一种检测微小残留病MRD的试剂盒的制作方法
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测微小残留病mrd的试剂盒。
背景技术：
淋系血液癌症主要包括t/b淋巴细胞白血病、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤，而微小残留病(minimalresidualdisease,mrd)是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者经诱导治疗缓解后，体内仍残留少量癌细胞的状态，最终可能会引起疾病复发。白血病可分为淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病，是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，根据不同淋巴细胞起源可分为b细胞、t细胞、nk细胞淋巴瘤。多发性骨髓瘤是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是b淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。
随着化疗、特异性靶向治疗、造血干细胞移植(hsct)治疗等技术的不断改进，血液癌症的治疗效果甚至可达到血液学完全缓解(hematologiccompleteremission，hcr)，但获得hcr并不足以保证患者长期无病存活，因此复发仍是困扰癌症治愈的一个难点，究其原因主要与血液癌症细胞微小残留病(mrd)有关。
近年来研究表明，血液癌症复发与mrd密切相关，mrd升高可提前预示血液癌症的全面复发。因此，采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的实验方法对血液癌症患者进行定期mrd检测，对评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。血液癌症的治疗方案与新型有效的药物的配合，患者疾病缓解程度更深，mrd监测的时间点及检测灵敏度对于复发预测尤为重要。
b/t细胞基因座上大量的v(可变区)、d(多变区)、j(连接区)基因片段在b/t细胞受体的形成过程中会产生多样性重组。这种v-d-j基因的重组赋予了每一种b/t细胞自己独特的细胞受体(bcr/tcr)，从而使得每一个bcr/tcr的序列能有效的成为一个b/t细胞克隆的特异生物标志物。因此对bcr/tcr基因序列组成进行测序，可以很好的定位每一种b/t细胞，其中包括癌变的b/t细胞，并且mrd检测灵敏度可达至少可达10-6(0.0001％)。
由于bcr/tcr基因的最大特点是v、d、j基因片段的随机重组，根据各种已知v、d、j基因的保守区域设计的多重引物扩增不同受体链，再添加测序标签。但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果癌细胞的bcr/tcr产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。
现有技术中，文献《designandstandardizationofpcrprimersandprotocolsfordetectionofclonalimmunoglobulinandt-cellreceptorgenerecombinationinsuspectlymphoproliferations:reportofthebiomed-2concertedactionbmh4-ct98-3936》中设计了3个vh-jh、2个dh-jh、2个igk、一个igl、3个tcrb、2个tcrg、1个tcrd、3个bcl1-igh、一个bcl2-igh一共18个多重pcr反应，涉及了107个不同引物，最终将这一套引物命名为biomed2。但是引物未覆盖所有v、j基因片段，容易产生多重pcr引物偏好性，不可直接适用于高通量测序，而且无法进行pcr和测序扩增错配修复。文献《deep-sequencingapproachforminimalresidualdiseasedetectioninacutelymphoblasticleukemia》中使用内参建立癌细胞的计算模型。
目前检测微小残留病(mrd)的方法包括多参数流式细胞仪检测(fc)、聚合酶链反应(pcr)、融合基因检测实时荧光定量聚合酶链反应(rt-qpcr)、等位基因寡核苷酸杂交法(as0-pcr)和高通量二代测序(ig/trngs)等。其中最常用的是基于分子免疫学的流式细胞仪术(flowcytometry)，但其灵敏度仅可达10-4数量级(0.01％)，且该方法对mrd结果判断的准确性在很大程度上取决于每个实验室的实验条件和操作者的个人经验，标准化程度低，而且有研究表明在化疗过程中由于化疗药物的影响使癌细胞的免疫表型发生变化，即“免疫漂移”现象，可影响mrd检测结果的可靠性和准确性。聚合酶链反应(pcr)的方法无法定量，只能看到ig/tcr的基因重排的情况。融合基因实时荧光定量聚合酶链反应(rt-qpcr)检测方法只能应用于存在融合基因异常的急性白血病，不能提示白血病细胞的来源。等位基因寡核苷酸杂交法(as0-pcr)的应用较普遍存在于欧洲，该方法需要根据每一位患者定制一套引物，容易出现非特异性扩增，实验条件和操作技术要求较高，耗时耗人力，而且癌细胞核酸发生突变就会造成mrd检测的假阴性。
技术实现要素：
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种检测微小残留病mrd的试剂盒，该试剂盒可以检测癌细胞的同时可发现新突变的癌细胞；同时，该试剂盒采用高通量测序技术结合生物信息学分析，mrd的检测灵敏度可达至少在100万个细胞中检测到一个癌细胞，即10-6(0.0001％)。
一方面，本发明提供了一种检测微小残留病mrd的试剂盒，包括建库试剂盒和illuminaindex试剂盒，其中所述建库试剂盒包括分别检测igh(vdj)、igh(dj)、igk、igl、trb、trg、trd、bcl1/igh、bcl2/igh的带有umb(uniquemolecularbarcode,单分子标签)的多重pcr引物组，housekeeping基因pcr引物以及内参dna。
进一步地，其中所述检测igh的pcr引物中，上游引物序列如seqidno:1-16所示，下游引物序列如seqidno:24所示；其中检测igh(dj)的引物中，上游引物序列如seqidno:17-23所示，下游引物序列如seqidno:24所示；其中检测igk的引物中，上游引物序列如seqidno:25-34所示，下游引物序列如seqidno:35-37所示；其中检测igl的引物中，上游引物序列如seqidno:38-54所示，下游引物序列如seqidno:55-57所示；其中检测trb的引物中，上游引物序列如seqidno:58-88所示，下游引物序列如seqidno:89-100所示；其中检测trg的引物中，上游引物序列如seqidno:101-106所示，下游引物序列如seqidno:107-109所示；其中检测trd的引物中，上游引物序列如seqidno:110-112所示，下游引物序列如seqidno:113-116所示；检测bcl1/igh的引物对，上游引物序列如seqidno:117所示，下游引物序列如seqidno:118所示；检测bcl2/igh的引物对，上游引物序列如seqidno:119-127所示，下游引物序列如seqidno:118所示；其中n：a或t或c或g；r：a或g；w：a或t；y：c或t；s：c或g；b：t或c或g。
进一步地，其中建库试剂盒中还包括2×
进一步地，所述的housekeeping基因引物序列为seqidno:250-253。
进一步地，所述的内参dna序列为seqidno:128-226所示。
进一步地，其中所述illuminaindex试剂盒中包括测序引物和标签，所述测序引物和标签的序列为seqidno:227-247所示，其中上游测序引物和标签的序列为seqidno:227-238所示，下游测序引物和标签的序列为seqidno:239-247所示。
进一步地，试剂盒中各个成分的含量依据试剂盒的不同规格有所不同。
表1建库试剂盒的具体成分及含量
表2illuminaindex试剂盒的具体成分及含量
另一方面，本发明提供了一种对t、b细胞受体进行高通量测序的方法，采用所述的试剂盒，具体包括以下步骤：
(1)取待测样本；
(2)采用所述试剂盒中的建库试剂盒对待测样本进行扩增；
(3)采用所述试剂盒中的illuminaindex试剂盒对步骤(2)的产物进行扩增；
(4)生物信息学分析，对扩增产物进行定量定性分析。
可选地，步骤(2)中根据目标基因(igh(vdj)、igh(dj)、igk、igl、tcrβ、tcrγ、tcrδ、bcl1/igh、bcl2/igh)在pcr反应体系中添加任意三条对应的1％inputdna模板量的已知序列的内参dna，与样本同时进行特异性扩增。
可选地，所述的内参dna序列为seqidno:128-226所示。
可选地，所述步骤(2)中同时扩增housekeeping基因β-actin，采用的引物序列如seqidno:250-251，或同时扩增housekeeping基因gapdh，采用的引物序列如seqidno:250-251。
可选地，步骤(3)中所述测序引物和标签的序列为seqidno:227-247所示，其中上游引物序列为seqidno:227-238所示，下游引物序列为seqidno:239-247所示。
可选地，所述生物信息学分析：经过ngs高通量测序的免疫组库fastq文件，去掉低质量下机测序序列，经过与imgt数据库对比后确定v(d)j基因，组装得到完整cdr3序列，再根据克隆频率去除可能污染序列。mrd值采取两种计算方式。一、以内参作为定量标准。mrd＝(rc/(rstd/nstd)/2)/ntot，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rstd是测序所得内参序列的reads数，nstd是添加内参的分子数，ntot＝内参总质量/每个内参分子摩尔质量，ntot＝mtot/k，ntot是总有核活细胞的数量，mtot是总有核活细胞的质量即inputdna的质量，k为每个细胞dna总量0.0064ng。二、以housekeeping基因作为定量标准。有两种计算方法：1).mrd＝nc/nh,其中，nc是测序所得癌细胞数据经过了umb分析处理后的癌细胞数，nh是测序所得housekeeping基因数据经过了umb分析处理后的总模板细胞数。2).mrd＝(rc/(rh/th)/2)/ntot，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rh是测序所得housekeeping基因的reads数，th是housekeeping基因扩增的模板数，ntot＝内参总质量/每个内参分子摩尔质量，ntot＝mtot/k，ntot是总有核活细胞的数量，mtot是总有核活细胞的质量即inputdna的质量，k为每个细胞dna总量0.0064ng。
本发明技术效果：
1.通过设计保守区域多重引物，调整合适的引物浓度，解决了多重pcr扩增的偏好性。在引物设计中增加随机序列作为每一条模板的独立分子标签(umb)，每条引物序列各不相同，不仅可以纠错还可以真正的进行定量每个dna分子。
2.采用本试剂盒不仅可以追踪作为诊断标记的序列，同时还可以检测新出现的癌细胞克隆序列，这些可能预示着疾病的进展或复发。高灵敏度地mrd检测能在临床症状出现前预测复发，并评估治疗效果，能帮助医生更及时地对患者早期采取干预治疗。
3.本试剂盒中使用一套合成的内参来模仿完整bcr/tcr的v和j的配对，这种合成序列在每次检测过程中都非常稳定，并且通过内参来量化检测样本中包含的全部有核细胞(inputdna)。这种方法对确保临床mrd结果的准确性是至关重要的。
4.本方法使用表达量稳定的housekeeping基因，这种基因在每次检测过程中非常稳定，通过umb分析之后可量化检测样本中参与反应的模板数并可还原pcr扩增之前的状态。这种方法对正确定量mrd结果是至关重要的。
5.本方法结合独有的生物信息学分析来确保临床样本mrd报告的准确性。正确理解mrd检测结果中使用的“分母”对于解释mrd肿瘤负荷至关重要。mrd的检测结果为癌细胞数/所有有核活细胞数，那么分母“所有有核活细胞”的多少就会影响最终mrd的结果。例如，癌细胞为“137个”，仅仅按照10000个b细胞bcr测序结果为总细胞检测背景的话，这就表示mrd值为137/10000,这在临床上即为复发；如果以100万个总细胞(所有单个核细胞)为背景检测，则mrd值为137/10000000,那么在临床上认为没有复发。另外一些mrd检测结果使用的是b细胞或t细胞的百分比，那么对于治疗后淋巴细胞衰竭的患者就存在mrd结果不准确。
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附图说明
图1免疫组高通量测序检测微小残留病方法的流程。
图2文库的构建方法
图32100质检结果，横坐标上15bp和1500bp所对应的峰分别代表lowmarker和upmarker，在这个范围中的多个峰即文库大小。
图4mrd的两种计算方法
图5生物信息学处理后的结果示例。
图6经过生物信息学及可视化处理后的结果示例，其中每个圆代表一个clone，每个圆的大小表示该clone的频率大小，频率越大，圆越大。
图7癌细胞克隆性检测结果中高频率的前10种克隆排序结果示例
图8微小残留病追踪检测结果中癌细胞克隆演变示例
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：样本基因组的获得
1.根据治疗前后及样本特异性可分为：
人治疗前骨髓样本100ul、200ul、300ul、400ul、500ul于edta抗凝管；
人治疗后骨髓样本100ul、200ul、300ul、400ul、500ul、600ul、700ul、800ul、900ul、1ml、2ml于edta抗凝管；
人外周血样本5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml于edta抗凝管。
2.利用红细胞裂解液裂解样本中红细胞后分离有核活细胞。
3.将所得有核活细胞进行细胞计数后提取基因组gdna。
实施例2：多重pcr扩增及文库构建
采用所述试剂盒中的建库试剂盒，在多重pcr反应体系中加入带有umb的多对v基因片段和j基因片段的引物，并添加任意三条对应的1％inputdna模板量的已知序列的内参dna或housekeeping基因与样本同时进行特异性扩增。
引物组序列如表1中所示
表1多重pcr引物
引物序列结构如图2所示，其中所述read1序列为seqidno:248，read2序列为seqidno:249。
其中所述内参dna的序列为seqidno:128-226所示。
其中所述扩增housekeeping基因的pcr引物序列为seqidno:250-253所示。
多重pcr体系，包括25μl、50μl，以下为25ul体系：
多重pcr中使用的pcr预混液：multiplexpcrmastermix(ung)。
混合pcr反应缓存液按照以下反应程序进行：
实施例3：高通量测序以及生物信息学分析
本发明的方法中使用来自illumina公司的hiseq系统，hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(flowcell),这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在flowcell上形成数以亿计簇(cluster)，每个cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带有荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的边合成边测序(sequencingbysynthesis，sbs)技术对待测的模板dna进行测序。
首先，分别在pcr1产物的两端加上illumina高通量测序仪的上机测序引物和标签，同时扩增(参见图2)。
illumina指定测序使用的引物和应用于数据分析的标签：
加粗即为标签index。
pcr2反应缓冲液按以下比例制备：
混合pcr2反应缓存液按照以下反应程序进行：
扩增产物的纯化：利用磁珠回收方法纯化pcr2产物
a、添加80μlampurexpbeads进入pcr2反应产物，混匀。
b、在室温孵化10分钟。
c、放置磁珠-pcr2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
d、添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
e、重复d步骤2次。
f、打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。
g、把试管从磁力架上取下，并添加30μl去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。
h、把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。
i、上清液里就包含了纯化之后的pcr2产物。
使用agilent核酸片段分析仪2100对纯化产物进行质检，如图3为2100质检结果，横坐标上15bp和1500bp所对应的峰分别代表lowmarker和upmarker，在这个范围中的多个峰即文库大小(参见图3)。
进行高通量测序：将所得的dna文库通过illuminahiseq平台进行测序，测序模式为pe150，文库变性浓度为2nm，上机浓度为20pm，并通过生物信息学分析高通量测序结果。一、以内参作为定量标准。mrd＝(rc/(rstd/nstd)/2)/ntot，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rstd是测序所得内参序列的reads数，nstd是添加内参的分子数，ntot＝内参总质量/每个内参分子摩尔质量，ntot＝mtot/k，ntot是总有核活细胞的数量，mtot是总有核活细胞的质量即inputdna的质量，k为每个细胞dna总量0.0064ng。二、以housekeeping基因作为定量标准。有两种计算方法：1).mrd＝nc/nh,其中，nc是测序所得癌细胞数据经过了umb分析处理后的癌细胞数，nh是测序所得housekeeping基因数据经过了umb分析处后的总模板细胞数。2).mrd＝(rc/(rh/th)/2)/ntot，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rh是测序所得housekeeping基因的reads数，th是housekeeping基因扩增的模板数，ntot＝内参总质量/每个内参分子摩尔质量，ntot＝mtot/k，ntot是总有核活细胞的数量，mtot是总有核活细胞的质量即inputdna的质量，k为每个细胞dna总量0.0064ng(参见图4)。急性淋巴白血病高通量测序检测mrd，若mrd>10-4(0.01％)则为阳性，若mrd<10-4(0.01％)则为阴性。多发性骨髓瘤高通量测序检测mrd，若mrd>10-5(0.001％)则为阳性，若mrd<10-5(0.001％)则为阴性。本发明的方法中使用来自illumina公司的hiseq系统。
对下机数据进行生物信息学分析。图5为生物信息学处理后的结果，结果包括clonecount、clonefraction、vsegment、dsegment、jsegment、cdr3clonesequence、cdr3aasequence等信息。图6为经过生物信息学及可视化处理后的结果，其中每个圆代表一个clone，每个圆的大小表示该clone的频率大小，频率越大，圆越大。
实施例4：b细胞急性淋巴白血病微小残留病mrd检测
b细胞急性淋巴白血病微小残留病mrd检测步骤分为两部分，第一部分是治疗前癌细胞克隆性检测，第二部分是治疗期间或缓解期间微小残留病追踪检测。
治疗前，从b细胞急性淋巴白血病患者的新鲜骨髓中提取所有有核活细胞gdna作为模板，采用所述试剂盒进行检测，具体步骤如前述实施例1-3所示。
对患者b细胞中igh、igh-dj、igk、igl、bcl1/igh、bcl2/igh分子cdr3区进行测序检测，发现2种igh分子克隆频率(见表5)＞5％(5％为免疫组高通量测序判断是否为癌细胞克隆的阈值)。结果总结，鉴定出显著性克隆并显示了高频率的前10种克隆排序(见图7)。
表5治疗前癌细胞克隆序列
治疗后，从b细胞急性淋巴白血病患者的新鲜骨髓中提取dna作为模板，采用所述试剂盒进行检测，具体步骤如前述实施例1-3所示。
通过追踪治疗前检测到的2种高频率的癌细胞克隆(表5)，在2017年12月15日样本中检测到了这两种癌细胞的微小残留，且这两种癌细胞克隆水平均低于5％，相比2017年11月10日样本这两种癌细胞克隆频率有所升高，根据治疗前的结果绘制了治疗期间癌细胞微小残留的克隆演变(详见图8)。结果显示为检测到残留癌细胞克隆，癌细胞占有核细胞含量为1.42x10-5，即为mrd值。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
sequencelisting
<110>杭州艾沐蒽生物科技有限公司
<120>一种检测微小残留病mrd的试剂盒
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