗时长，通常需要数天时间才能确定结果，且对于难培养或无法培养的病原体，则难以准确检测。在缺乏准确诊断结果的情况下，临床医师为了缓解病症，可能盲目使用抗生素，导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等。

市场上现有的检测试剂盒中，试剂盒检测的靶点，大都涵盖菌株范围较小，或者针对耐药基因的位点较少，而且试剂盒的检测下限通常不小于10cfu/ml，但针对临床血流感染患者，其血液样本中致病菌的含量为不大于10cfu/ml，甚至更低，这些试剂盒的灵敏度较低，往往不能达到阳性检测的效果。此外，目前的一些试剂盒中的检测样本需要是血培养阳性菌落，使得这类试剂盒不能满足临床快速诊断的目的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒，使得所述试剂盒能够提高低拷贝致病菌的阳性检出率，具备高灵敏度，同时耗时较短。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒，包括致病菌回收试剂盒、致病菌核酸提取试剂盒和pcr核酸检测试剂盒；

所述致病菌回收试剂盒包括红细胞裂解液和血细胞裂解液，所述血细胞裂解液为盐酸胍或山梨醇的rnase-free水溶液；

所述致病菌核酸提取试剂盒可同时提取致病菌的rna和dna；

所述pcr核酸检测试剂盒包括致病菌扩增引物探针对，所述致病菌扩增引物探针对根据致病菌16srdna序列设计。

在本发明致病菌回收试剂盒中，在红细胞裂解后再添加本发明所述血细胞裂解液进行裂解，利用致病菌细胞壁和人类细胞细胞膜对所述血细胞裂解液裂解性能存在的差异，最大限度保证致病菌不被裂解，获得菌体的最大效率回收，同时去除人类血细胞，高效保证血液样本中致病菌的分离，提高检测灵敏度；致病菌核酸提取试剂盒可将致病菌中的dna、rna进行共提取，保证足够的核酸模板供下游基因检测；pcr核酸检测试剂盒中的引物探针对根据致病菌16srdna的多拷贝序列设计引物，保证检测靶基因位点的拷贝数不止1个，并且原核生物中的核酸片段不存在内含子(即rna序列与dna序列一致)，因此检测致病菌dna、rna可通用一对引物探针对。以上措施可保证试剂盒在检测过程中具备较高灵敏度，确保低拷贝的致病菌的阳性检出率。

作为优选，所述致病菌回收试剂盒还包括红细胞裂解液和/或指示溶剂，所述指示溶剂为与血液不互溶且密度大于全血密度(1.06g/ml)的介质；在本发明具体实施方式中，所述介质为氟化油；所述红细胞裂解液组成为nh4cl8.29g/l，khco31.00g/l，na2edta37.2mg/l，ph7.2-7.4。

作为优选，所述血细胞裂解液为浓度为4-7m的盐酸胍的rnase-free水溶液或浓度为1-5％的山梨醇rnase-free水溶液；在本发明具体实施方式中，所述盐酸胍的浓度为4m、5m、6m或7m，所述山梨醇的浓度为1％、2.74％或5％。

作为优选，所述致病菌核酸提取试剂盒为天根dp316试剂盒。其中同类产品或可获得相同核酸样本的设备耗材、试剂均可被使用。

作为优选，所述pcr核酸检测试剂盒还包括致病菌dna/rna共检测试剂体系，所述共检测试剂体系为一步法逆转录体系或者两步法逆转录体系。在核酸检测过程中，本发明优势是将dna/rna共同检测，以此获得更多的阳性检测信号；其中，一步法逆转录体系即为双酶检测体系或ttx体系，但并不局限于此具体体系，其他一步法逆转录体系均可采用，比如市售thermofisher品牌，货号12574030，superscript3one-steprt-pcrsystemwithplatinumtaqhighfidelitydnapolymerase；市售qiagen品牌，货号210210，one-steprt-pcrkit；市售neb品牌，货号e5315s，one-steprt-pcrkit等。

所述两步法逆转录体系主要指先将rna经过逆转录酶转录为cdna，而后连同dna在taq酶下扩增；

在本发明具体实施方式中，所述一步法逆转录体系包括pcr反应缓冲液、dntps、mn(oac)2、ttx酶中的一种或两种以上试剂。

作为优选，所述pcr为液滴数字pcr。液滴数字pcr检测平台对于定性产品来说，其检测下限可低至1拷贝，也可同时进行多重pcr，可进一步提高试剂盒的检测灵敏度，同时针对血流感染80％以上的常见致病菌和耐药位点检测，提高检测效率。

在本发明具体实施方式中，所述致病菌扩增引物探针对为鲍曼不动杆菌扩增引物探针对、粪肠球菌扩增引物探针对、屎肠球菌扩增引物探针对、铜绿假单胞菌扩增引物探针对、沙门菌属扩增引物探针对、金黄色葡萄球菌扩增引物探针对、溶血葡萄球菌扩增引物探针对、大肠埃希菌扩增引物探针对、人葡萄球菌扩增引物探针对、绿色链球菌扩增引物探针对、阴沟肠杆菌扩增引物探针对、肺炎克雷伯菌扩增引物探针对、头葡萄球菌扩增引物探针对和表皮葡萄球菌扩增引物探针对中的一种或两种以上。

在本发明具体实施方式中，所述致病菌扩增引物探针对还包括耐药位点blakpc引物探针对、耐药位点meca引物探针对、vana引物探针对和vanb引物探针对中的一种或两种以上。

由以上技术方案可知，本发明血细胞裂解液可最大限度保证致病菌不被裂解，高效保证血液样本中致病菌的分离；利用活菌体中rna水平远远高于基因组dna拷贝数的特性，同时提取致病菌的基因组dna和rna，并采用一步法或两步法进行逆转录和dna/cdna的同时扩增检测。相对于常规的致病菌检测方案(血培养的菌体鉴定时间需要1-5天)，可在2-3小时内，快速并保证微量致病菌的阳性检出率。

附图说明

图1所示为采用山梨醇为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字pcr扩增结果；

图2所示为采用盐酸胍为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字pcr扩增结果；

图3所示为采用sds为血细胞裂解液的模拟样本液滴式数字pcr扩增结果。

具体实施方式

本发明公开了一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述样本处理方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述试剂盒用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，如无特别说明，所涉及的对比试验中，除去各组应有的技术区别外，其他试验所用试剂、样本等材料以及试验环境均一致。

在本发明中，通过致病菌16srdna序列的特殊性，设计通用上下游引物，通过单条探针实现多重pcr方案，最终对临床样本中多菌株及耐药位点的联合检测。

其中，所述探针均带有荧光标记，例如fam、vic、cy5、rox、fam-bhq1、cy5-bhq2等；具体如下：

表1扩增引物

表2探针序列

以下就本发明所提供的一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒做进一步说明。

实施例1：本发明所述试剂盒

1、致病菌回收试剂盒

表3

利用红细胞裂解液，将患者血浆样本进行红细胞裂解，血液样本与红细胞裂解液加入比为1：(1-4)，4度孵育10分钟左右，将红细胞裂解后的样本通过离心获得包含菌体及白细胞的沉淀；

所述沉淀按照(1-2)：(1-2)的比例加入血细胞裂解液，加入20-50微升的氟化油，充分震荡混匀。

加入蛋白酶k裂解蛋白，55度孵育5-10分钟，12000rpm离心10分钟，分离菌体。

将离心后的样本，小心去除上清液，获取氟化油及其下层的沉淀，获得分离样本。

2、致病菌核酸试剂盒(优选为天根dp316试剂盒)

优选市售天根dp316试剂盒按说明进行dna和rna的提取，具体如下：

分离样本按1:1的比例加入裂解液，加8ul蛋白酶k(25mg/ul)，56℃水浴10-30min左右，孵育期间摇晃震荡2次。

在裂解液孵育后的分离样本中加入0.2-1微克的carrierrna并晃动混匀，将上清液加入吸附柱cb3中，离心30s，弃废液；

备注：由于吸附柱最大承受量为700ul，因此分多次将所有的上清液过柱。

加500ul缓冲液gd，12000rpm离心30s，弃废液。

加600ul缓冲液pw，12000rpm离心30s，弃废液。重复一次。

12000rpm空转2min，把吸附柱转移至干净的离心管中，室温放置2min，使乙醇挥发。

往吸附柱中悬空加入30ul事先预热的ddw，室温放置5min，12000rpm离心2min。弃吸附柱，剩下的为混合核酸溶液(dna+rna)。

3、液滴pcr核酸检测试剂盒(一步法逆转录体系)

优选品牌名称：thermofisher，货号：a28521；

表4

根据具体实验方案中摸板量和引物探针对的组合，反应体系会有改动，上述方案是单探针的示范pcr体系；

实验反应程序：

25度5分钟，50度20分钟；95度10分钟；(95度15秒；60度30秒，共40个循环)；

反应程序结束后，液滴芯片经过配套设备，进行信号判读，最终获得实验结果。

此外，本发明还可以采用两步法逆转录体系，具体如下表5和表6；

表5(thermofisher，货号：18080400)

实验反应程序：65度5分钟25度10分钟50度50分钟；

表6pcr反应体系试剂及组分(thermofisher，货号：a26359)

实验反应程序：95℃10min(95℃，15sec，60℃，30sec)40cycles；

实施例2：对比试验

人为往血液中掺入了5-10cfu的大肠杆菌作为模拟样本，分别按照本发明试剂盒(实施例1)和常规血培方法进行检测，然后在相同的液滴式数字pcr条件下扩增，结果见表7；

表7

以上实验结果显示，在相同微量菌体浓度条件下，经过本发明样本处理方法获得的样本经过检测能够获得更多的阳性点数，而常规血培方法无法获得阳性点数，表明本发明所述方法能够保证微量致病菌的阳性检出率。

实施例3：不同血细胞裂解液的对比

仍以往血液中掺入的大肠杆菌(9cfu)作为模拟样本，将模拟样本分为三份，参照实施例1的试剂盒处理，区别在于血细胞裂解液不同，然后在相同的液滴式数字pcr条件下扩增，结果见表8和图1-3；

表8

由图1-3以及表8结果可以看出，相同微量浓度致病菌的前提下，采用盐酸胍和山梨醇能够获得更多的阳性扩增点数，而sds所获得的阳性扩增点数较少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>领航基因科技（杭州）有限公司

<120>一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒

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