一种基于逻辑判断的原子尺度DNA测序方法与流程

本发明涉及的是一种基于逻辑判断和声子谱测量的单壁碳纳米管对双链dna的测序方法，通过检测碳纳米管的声子振动图谱(实验上通过检测纳米管的拉曼光谱)，实现在原子层次对双链dna分子的快速测序，该发明属于第四代dna测序方法。

背景技术：

dna测序技术是一种分析特定dna片段的碱基对排列方式的技术。该测序技术具有快速、精准和低成本等优势，有利于dna测序的广泛应用，如用于疾病诊断、生物技术以及对重要物种的基因测序等。

纳米孔测序(nanoporesequencing)是第四代dna测序技术。该技术是利用电泳驱动dna分子通过纳米孔，并通过阻塞电流法、电容法及隧道电流法等来检测不同类型碱基通过纳米孔时导致的物理参数的变化。目前制备纳米孔的材料主要分为两类，一类是生物纳米孔，即天然的或人工改造过的蛋白质分子，如α溶血素、mpsa蛋白和phi29dna聚合酶等。另一类是采用微加工技术制备的固态纳米孔，如氮化硅、聚乙烯亚胺(pei)、二硫化钼和石墨烯等。尽管生物纳米孔可以识别单链dna上的单个碱基，但蛋白质容易受环境的影响，如环境的ph值、温度和机械振动等均能使蛋白质发生变性，除此之外，蛋白质纳米孔具有不能承受较高的电压、错误率较高和易老化等缺点，这些因素均限制了生物纳米孔在dna测序中的应用。固态纳米孔不具备生物纳米孔中存在的上述缺点，更重要的是可以将其进行批量生产和器件集成。然而，由于传统的固态纳米孔测序通道太长，无法实现对单个碱基的分辨。目前已经通过大量的理论计算发现，以石墨烯为代表的新一代二维材料纳米孔，用于dna测序具有诸多优点，但由于dna容易粘附在孔侧，且检测的电流信号强度也不够高，导致很难对单碱基进行分辨。人们发现单壁碳纳米管通道内简单的环境和完美均匀的石墨壁能为dna测序提供一个良好的平台，近年来，单壁碳纳米管也被用来进行dna测序。然而，目前用于dna测序的单壁碳纳米管与传统固态纳米孔一样，均具有测序通道太长的特点，也无法实现对单个碱基的分辨。到目前为止，采用固态纳米孔进行dna测序的目标还远远没有实现。

通过理论计算的研究证实，纳米孔测序可以通过测量离子电流、电子隧穿电流或平面内电流来实现超高速测序，但这一方案还未得到实验证明。这是因为，要实现利用纳米孔测序的目标，必须克服两大障碍。首先，dna在纳米孔的易位速率相较于实验中所能测得的信号带宽和噪声水平来说仍太快。因此，要想实现纳米孔测序，dna易位的速度必须减慢或降低信号噪声。其次，核苷酸或碱基的二级和三级结构在纳米孔附近或内部形成，导致纳米孔测序的不同碱基之间的信号重叠，进而难以实现对单碱基分辨率。因此，为了提高dna测序的分辨率，一方面需要避免dna在纳米孔附近形成新的二级或三级结构，同时也要增加dna在纳米测序通道内的滞留时间，这是目前dna测序技术需要解决的关键技术问题。

技术实现要素：

本发明首次提出从原子尺度的逻辑关系出发，利用dna不同碱基对间氢键数量的不同，从而对碳纳米管的作用力不同，进而影响碳纳米管的声子振动模式，最终需结合碳纳米管振动模式的差异实现对dna单碱基对的测序。对碳纳米管声子振动模式的检测实际上是对其内氢键数量的检测，而氢键是生物分子间最强的一种分子间作用力，相比于常规固体纳米孔对电子电流信号的检测，对氢键信号的检测可以大大提高信号强度。本发明的目的在于提供一种新的dna测序方法，弥补采用现有固态纳米孔进行dna测序的不足，使固态纳米孔测序成为一种快速、低成本、高精度的dna测序方法。

据报道，双链dna的螺旋直径在2.2～2.6nm之间，每个碱基对的间隔约为0.3nm。本发明使用长度为0.62nm的单壁碳纳米管，长度近似等于两个碱基对的距离。当双链dna以一定的速度通过单壁碳纳米测序通道时，通道中仅能同时保有两个碱基对，与仅检测单个碱基对的二维材料纳米孔相比，主要具有三个优势。第一，检测2个碱基对可以大大提高信号强度；第二，由于dna测序通道长度的增加，延长了dna在测序通道中的滞留时间，相当于降低了dna的易位速率；第三，由于双链dna间较强的氢键相互作用，对双链dna的检测可以有效减少dna的新的二级结构或三级结构的形成，有效避免了碱基对间的信号重叠。如果我们继续延长碳纳米管测序通道的长度，同时检测出2个以上的碱基对，虽然能进一步增加dna的滞留时间，但也大大增加了dna碱基对组合的数量，为单碱基的分辨带来困难。例如，当同时检测3个碱基对，碳纳米管内的碱基对组合分别为：(at，at，at)、(at，cg，at)、(at，at，cg)、(cg，at，at)、(cg，at，cg)、(at，cg，cg)、(cg，cg，at)和(cg，cg，cg)。即当同时检测n分碱基对时，则碱基对的组合数量为2ⁿ。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

(1)测试已知碱基对组合下的碳纳米管的声子态密度图谱，建立标准基线。

本发明中采用的单壁碳纳米管的长度为目的是当双链dna以一定的速度穿过碳纳米管测序通道时，在碳纳米管通道内始终保有两对碱基。在单壁碳纳米管通道内的碱基对组合为仅有4种组合，分别为(cg，cg)、(cg，at)、(at，cg)、和(at，at)，由于c：g间氢键个数为3，a：t间氢键个数为2，相应的4种碱基对组合的氢键个数分别为6、5、5、4。由于碳纳米管通道内碱基对组合不同，碳纳米管通道内的氢键数量就会不同，氢键的作用使碱基对间的作用力就会不同，最终对碳纳米管的作用力也会不同，反应在碳纳米管的声子态密度的图谱就会存在差异。因此，首先测试已知序列的dna，检测出4种碱基对所对应的碳纳米管的声子态密度图谱，建立标准基线。由于混合碱基对组合(cg，at)和(at，cg)的氢键数量相同，则反应在碳纳米管的声子态密度图谱就会相同。最终测得的声子态密度图谱仅有3种。

(2)与标准基线比对，对目标dna进行测序。

对目标dna进行测序，测试结果与步骤1中测出纳米管的声子态密度进行比对，可以很容易地确定碳纳米管内氢键数量分别为6和4的碱基对，即(cg，cg)和(at，at)组合，对于具有5个氢键的组合(cg，at)和(at，cg)，仅从碳纳米管的振动谱差异无法进行区分，可通过对其相邻碱基对分析(可追溯已经测试过的碱基对或对dna继续进行测试)，直至出现氢键数量是4或6的振动谱，再通过碱基对序列间的逻辑分析，判断出具有5个氢键数量的碱基对序列，进而确定(cg，at)和(at，cg)组合。

下面给出一个例子加以说明。以单链dna的碱基序列为5’-actagaacgtgttctaat-3’作为目标dna，根据碱基对间互补配对原则，显然另一个单链序列为3’-tgaatcttgcacaagatta-5’。对前三个碱基对进行测序发现，依次得到了碱基对组合为(at,cg)、(cg,at)、(at,at)的声子态密度图谱。虽然前两个碱基具有相同的声子态密度谱，我们不能区分是(at,cg)还是(cg,at)，但第三和第四个碱基对(ta,at)很容易识别。因此，根据逻辑关系可以推断第二个碱基对必须是cg，第一个碱基对是at。因此，我们可以用这种方法推导出其他的碱基对。

可将上述碳纳米管作为一个测序单元，然后将该单元组成阵列，实现dna的高通量测序，提高测序速度。理论计算得到是声子态密度，实际实验中测得是碳纳米管的拉曼活性振动模。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是本发明一种基于单壁碳纳米管dna测序方法的示意图。

图2示出碱基c与碱基g间的成键信息。

图3示出碱基a与碱基t间的成键信息。

图4～7示出在单壁碳纳米管(19，19)内，4种碱基对植入后测得的碳纳米管的在低频区的声子态密度图谱信息，其中图4是(at，at)植入后测得的碳纳米管的声子态密度图谱；图5是(at,cg)植入后测得的碳纳米管的声子态密度图谱；图6是(cg，cg)植入后碳纳米管的声子态密度图谱；图7是(cg，at)植入后碳纳米管的声子态密度图谱。

具体实施方式

为了能够更清楚的理解本发明的技术方法，下面结合具体实施例做详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

为了实现准确、快速、低廉的dna测序，本发明实施例提供了一种基于碳纳米管逻辑dna方法，如图1所示。

所述碳纳米管的直径为2.4～3.0nm。

所述dna链为双链dna。

以上所述的dna测序装置的测序步骤如下所示：

步骤1：首先对已知碱基对的4种组合(cg，cg)、(cg，at)、(at，cg)和(at，at)进行测序，采用拉曼光谱测量碳纳米管的声子振动图谱，图3～7以碳纳米管swcnt(19,19)为例的在低频区的声子态密度图谱；

步骤2：对目标dna进行测量，将测量结果与步骤1中的标准振动图谱进行对比，确定碱基序列。当出现混合碱基对的振动图谱时，即出现具有5个氢键时的振动图谱时，需结合相邻碱基对的逻辑关系进行推断，进而完成对dna的测序工作。

由于本发明采用单壁碳纳米管作为dna测序的核心部件,当dna分子穿过纳米孔时,可以对碳纳米管的声子态密度图谱进行测量。本发明提出的测量信号易于获得，且操作简单，有效改善传统纳米孔测量离子阻塞电流时信噪比低、易受外界环境干扰等问题,可以提高测序精度、加大测序速度，从根本上解决纳米孔dna测序所面临的问题。

本领域普通技术人员可以理解:附图只是一个实施例的示意图,附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。

以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的,可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下,即可以理解并实施。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。