SlDALR1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及sldalr1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicuml.)属于茄科(solanaceae)，番茄属(solanum)，富含糖、食物纤维、矿物质、氨基酸及维生素等营养物质，在平衡人们饮食方面发挥着重要的作用。番茄不仅能降血脂降压，抗真菌，消炎，还能预防胃癌，特别是番茄红素具有抗氧化的功效，在化妆品及制药方面应用广泛。近年来，番茄栽培面积不断增加，对农民增收起着重要的作用，成为世界范围内广泛种植的主要蔬菜之一。

近年来，我国番茄主要以温室和大棚栽培为主，由于温室、大棚内特殊的气候条件和连作种植，番茄易受到各种病害的侵袭。迄今为止已发现200多种病害危害番茄，其中细菌性叶斑病是番茄生产上一种重要的细菌性病害。该病害由丁香假单胞杆菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000)侵染引发。病害的症状包括萎蔫、坏死、褪绿、肿瘤等，一般会导致番茄在内的蔬菜作物减产10％～30％，严重时达50％以上(杨朝阳.“番茄细菌斑点病的发生与防治.”现代农业,2011(5):73-73.)，给人类生产和生活造成了很大的经济损失。目前，对番茄细菌性叶斑病的防治仍以化学药剂为主,但是过多使用化学杀菌剂不仅会危及人类身体健康、破坏生态环境，并容易使病菌产生抗药性。实践证明，培育抗病品种是防治病害的一项经济有效的措施。

挖掘重要的抗逆基因，并应用现代分子生物学技术将抗逆基因与其它优良性状聚合，是获得耐逆性强、抗病性强以及高产、优质番茄品种的有效方法之一。对其中的关键基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。

类受体蛋白激酶(receptor-likeproteinkinase，rlk)是植物体内普遍存在的一类蛋白激酶，是许多信号识别传递途径中的关键组分。富亮氨酸类受体蛋白激酶(leucine-richrepeatsreceptor-likeproteinkinase，lrr-rlk)是植物中已知的最大的一类跨膜类受体蛋白激酶，在植物生长发育、激素信号转导以及生物与非生物胁迫反应中具有重要的调控功能。典型的lrr-rlk包含胞外lrr结构域、单次跨膜区及胞内激酶结构域(jiangmeis等.“genome-widecharacterization,evolution,andexpressionanalysisoftheleucine-richrepeatreceptor-likeproteinkinase(lrr-rlk)genefamilyinrosaceaegenomes.”bmcgenomics,2017,18(1):763-777.)。此类蛋白胞外的富亮氨酸结构域识别外界及植物体自身的信号物质，如来自微生物的鞭毛蛋白、系统素等，从而介导生长发育、环境感应和免疫反应等诸多过程(fanmetal.diverserolesofserkfamilygenesinplantgrowth,developmentanddefenseresponse.sciencechinalifesciences,2016,59(9):889-896.)。研究发现，许多植物的抗病性反应都与lrr-rlk基因有关。例如，十字花科的部分物种具有识别延伸因子tu(ef-tu)的模式识别受体efr(ef-tureceptor)，efr是一种典型的lrr-rlk蛋白(zipfelc等.“perceptionofthebacterialpampef-tubythereceptorefrrestrictsagrobacterium-mediatedtransformation.”cell,2006,125(4):749-760.)。将拟南芥efr异源转入到番茄中，可以有效提高番茄对青枯病和斑点病等多种病害的广谱抗性，这充分展示了利用不同植物的模式识别受体基因培育广谱、持久抗病农作物的可能性。

目前，在模式植物拟南芥中已经报导过sldalr1基因同源基因at1g74360(https://www.arabidopsis.org/servlets/tairobjectid＝28523&type＝locus)，该基因命名为grace(germinationrepressionandcellexpansionreceptor-likekinase)，研究发现在拟南芥中的过表达该基因后表现出子叶增大，莲座叶加粗、根系增长等特征(zhenw等.“functionalandstructuralcharacterizationofareceptor-likekinaseinvolvedingerminationandcellexpansioninarabidopsis.”frontiersinplantscience,2017,8:1999-2012.)。番茄的sldalr1基因在抗病方面尚未见相关的研究报导。本发明中发现sldalr1基因的表达受病原菌诱导，其在受到番茄细菌性叶斑病病原菌侵染时，表达量显著提高。在番茄中过表达sldalr1基因后，能够有效地增强对细菌性叶斑病的抗性。这些均表明sldalr1在番茄防御细菌性叶斑病中发挥重要作用。

技术实现要素：

本发明提供了sldalr1基因(即：defense-associatedlrr-rlk1)在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的新用途，为培育抗细菌性叶斑病的番茄品种提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了sldalr1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述sldalr1基因的编号为solyc06g069650.2.1(pgsbplantgenomeandsystemsbiologyhttp://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/reportsjsp/sequencereportcds.jspelementid＝304839)，该基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示，全基因序列如seqidno.7所示，其蛋白质编码区长度为3300bp。

sldalr1基因编码的蛋白为富亮氨酸类受体蛋白激酶，由1099个氨基酸组成，其序列如seqidno.2所示。该蛋白激酶包括胞外lrr结构域、跨膜域和胞内苏氨酸/丝氨酸激酶域3部分，蛋白激酶结构见附图1，其定位于细胞质膜上，见图2。

本发明将sldalr1基因作为目的基因导入普通番茄‘condinered’中得到sldalr1基因的t0过表达植株，经过连续自交，获得纯合高表达的t2代株系，命名为oe:sldalr1-1和oe:sldalr1-4，并将转入pac004-35s空载体的纯合番茄株系作为对照。与对照株系相比，oe:sldalr1-1和oe:sldalr1-4两株系其sldalr1基因的表达量提高了2000-5000倍。然后，通过将过表达纯合株系oe:sldalr1-1，oe:sldalr1-4和对照株系接种番茄细菌性叶斑病菌，2天后分别统计发病率、菌落计数，发现过表达番茄相比对照番茄发病率明显较低，菌落计数发现单位面积叶片上过表达番茄菌落数明显少于对照番茄。综合上述，实验证明了过表达sldalr1基因能够增强植物对细菌性叶斑病的抗性，表明该基因在植物抗细菌性叶斑病基因工程中具有十分重要的应用价值。

此外，本发明还通过双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation，bifc)实验发现，sldalr1基因编码的蛋白能够与同样位于细胞膜上的serk3a、serk3b蛋白互作，形成蛋白复合体，从而在感知病原菌后引发下游的免疫反应；而在前人的研究中已发现，serk3a/serk3b通过与多个模式识别受体的互作参与信号识别，通过胞内激酶域不同氨基酸位点的磷酸化修饰不同下游信号作用激发免疫信号(rouxm等.“thearabidopsisleucine-richrepeatreceptor-likekinasesbak1/serk3andbkk1/serk4arerequiredforinnateimmunitytohemibiotrophicandbiotrophicpathogens.”plantcell,2011,23(6):2440-2455.；heesea等.“thereceptor-likekinaseserk3/bak1isacentralregulatorofinnateimmunityinplants.”proceedingsofthenationalacademyofsciences,2007,104(29):12217-12222.”)。

所以，进一步地，sldalr1基因编码的类受体蛋白激酶在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述类受体蛋白激酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述类受体蛋白激酶与共受体蛋白激酶serk3a/serk3b结合，形成受体复合体，并在受到番茄细菌性斑点病病原菌的诱导后，共受体蛋白激酶serk3a/serk3b将信号向下游传递，进一步引起细胞内的免疫响应，从而增强番茄对细菌性叶斑病的抗性。

进一步地，编码共受体蛋白激酶中serk3a结构域基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.3所示；编码共受体蛋白激酶中serk3b结构域基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供了一种培育抗细菌性叶斑病的番茄的方法，包括以下步骤：

(1)构建含sldalr1基因的过表达载体；所述sldalr1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示；

(2)将所述过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，构建含过表达载体的基因工程菌；

(3)将所述基因工程菌介导转化番茄子叶，培育得到转基因纯合株系。

进一步地，在步骤(1)过表达载体的制备过程中，采用的上游引物如seqidno.5所示，下游引物如seqidno.6所示。

进一步地，所述农杆菌为根癌农杆菌gv3101。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过在普通番茄中过表达sldalr1基因，发现其增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途，并为培育抗细菌性叶斑病的番茄品种提供了重要的基因资源。

(2)本发明利用转基因技术提供一种抗细菌性叶斑病的番茄种质的选育方法，并获得了抗细菌性叶斑病的转基因纯合植株。

附图说明

图1为sldalr1基因编码的富亮氨酸类受体蛋白激酶的结构示意图。

图2为实施例4中的sldalr1基因编码蛋白的亚细胞定位实验，将番茄sldalr1-gfp和fls2-mcherry(质膜定位标记)农杆菌工程菌菌液在本塞姆氏烟草(nicotianabenthamianadomin.)叶片中瞬时共表达；48小时后，使用共聚焦显微镜观察绿色和红色荧光信号；

其中，gfp表示绿色荧光蛋白；bright表示明场；fls2-mcherry表示一种用作质膜定位的红色荧光蛋白；merge表示绿色荧光与红色荧光的融合。

图2中，sldalr1-gfp的绿色荧光与定位于质膜mcherry的红色荧光重合，表示sldalr1基因编码的蛋白定位于质膜上。

图3为实施例2中构建的sldalr1基因t2代过表达纯合株系oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4的ha蛋白标签验证；

其中，ck为转入pac004-35s空载体的对照株系；oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4为sldalr1基因过表达纯合株系。

如图3所示，oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4均有目的条带，表明实施例1所构建的pac004-35s::sldalr1::ha载体已转入普通番茄中，并在植株中表达。

图4为实施例2中sldalr1基因在过表达纯合株系的基因表达；

其中，ck为转入pac004-35s空载体的对照株系；oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4为sldalr1基因过表达纯合株系。

图5为实施例3中番茄sldalr1基因过表达植株与对照番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌60小时之后统计的病情指数；

其中，ck为转入pac004-35s空载体的对照株系，oe:sldalr1-1，oe:dalr1-4为sldalr1基因过表达纯合株系；发病越严重，病级指数越高；对照植株病级指数显著高于过表达纯合株系。

图6为实施例3中番茄sldalr1基因过表达植株与对照番茄植株接种病原菌72小时后的菌落计数，即将番茄sldalr1基因过表达植株与对照番茄接种密度为10⁶cfu/ml的细菌性叶斑病病原菌，3天后进行稀释后的菌落计数，数值表示3个重复后的平均值±标准方差；

其中，ck为转入pac004-35s空载体的对照株系，oe:sldalr1-1，oe:dalr1-4为sldalr1基因过表达纯合株系；cfu数值越高，表示发病越严重。

图7为实施例4中双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation，bifc)实验的结果；

其中，yfp为黄色荧光蛋白；p2yn-sldalr1+p2yc-serk3a、p2yn-sldalr1+p2yc-serk3b、p2yn-sldalr1+p2yc、p2yn+p2yc-serk3a、p2yn+p2yc-serk3b分别表示两种菌液的混合；p2yn-sldalr1+p2yc-serk3a、p2yn-sldalr1+p2yc-serk3b为实验组，p2yn-sldalr1+p2yc、p2yn+p2yc-serk3a、p2yn+p2yc-serk3b为对照组；

p2yn-sldalr1+p2yc-serk3a/serk3b观察到荧光，表示sldalr1与serk3a/serk3b存在蛋白互作。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如分子克隆实验手册(greenmr,sambrookj.molecularcloning:alaboratorymanual:three-volumeset.coldspringharborlaboratorypr,2012.)，或按照相应实验试剂和仪器说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1番茄sldalr1基因的克隆和过表达载体的构建

1、番茄总rna提取

采用tiangenplanttotalrnaextractionkit提取番茄幼嫩叶片的总rna，其步骤为：

(1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1ml裂解液，后用匀浆仪处理；

(2)将匀浆样品在15-30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)4℃，12000转每分钟离心5分钟，去上清，转入一个新的无rnaase的离心管中；

(4)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟；

(5)4℃，12000转每分钟离心10分钟，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液rz试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；

(6)缓慢加入50％体积的无水乙醇，混合均匀；将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3，4℃，12000转每分钟离心30秒，弃掉收集管中的废液；

(7)向吸附柱cr3中加入500μl去蛋白液rd，4℃，12000转每分钟离心30秒，弃废液；

(8)向吸附柱cr3中加入600μl漂洗液rw，室温静置2分钟，4℃，12000转每分钟离心30秒，弃废液；

(9)重复操作步骤(8)；

(10)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000转每分钟离心2分钟，去除残余废液；

(11)将吸附柱cr3转入一个新的离心管中，加入50μl灭菌水，室温放置2分钟，4℃，12000转每分钟离心2分钟，管底即为所提取的rna；

(12)用(11)所提的rna用thermofisher公司的反转录试剂盒按说明书进行反转录得到cdna，存于-20℃保存备用。

2、sldalr1基因过表达载体的构建

设计番茄sldalr1基因编码区序列的特异性的扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：

sldalr1-asci-f：5’-gggcgcgccatgtctgaagtggaatctc-3’；(seqidno.5)

sldalr1-paci-r：5’-cttaattaataataatggagaagtgctac-3’；(seqidno.6)

以上述从普通番茄品种‘condinered’叶片总rna反转的cdna(complementarydna)为模板，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增sldalr1基因外显子的核苷酸序列，两端带相应的酶切位点。

pcr反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸2分钟15秒，共35个循环；72℃延伸5分钟。得到了sldalr1基因3300bp的片段，进行纯化回收。

回收目的片段：取50μl的pcr扩增产物在质量体积比浓度为0.8％的琼脂糖凝胶中电泳检测，切割目的片段，参照凝胶回收试剂盒(全式金生物技术有限公司)附带的说明书进行操作，得到目的基因片段，连接入过表达载体pac004(氯霉素抗性)，体系为：目的基因片段:过表达载体≈10:1，10μl混匀，于恒温仪中25℃连接2小时，得连接产物。

转化及筛选：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置冰上解冻，无菌操作台中将50μl大肠杆菌感受态细胞和5μl的上述连接产物移入1.5ml离心管中，轻轻混匀，冰浴30分钟；打开水浴锅在42℃水浴中热激45秒后立即冰浴2-5分钟，该操作过程中保持离心管绝对静止；在无菌操作台中加入800μl液体lb，放置于37℃摇床上，200转每分钟培养45分钟；4000转每分钟离心1分钟，弃上清，用80μl的液体lb悬浮沉淀，将菌液均匀地涂布于氯霉素抗性的lb平板培养基上，37℃倒置过夜培养12小时至长出单克隆菌落；挑取阳性单克隆送至杭州擎科生物有限公司测序，测序结果如seqidno:1所示，结果表明，所克隆的序列与pgsbplantgenomeandsystemsbiology网站中公布的基因序列(solyc06g069650.2.1)一致(http://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/reportsjsp/sequencereportcds.jspelementid＝304839)。

3、根癌农杆菌工程菌构建

(1)制备农杆菌感受态细胞

取-80℃保存的农杆菌菌株gv3101于含50μg/ml利发霉素的lb平板划线，28℃培养两天，两天后挑取单菌落接种于1ml含利发霉素25mg·l^-1液体lb中，28℃，200转每分钟培养过夜；向50ml离心管中加入50μl菌液和20ml含利发霉素25mg·l^-1液体lb中继续培养，至od600约为0.5；将菌液冰浴30分钟，4℃，5000转每分钟离心5分钟，弃上清液；加入10ml冷的灭菌超纯水使菌液悬浮；4℃，5000转每分钟离心5分钟，弃上清液；加入1ml冷的灭菌超纯水使菌液悬浮，分装(50μl/管)，得农杆菌感受态细胞，液氮速冻，-80℃保存。

(2)根癌农杆菌工程菌构建

首先将干净的电转杯置于-20℃预冷待用；取出农杆菌感受态细胞，在冰上解冻，分别向50μl农杆菌感受态细胞菌液中加入2μl的pac004-35s::sldalr1过表达载体，轻轻混匀；将混合物转移到已预冷的电转杯的两电极之间，擦干电转杯外壁，置于管槽中，盖上盖子；打开电转仪电源，设置电击参数(2500v，2秒)，电击一次；电击完成后，取出电转杯，并加入800μl液体lb混匀，转移到1.5ml离心管中，28℃，200转每分钟培养2-4小时；将菌液于4000转每分钟离心1分钟，倒掉上清液；将剩余约100μl液体lb充分悬浮，并均匀涂布于氯霉素抗性的三抗lb平板培养基(氯霉素、利发霉素、庆大霉素)上，28℃倒置培养2天，2天后，挑取单克隆菌落加入氯霉素抗性的三抗液体lb(氯霉素、利发霉素、庆大霉素)中，28℃，200转每分钟振荡培养24小时，菌液pcr验证得目的条带，即得到含有过表达载体pac004-35s::sldalr1::ha的农杆菌工程菌。

实施例2番茄sldalr1基因的遗传转化与转基因纯合植株的获得

1、农杆菌介导的番茄基因遗传转化

利用含有pac004-35s::sldalr1过表达载体的农杆菌工程菌侵染番茄子叶并经过分化培养基和生根培养基的筛选后，对得到的再生植株用pac004-35s的ha蛋白标签进行检测。

具体的步骤如下：

(1)挑选饱满的普通番茄品种‘condinered’种子于清水中，28℃、摇6-8小时，用75％酒精消毒种子30秒，再转入10％次氯酸钠灭菌10-15分钟，最后用灭菌水清洗5-7遍。将灭菌后的种子点播于播种培养基，置于暗处生长3天左右，种子萌芽后，将其转移到光下，25℃培养4天，至子叶完全展开。

(2)切番茄子叶，子叶完全展开而真叶未长出时，用解剖刀将番茄幼苗切下叶尖及下胚轴，每片子叶切成2-3段，将灭菌滤纸放入看护培养基，用镊子小心夹取切好的子叶，轻置于看护培养基上，黑暗下看护过夜，次日用含上述构建好的含pac004-35s::sldalr1::ha载体的农杆菌工程菌侵染子叶，时间为3分钟，侵染后用灭菌滤纸擦干残留菌液并将子叶放回培养基，暗培养2天。

(3)子叶与农杆菌在看护培养基共同培养2天后，将番茄子叶转入2z分化培养基中(潮霉素抗性，诱导愈伤组织)，筛选抗性愈伤组织，约15天后转入0.2z分化培养基(潮霉素抗性，诱导发芽)，之后每隔15天左右转入新的0.2z分化培养基。

(4)当在愈伤上生出小苗后，转入生根培养基进行生根培养20-30天，直至根系发育完全，待根系发育良好后，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入少量灭菌水保湿，套上一透明的塑料袋进行炼苗，得到t0代过表达番茄苗。

2、过表达材料验证

(1)取上述t0代过表达苗叶片少许，放入加有小钢珠的2ml离心管中，用液氮冷冻，研磨仪粉碎样品30秒后，分别向离心管中加入100μl蛋白上样缓冲液和2μl的巯基乙醇，颠倒混匀放入95℃水浴锅中变性5-10分钟，期间轻轻上下颠倒几次。

(2)将(1)中的变性蛋白质样品4℃，12000转每分钟离心10分钟，离心后取上清液15μl上样，200v电压下，待蛋白条带分开后，随即依次转膜、脱脂奶粉封闭、孵育一抗(anti-ha)、二抗(anti-mouseigg，antibody)，最后，用化学发光仪曝光具有正确大小蛋白条带的植株即为t0代sldalr1基因过表达植株。

3、过表达纯合株系的获得

将t0代转基因过表达植株自交分别得到t1代种子，从每个t0代过表达植株所产生的t1代中取6-9个阳性株继续自交产生t2代并进行分离分析。当t1代阳性株产生的t2代幼苗经过检测全部为阳性株，则该t1代植株为过表达纯合株；反之，则为杂合株。

将上述验证纯合的t2代转基因植株提取总rna，具体步骤如上，用thermofisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cdna，并以之为模板，以sldalr1基因特异性定量引物进行检测，用actin基因作为内参基因，利用实时荧光定量pcr方法检测sldalr1基因在不同株系中的表达量。结果如图4所示，sldalr1过表达纯合株系oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4表达量与对照株系相比升高约2000-5000倍。oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4纯合株系的ha蛋白标签验证结果如图3所示，具体做法如上。

以下实施例3均以oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4为实验材料。

所用引物如下：

q-actin-f：5’-tgtccctatttacgagggttatgc-3’(seqidno.8)

q-actin-r：5’-cagttaaatcacgaccagcccgat-3’(seqidno.9)

q-sldalr1-f：5’-ctctatgggtggtgccttga-3’(seqidno.10)

q-sldalr1-r：5’-ctctgtggacaatgcaaggg-3’(seqidno.11)

实施例3番茄细菌性叶斑病抗性试验

对实施例2所得番茄sldalr1过表达纯合株系oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4进行接种细菌性叶斑病病原菌处理。

1、番茄细菌性叶斑病病原菌的准备

将番茄细菌性叶斑病病原菌菌种涂布于含25mg/l利福平的固体kb(king’sb)培养基(蛋白胨10g，k2hpo41.5g，甘油15ml，琼脂15g，无菌水1l)上于28℃培养箱中培养2天后得以活化，挑取单菌落于含有同样抗生素的液体培养基中28℃，以200转每分钟离心，扩大培养8-16小时，直至od600＝0.8-1.0，然后于2500转每分钟离心10分钟，收集菌体。将收集的菌体用10mmmgcl2溶液重悬，并调节细菌浓度至od600约为0.1，加0.03％有机硅，准备对过表达与对照番茄植株进行喷施。

2、细菌性叶斑病病原菌接种

分别选取株系oe:sldalr1-1、oe:sldalr1-4的t2代纯合植株各8株和对照植株8株，进行病原菌接种实验，对过表达与对照番茄植株的叶背进行同样地喷施等量上述所准备的病原菌，至菌液浸润所有叶片背部，细菌悬浮液通过气孔进入细胞间隙。然后，置于70％湿度环境中有利于病原菌的发育，2-3天后观察植株发病情况，统计发病率，并进行菌落计数。

3、病情指数统计

接种番茄细菌性叶斑病病原菌60小时后观察发病症状，并统计发病叶片数。发病症状按轻重程度依次为0、ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ五个等级，分级标准为：0级，叶片正常；ⅰ级，叶片下表皮可见少数病斑；ⅱ级，叶片下表皮局部密集病斑；ⅲ级，叶片下表皮多部位密集病斑，但未散布整片叶；ⅳ级，叶片下表皮全片叶可见病斑分布。同时每个处理至少统计50片番茄叶片。病情指数的计算公式如下：

病情指数＝∑(各级叶片数×发病级别)×100/(总叶片数×最高发病级数)统计结果如图5所示，相比于对照番茄，两个过表达番茄株系oe:sldalr1-1和oe:sldalr1-4发病症状明显减轻。

4、菌落计数

采用平板稀释法对病原菌的菌落形成单位(colony-formingunits，cfu)值进行统计。对接种病原菌72小时过表达番茄株系oe:sldalr1-1和oe:sldalr1-4与对照番茄的叶片用直径为5mm的打孔器获得相同大小的叶盘，将叶盘样品放入2ml离心管中，在无菌条件下，将叶片用75％无水乙醇浸泡2分钟，然后无菌水冲洗3次，将叶盘转入新的无菌的2ml离心管中，加入100μl的10mmmgcl2溶液将叶盘研磨匀浆，磨匀后进行10倍、100倍、1000倍、10000倍的梯度稀释。各取10μl稀释液涂布于含25mg/l利福平的固体kb培养基上，28℃培养2天后计数菌落数量。每个过表达株系与作为对照番茄各3次重复，试验数据用spss软件进行统计分析。

结果如图6所示，菌落计数的结果表明两个过表达株系单位面积叶片上的病原菌菌落数量明显少于对照番茄，即发病程度明显减轻。

综合上述实验，结果均说明番茄sldalr1基因在植株中过表达后对番茄细菌性叶斑病具有显著的抗性作用。上述实验设有三次重复，三次实验结果基本一致。

实施例4sldalr1亚细胞定位及sldalr1与serk3a/serk3b的蛋白互作验证

1、sldalr1的蛋白亚细胞定位

将含sldalr1::gfp的重组植物表达载体的农杆菌和fls2-mcherry(fls2为已知的质膜定位标记基因)农杆菌在本塞姆氏烟草(nicotianabenthamianadomin.)叶片中瞬时过表达，2天后，检测绿色荧光与红色荧光的发光情况。

具体步骤如下：

(1)构建载体:同实施例1将sldalr1基因的外显子序列构建到含报告基因gfp的植物表达载体pac402-35s中；

所用引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：

sldalr1-xhoi-f：5’-ccctcgagcatgtctgaagtggaatctc-3’；(seqidno.12)

sldalr1-saci-r：5’-cgagctctaaatggagaagtgctacgac-3’。(seqidno.13)

(2)将上述构建的pac402-35s::sldalr1::gfp质粒转入农杆菌工程菌中，并将该农杆菌工程菌菌液于28℃，200转每分钟过夜扩摇；

(3)当菌液od600值介于0.8-1.0之间时，1000转每分钟离心5分钟收集农杆菌；

(4)用10ml灭菌水轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液；重复以上步骤，进一步去除残留的抗生素；

(5)用农杆菌侵染缓冲液将菌体重悬，调od600至约1.0，室温放置2-3小时得到侵染菌液；

(6)侵染前，将上述菌液与用于质膜定位的fls2-mcherry农杆菌菌液等体积混匀；

(7)用针头在烟草叶片背面上避开叶脉扎孔，用无针头注射器将侵染菌液从扎孔处注射至叶片内；

(8)2天后，从注射部位取1-2cm²叶片。在激光扫描共聚焦显微镜下观察绿色及红色荧光。

定位结果如图2所示，sldalr1-gfp的绿色荧光与定位于质膜mcherry的红色荧光重合，表示:sldalr1编码的蛋白定位于质膜上。

2、sldalr1与serk3a/serk3b的蛋白互作鉴定

为探究sldalr1和共受体serk3a/serk3b之间的关系，本发明采用了bifc进行了sldalr1和serk3a/serk3b所编码的类受体激酶的蛋白互作验证；将含有荧光蛋白yfp(yellowfluorescentprotein，yfp)n端和c端的bifc载体在本塞姆氏烟草(nicotianabenthamianadomin.)叶片中瞬时过表达，2天后，在共聚焦显微镜下观察yfp发光情况。

具体步骤如下：

(1)构建载体，同实施例1将sldalr1基因外显子的核苷酸序列连接到p2yn，serk3a/serk3b基因外显子的核苷酸序列构建到p2yc的表达载体中(p2yn、p2yc为bifc所用载体，分别含yfp的n端、c端)，并确定其是可以在本塞姆氏烟草叶中表达的。

(2)将(1)中构建好的载体质粒转化到农杆菌工程菌中，菌株为gv3101,将该菌液于28℃，200转每分钟过夜扩摇；

(3)当菌液od600值介于0.8-1.0之间时，1000转每分钟离心5分钟收集农杆菌；

(4)用10ml灭菌水轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌体；

(5)重复步骤4，进一步去除残留的抗生素；

(6)用农杆菌侵染缓冲液将菌体重悬，调od600至1.0，室温放置2-3小时得到侵染菌液；

(7)用针头在烟草叶片背面上避开叶脉扎孔，用无针头注射器将菌液从扎孔处注射至叶片内；

(8)2天后，从注射部位取1-2cm²叶片。在激光扫描共聚焦显微镜下观察黄色荧光。

结果如图7所示，p2yn-sldalr1+p2yc-serk3a/serk3b共注射2天后，均可观察到荧光，而另外的三个对照组均无荧光。

实施例4所用的本塞姆氏烟草(nicotianabenthamianadomin.)为在16小时-光/8小时-暗条件的温室中生长5周左右的烟草植株。重悬农杆菌所用的缓冲液为：10mmmes-koh(ph＝5.6)，10mmmgcl2，150μm乙酰丁香酮(乙酰丁香酮溶解在二甲亚砜中，-20℃储存)。

序列表

<110>浙江大学

<120>sidalr1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3300

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>1

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ataacaggtaggcttgtttgtggagactcaattgagacagacaagcagttgctgctgaac120

ttgaagtcatttcttaaggaacaaaatcctgttgacaaaggattcaaatataaccattgg180

aatcctacagatttgtcaccctgtagatggcctggaatatcatgcactacttccatcaat240

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gtagagggagcagaggaaatgtatgagttgcttaggattgggataaggtgcacagctgag3180

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<210>2

<211>1099

<212>prt

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>2

metsergluvalgluserhisvalpheleuproilevalleuleuasn

151015

phepheileleuilethrglyargleuvalcysglyaspserileglu

202530

thrasplysglnleuleuleuasnleulysserpheleulysglugln

354045

asnprovalasplysglyphelystyrasnhistrpasnprothrasp

505560

leuserprocysargtrpproglyilesercysthrthrserileasn

65707580

argvalthrglyileaspleusergluserasnleualaglylysleu

859095

pheasnasnpheseralametthrgluleuasnserleuaspleuser

100105110

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115120125

asnleulyspheleuasnleuserhisasnileilevalglyaspleu

130135140

asnleuthrglyleuasnlysleugluvalleuaspleuthrmetasn

145150155160

argilehisglyleuthrileprogluilecysaspasnleualaval

165170175

alaasnileserasnasnasnphethrsergluserglyphegluphe

180185190

serhiscyslyslysleulystyrleuaspleusertyrasntyrleu

195200205

thrglyasnleuserpheglyleuaspmetleuasnmetpheserala

210215220

serhisasnasnleuserglyserleuprosertrpilephethrgln

225230235240

asncysserleuglnglyleuaspleusergluasnargphephegly

245250255

gluleuprothrserilealaasncyslysargleuvalgluleuasn

260265270

leutrpglyasnserpheserglyserileproargglyileglyser

275280285

valhisserleulysgluleucysleuglyserasnasnpheserser

290295300

aspvalproaspthrleuserglyleuasnlysleuvalpheleuasp

305310315320

leuserargasnasnpheglyglygluileglngluilepheglygln

325330335

leuthrglnvalargpheleuvalleuhisglyasnsertyrthrgly

340345350

glyilevalserserglyileproasnleuvalasnleuserargleu

355360365

aspleuseraspasnhispheserglyproleuprovalgluileser

370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

lysleuargserleuleutrpleumetleualaasnasnserleuser

435440445

glygluileprosergluleuglyasncysserserleuleutrpleu

450455460

asnleualaasnasnglnleuthrglyproileproproglnleuala

465470475480

serileglyalaaspprometleuthrpheleuleuasnargglylys

485490495

glulysleuthralaserproglyaspcysphealametargargtrp

500505510

ileproalaasptyrpropropheserpheiletyrproleuleuthr

515520525

glylyssercysargileleuglyasplysleuphemetglyaspgly

530535540

leumetproleucysgluproglyserasnvalarglysasnglnval

545550555560

proglytyrileglnleuseraspasnlysleuserglygluilepro

565570575

progluileserasnmetlyslysmetsermetmethisleuglyala

580585590

asnglupheserglyargleuprosergluileglyglnleuhisleu

595600605

valvalleuasnvalserglnasnlyspheserglygluileprolys

610615620

glnileglyhisleulyscysleuleuasnleuaspleuserpheasn

625630635640

asnpheserglypropheprovalserpheserasnleuhisaspleu

645650655

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660665670

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705710715720

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725730735

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785790795800

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805810815

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820825830

glnarggluglyilegluglygluargglupheargalaglumetglu

835840845

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850855860

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865870875880

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885890895

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serthrmetvalalaglythrileglytyrvalalaproglutyrgly

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99510001005

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101010151020

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pheglyserserargserthrserproleuleu

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<210>3

<211>1848

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>3

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