使用体细胞核转移产生单性生殖干细胞和患者特异性人胚胎干细胞的制作方法

其它申请的交叉引用本申请依据35u.s.c.§119(e)包括美国临时专利申请no.61/765,548和61/765,563的优先权要求，每一专利申请在2013年2月15日提出。本发明涉及免疫相容性多潜能干细胞(psc)，包括患者特异性psc。本文中描述的方法涉及单性生殖或核转移且通过这些技术产生的免疫相容性psc的组合物广泛应用于再生医学疗法。发明背景人多潜能干细胞(hpsc)具有在体内分化成实际上所有体细胞类型的显著能力(多潜能性)，同时维持呈未分化状态的增殖能力(自我更新)。hpsc的这些独特特征提供了产生可移植的细胞和组织材料以用于治疗在尤其糖尿病、骨关节炎和帕金森氏病(parkinson’sdisease)范围内的疾病和病状的机会。因为许多人损伤和疾病是由包括单一细胞类型的细胞缺陷在内的细胞缺陷引起，所以用适当干细胞、祖细胞或体外分化细胞替换可以在临床中产生新颖的治疗方法。此外，虽然活的供体、尸体或胎儿来源已经用作移植材料的来源，但多潜能干细胞的自我更新能力进一步提供了可移植材料的几乎无限的资源。另一个益处是hpsc可以用患者特异性的方式产生，由此产生了降低免疫排斥风险和耐受性的治疗方法。因此，对包括免疫相容性hpscs和患者特异性hpsc在内的再生细胞移植相当的狂热。一种产生免疫相容性hpsc的策略是促进从卵母细胞的单性生殖(即无性生殖)以产生用于hpsc分离的胚泡。简单地说，此方法依赖于人工诱发卵母细胞以在缺乏精子受精的情况下进行减数分裂和有丝分裂过程，产生二倍体(2个母系基因组)单性生殖体，其可以进一步培养成胚泡，从胚泡可以分离出hpsc。使用该单性生殖方法，分离的hpsc被称为单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hpsc)。一种替代的方法允许通过体细胞核转移(scnt)产生患者特异性hpsc。体细胞核转移涉及供体患者的体细胞的核分离和插入到去核的接受者卵母细胞中。供体核转移到接受者卵母细胞的细胞质通过使体细胞基因沉默和活化胚胎基因，引起所转移的供体核进行程序重排。从重构的卵母细胞，可以建立培养的胚泡以从内细胞团(icm)分离hpsc。作为核转移的结果，hpsc(nt-hpsc)携带着患者特异性的患者的核遗传物质。技术程序相关的两个技术存在显著的重叠。举例来说，早期尝试实现nt-hpsc细胞系产生了pn-hpsc细胞系产生的意外并首先知道的情况。尽管单性生殖和scnt技术的发展有前景，但目前存在排除切实可行的临床应用的显著限制。举例来说，已存在的单性生殖研究已经报导了在大概50％的供体卵母细胞中的成功卵母细胞活化，但一个关键的限制似乎是诱发胚泡的形成，其可能下降至低到15％或更少的活化卵母细胞。因为与核转移相关，所以使用常规技术，仅仅至多低至2％的重构卵母细胞越过达至胚泡形成的8细胞临限。总之，这些限制可能意味着小于10％的供体卵母细胞被成功地培养成pn-hpsc。随后的pn-hpsc可能具有其它不希望有的属性，比如非整倍性或核型不稳定性。由于目前不清楚允许一致和可再生的卵母细胞活化和胚泡形成的确切机制，所以当然，对这些过程的更透彻了解将有助于目前限制psc谱系产生的障碍。举例来说，在单性生殖中减数分裂期期间发生的重组事件可以产生可变量的接合性。因此，实时目测这些事件不仅仅提高了胚泡形成和pn-hpsc细胞系产生的成功率，而且还有助于旨在实现所得pn-hpsc细胞的特异性遗传和免疫特征的操纵策略。类似地，当前用于获得nt-hpsc的scnt方法使用来自体外受精临床的卵母细胞。同样由非整倍性、核型不稳定性和/或低效率的核程序重排引起的高失败率需要更大量的卵母细胞用于衍生nt-hpsc，且仍然局限于产生非患者特异性的细胞。因此，本领域中非常需要允许使用scnt和/或单性生殖技术，一致、有效地产生免疫相容性和患者特异性hpsc的技术。本文中描述了用于建立免疫相容性和/或患者特异性hpsc的技术。在一个方面，描述了使用改良的技术的有效scnt和/或单性生殖。此包括改善显微操作以减少细胞破坏；在不使用苛刻着色剂和/或紫外线暴露下用于实时目测的偏光显微术。更重要地，已经通过应用甲基化改变剂消除了与有效胚泡产生有关的关键屏障，所述甲基化改变剂促进了重构的卵母细胞内基因组的活化，以及有丝分裂结构(例如中心粒)从精子衍生物添加以促进胚泡扩张。应用这些改良的技术允许实现表达共同人白细胞抗原(hla)单倍体的pn-hpsc库，从而提供了免疫学上与宽群体部分相容的细胞。在所有方面，pn-hpsc和nt-hpsc可以在无动物蛋白的培养基上生长，对于最终涉及人患者的临床应用为重要的，并提供遗传学上和表观遗传学上稳定和多潜能的可移植细胞。发明概要本文中描述了一种产生单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)的方法，其包括通过在活化培养基中培育来活化卵母细胞，通过在后活化培养基中培育所述活化的卵母细胞产生单性生殖体，通过在培养基中培育所述单性生殖体形成胚泡，并从所述胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中所述icm细胞能够进一步培养为pn-hpsc细胞系。在其它实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在其它实施方案中，所述钙离子载体包括伊屋诺霉素(ionomycin)、a23187、白僵菌毒素(beauvericin)、x-537a和/或燕麦曲菌素(avenaciolide)。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括6-dmap、嘌呤霉素(puromycin)、乙醇、放线菌酮(cycloheximide，chx)、曲古霉素a(trichostatina，tsa)和/或细胞分裂抑素b(cytochalasinb，cb)。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括不阻止第二极体排出的化合物。在其它实施方案中，卵母细胞包括中期ii(mii)期卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞包括中期i(mi)期卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞包括单一原核卵母细胞。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系是杂合的。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系是纯合的。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系包括具有与至少1％的群体免疫相容的人白细胞抗原(hla)单倍体。在其它实施方案中，hla单倍体包括hla-a、hla-b和hla-dr。在其它实施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。本文中进一步描述了一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)，其包括从单性生殖体衍生的胚泡的内细胞团(icm)细胞分离的多潜能细胞。在其它实施方案中，单性生殖体衍生的胚泡包括通过在活化培养基中培育卵母细胞所产生的单性生殖体。在其它实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在其它实施方案中，所述钙离子载体包括伊屋诺霉素、a23187、白僵菌毒素、x-537a和/或燕麦曲菌素。在其它实施方案中，单性生殖体衍生的胚泡包括通过在后活化培养基中培育活化的卵母细胞产生单性生殖体。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括6-dmap、嘌呤霉素、乙醇、放线菌酮(chx)、曲古霉素a(tsa)和/或细胞分裂抑素b(cb)。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系是杂合的。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系是纯合的。在其它实施方案中，pn-hpsc细胞系包括具有与至少1％的群体免疫相容的人白细胞抗原(hla)单倍体的多潜能细胞。在其它实施方案中，多潜能细胞表达来自包括以下的组的一种或多种标记物：阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、ssea-3、肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)、tra-1-60、八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、锌指蛋白-42(rex-1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)和端粒重复序列结合因子(terf-1)。在其它实施方案中，多潜能细胞能够分化成来源于内胚层、中胚层和外胚层的细胞。在其它实施方案中，所述方法进一步包括注射精子因子至卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。本文中还描述了包括所述pn-hpsc细胞系中的一或多者的单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)的库。本文中还描述了一种产生核转移人多潜能干细胞系(nt-hpsc)的方法，其包括通过添加至少一个供体细胞的至少一个核来去除卵母细胞的核，产生核转移(nt)卵母细胞，通过在活化培养基中培育来活化nt卵母细胞，从活化的nt卵母细胞产生胚泡，并从胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中icm细胞能够进一步培养为nt-hpsc细胞系。在其它实施方案中，所述方法包括添加至少一个供体细胞的至少一个核包括直接注射。在其它实施方案中，所述方法包括添加至少一个供体细胞的至少一个核包括体细胞融合。在其它实施方案中，体细胞融合包括使仙台病毒(sendaivirus)、蛋白质或其提取物接触所述至少一个供体细胞。在其它实施方案中，所述至少一个供体细胞包括体细胞或生殖细胞。在其它实施方案中，所述方法是在缺乏紫外光下进行。在其它实施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。文中还本描述了一种通过所述方法产生的nt-hpsc细胞系，所述方法包括通过添加至少一个供体细胞的至少一个核去除卵母细胞的核，产生核转移(nt)卵母细胞，通过在活化培养基中培育来活化nt卵母细胞，从活化的nt卵母细胞产生胚泡，并从胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中icm细胞能够进一步培养为nt-hpsc细胞系。本文中还描述了一种核转移的方法，其包括通过添加至少一个供体细胞的至少一个核至卵母细胞并去除卵母细胞的主体核来产生核转移(nt)卵母细胞。在其它实施方案中，所述方法包括通过在活化培养基中培育来活化nt卵母细胞，从活化的nt卵母细胞产生胚泡，并从胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中icm细胞能够进一步培养为nt-hpsc细胞系。在其它实施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。附图简述参考图中说明例示性实施方案。意图本文公开的实施方案和图视为例示性的而非限制性的。图1.卵母细胞的去核。“刀型吸液管”的轮廓允许在尖端抵着(b)通过保持吸移管来保持稳定的细胞的侧边前进时，经由(a)实心尖锐的精细尖端有效刺穿透明带。(c)刺穿之后，经由圆形牵引的珠粒末端操纵卵母细胞以“修剪”裂缝和(d)极体定位于裂缝边缘附近。在较大的中空管体为使用者提供整体结构以更容易地抓住刀型吸移管下，(e)定位于裂缝附近的极体接着可以(f)挤出以供提取。图2.nt-psc的衍生。(a)体细胞核转移胚泡，(b)透明带去除后的涂铺的胚胎，(c)nt-胚胎的初始长出，(d)3次传代后形成的胚细胞样群落。发明详述本文中引用的所有参考文献均如同完全阐述一般以引用的方式整体并入本文中。除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属的领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。allen等人,remington:thescienceandpracticeofpharmacy第22版.,pharmaceuticalpress(2012年9月15日)；hornyak等人,introductiontonanoscienceandnanotechnology,crcpress(2008)；singleton和sainsbury,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology第3版,修订版,j.wiley&sons(newyork,ny2006)；smith,march’sadvancedorganicchemistryreactions,mechanismsandstructure第7版,j.wiley&sons(newyork,ny2013)；singleton,dictionaryofdnaandgenometechnology第3版,wiley-blackwell(2012年11月28日)；以及green和sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual第4版,coldspringharborlaboratorypress(coldspringharbor,ny2012)为本领域的技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指导。关于如何制备抗体，参见greenfield,antibodiesalaboratorymanual第2版,coldspringharborpress(coldspringharborny,2013)；和milstein,derivationofspecificantibody-producingtissuecultureandtumorlinesbycellfusion,eur.j.immunol.1976年7月,6(7):511-9；queen和selick,humanizedimmunoglobulins,美国专利no.5,585,089(1996年12月)；以及riechmann等人,reshapinghumanantibodiesfortherapy,nature1988年3月24日,332(6162):323-7。熟习此项技术者将认识到与本文所描述的方法和材料类似或同等的许多方法和材料，其可用于实施本发明。实际上，本发明决不限于本文中描述的方法。出于本发明的目的，下文定义以下术语。如本文所用，“施用(administering)”和/或“施用(administer)”是指用于传递药物组合物至患者的任何途径。传递途径可以包括非侵袭性经口(通过口腔)、局部(皮肤)、经粘膜(鼻、颊/舌下、阴道、眼睛和直肠)和吸入途径以及不经肠途径和本领域中已知的其它方法。不经肠是指一般与注射相关的传递途径，包括眶内、输注、动脉内、颈动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、包囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由不经肠途径，组合物可以呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液形式，或呈冻干粉末形式。如本文所用，“调节(modulation)”或“调节(modulates)”或“调节(modulating)”是指反应的上调(即活化或刺激)、下调(即抑制或遏制)或组合或分开的两者。如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指适用于本发明的常规的药学上可接受的载剂。如本文所用，“促进(promote)”和/或“促进(promoting)”是指细胞或生物体的具体特性加强。如本文所用，“受试者”包括所有动物，包括哺乳动物和其它动物，包括(但不限于)伴侣动物、家畜和动物园动物。术语“动物”可以包括任何活的多细胞脊椎动物生物体，一种包括例如哺乳动物、鸟、猿、犬、猫、马、牛、啮齿动物等等的类别。同样，术语“哺乳动物”包括人与非人哺乳动物。如本文所用，“治疗有效量”是指足以在所治疗的受试者中实现所期望的作用的指定组合物或组合物中活性剂的量。治疗有效量可能视多种因素而改变，包括(但不限于)受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、全身状态、对给定剂量的反应、所期望的临床作用)和施用途径。临床和药理领域的技术人员将能够通过常规的实验确定治疗有效量。如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施，其中目标是防止或减缓(减轻)目标病状、疾病或病症(总起来说“病”)，即使治疗最终不成功。需要治疗者可以包括已患病者，以及有患病倾向者，或预防病者。如所述，人多潜能干细胞(hpsc)的分离和表征和哺乳动物中单性生殖和/或体细胞核转移(scnt)技术的突破已经提高了产生潜在无限的hpsc来源以用于研究中的可能性，其中可应用于组织修复和移植药学。关于单性生殖，在一些情况下可以应用消除所得细胞中父系的影响，以将主要组织相容性复合物(mhc)多样性减至最少。此允许产生与宽泛患者群体广泛免疫相容的单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hpsc)。产生纯合的pn-hpsc细胞系通过消除杂合变异而进一步提高潜在的免疫相容性。在仅仅一组等位基因纯合表达的情况下，此允许所得的pn-hpsc谱系更容易与患者相配。举例来说，已经报导针对共同单倍体而选择的一组少至十种hla纯合pn-hpsc谱系可以提供几乎40％英国接受者的完全hla-a、hla-b和hla-dr匹配，和几乎65％的有益匹配。当在治疗背景下考虑应用scnt时存在类似的益处。经由scnt获得的细胞(nt-hpsc)将携带患者的核遗传物质并因此是个别患者特异性的。此形式的自体同源移植允许细胞移植至免疫排斥风险显著减少的患者。单性生殖和scnt技术都涉及人工卵母细胞活化，此依赖于模拟在自然受精期间发生的钙信号传导变化。正常卵母细胞发育依赖于高水平的中期促进因子(mpf)活性以使卵母细胞停滞在中期ii(mii)期。mii卵母细胞的停滞被细胞内钙离子(ca2+)水平因精子进入所引起的变化破坏。此后面为将卵母细胞从停滞释放的周期素b(mpf调节亚基)的靶向降解、前核形成和减数分裂和有丝分裂过程的开始。作为第一步骤，单性生殖卵母细胞活化依赖于人工的钙改变策略来将培养的卵母细胞从停滞释放。实例包括添加钙离子载体、输送离子跨越双层脂质的脂质可溶的分子，例如伊屋诺霉素和a23817。替代策略依赖于电活化或离子的直接注射。单性生殖中的第二重要步骤涉及维持mpf/周期素b抑制，此预防第二极体排出(2pbe)的排出。此引起二倍体(2个母系基因组)单性生殖体的产生，此可以进一步培养成胚泡以用于pn-hpsc细胞分离。因为与scnt相关，所以核转移(即重构)卵母细胞的重构后面还有使用钙改变技术活化卵母细胞。然而，这些当前的scnt和/或单性生殖技术每一者中存在显著的限制。举例来说，虽然已经报导添加蛋白质磷酸酶抑制剂咖啡因至绵羊卵母细胞可增加成熟促进因子(mpf)和有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)的活性且已经在猴卵母细胞中报导类似的益处，但胚泡形成的频率未得到增强。此外，经由钙离子载体、电活化或直接注射的钙活化未产生与自然受精相同的钙时间安排、空间调节或持续时间。添加进一步复杂性的是对钙的作用也似乎是物种特异性的。在一些情况下，用激酶抑制剂，如6-二甲基氨基嘌呤(6-dmap)、乙醇和如放线菌酮(chx)等蛋白质合成抑制剂额外处理的使用用以增强mpf失活，如通过牛类动物、小鼠和其它动物模型所获悉。虽然添加此类试剂有效，但可能存在其它缺点。举例来说，虽然在单性生殖活化期间添加6-dmap预防第二极体的排出和二倍体细胞的产生，但此方法不允许产生更广泛免疫相容性的纯合hpsc细胞系。此外，因为与scnt相关，所以已存在的技术被非整倍性和低效率的核程序重排阻碍，导致高速的发育停止和细胞死亡。在去核、重构期间的结构和基因毒性应力以及卵母细胞活化无效和在scnt接合子的第一有丝分裂期间的缺陷都已经被提出引起使用scnt的不良发育速率。为建立有效产生免疫相容性和/或患者特异性hpsc的技术，本发明者比较了不同的方案，其中变化是：1)重构、2)活化和3)供体细胞。对所有三个方面的了解改善将提供有效的scnt技术，而改善的用于活化卵母细胞的方法将提供优良的单性生殖的方法。因此，本文中描述的技术提供了进行重构、活化和供体细胞选择的变化的比较，并成功地鉴别出人单性生殖和/或scnt的有效条件。本文中描述了一种用于体细胞核转移(scnt)的方法。在一个实施方案中，用于scnt的方法包括卵母细胞的去核、一个或多个供体核的转移、重构的核转移卵母细胞(胚胎)的活化以及任选地进一步培养成胚泡和多潜能干细胞(psc)从胚泡的衍生。在其它实施方案中，此包括分离一个或多个供体核以注射至去核的卵母细胞中。在不同的实施方案中，卵母细胞去核包括去除中期ii(mii)期卵纺锤体。在不同的实施方案中，去除第一极体(1pbe)。在另一个实施方案中，所述方法包括在成熟结束前使卵丘细胞裸露。在一个实施方案中，利用实时的基于非紫外线的对1pbe的监测，监测卵母细胞。在另一个实施方案中，监测在缺乏染色或标记试剂，例如hoechst染色剂下进行。在一个实施方案中，此包括使用偏光显微镜，例如researchinstruments(cri)oosighttm成像系统。举例来说，此可以包括用545nm偏振光目测所收获的收获mii卵母细胞中透明带和纺锤体复合物。在另一个实施方案中，卵母细胞去核包括使用波状轮廓的微量吸液管，其允许刺穿卵母细胞膜和从卵母细胞去除1pbe。在另一个实施方案中，卵母细胞去核包括使用压电性钻头。在其它实施方案中，去核在含有细胞分裂抑素b和任选地蛋白质磷酸酶抑制剂(例如咖啡因)的去核培养基中进行。在另一个实施方案中，供体核的转移包括使用改变卵母细胞的细胞膜结构的试剂。在一个实施方案中，通过使用改变卵母细胞的细胞膜结构的试剂将卵母细胞去核包括与体细胞融合。举例来说，供体核的转移可以包括对注射吸移管(例如12um直径)提供3-4个供体细胞，在含有例如仙台病毒包膜蛋白等副粘病毒或副粘病毒蛋白的一些溶液中排出供体细胞。此后面为使用注射吸移管取回细胞，以一定距离(4-5个细胞长)将供体细胞分开，呈直线排列，用固持吸移管固持卵母细胞，将具有供体细胞的注射吸移管推进卵母细胞中。在不同的实施方案中，推进注射吸移管包括不破坏卵膜质膜，和将一个核供体细胞插入卵母细胞的卵黄周隙(透明带与细胞膜之间的空间)中，以使核供体细胞与卵膜质膜(位于透明带下)接触。在不同的实施方案中，吸移管的取出不破坏卵膜与供体细胞之间的接触。在不同的实施方案中，进一步培育卵母细胞。在不同的实施方案中，细胞在供体细胞插入后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多分钟融合。在不同的实施方案中，细胞在供体插入后10分钟融合。任选地，对于未成功融合的细胞，重复以上程序。在不同的实施方案中，在整个过程中使用例如oosighttm成像系统等偏光显微镜。在一个实施方案中，供体核的转移可以包括电学细胞操纵，例如电融合。在其它实施方案中，所述方法可以包括分离体细胞核供体、干细胞核供体和生殖细胞核供体的核。在其它实施方案中，所述方法可以包括分离体细胞核用于scnt，接着经由吸移管或压电性注射来注射一个或多个供体核。在不同的实施方案中，供体核来自于细胞，例如皮肤成纤维细胞、白血球、毛囊或任何其它体细胞核供体。在另一个实施方案中，本发明描述一种方法，其包括从生殖细胞供体分离和制备核。在不同的实施方案中，核的分离包括组织活检、抽血或其它获得组织样品的方式，用机械分离、胶原酶消化、洗涤、基于离心机的密度梯度分离和/或与标准培养基一起培养对此组织进行加工。在其它实施方案中，所述方法可以包括分离和/或修饰体细胞核供体、干细胞核供体和生殖细胞核供体的核。在不同的实施方案中，此包括甲基化改变试剂，例如表观遗传染色质和/或组蛋白修饰试剂和/或dna修饰试剂。在某些实施方案中，此包括蛋白质精氨酸甲基转移酶(prmt1)和辅助活化子相关的精氨酸甲基转移酶1(carm1/prmt4)或孤儿核受体雌激素相关受体β(esrrb)蛋白质。在某些实施方案中，甲基化改变试剂和/或dna修饰被表达为经修饰的重组蛋白质。举例来说，carm1和esrrb可以用7x精氨酸(7r)细胞渗透肽(cpp)或本领域技术人员已知增强蛋白质和肽穿过细胞膜和核膜、增强结合和/或转活化于dna的任何其它蛋白质修饰。在其它实施方案中，所述方法包括使用基于转录因子的程序重排，用八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、kruppel样因子-4(klk-4)、myod、c-myc、锌指蛋白-42(rex-1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)和/或端粒重复序列结合因子(terf-1)将核供体细胞在表观遗传学上进行程序重排。在不同的实施方案中，所述方法包括直接压电性注射、病毒注射、脂质体注射或胞质内注射的其它方法。在不同的实施方案中，转录因子可以呈可以在核转移至去核的卵母细胞之前应用的mrna、蛋白质和/或细胞提取物形式传递。在其它实施方案中，所述方法包括使用hdac抑制剂(i、ii和iii类)或dnmt3a和dnmt3b抑制剂。在另一个实施方案中，本发明描述一种活化重构的核转移卵母细胞的方法。在一个实施方案中，活化重构的核转移卵母细胞包括在活化培养基中在37℃下处理核转移卵母细胞5分钟，接着在裂解培养基中洗涤。在不同的实施方案中，活化培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基。在某些实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在不同的实施方案中，所述钙离子载体是伊屋诺霉素、a23187、白僵菌毒素、x-537a、燕麦曲菌素、单一大环聚醚或大二环化合物或穴状化合物。在不同的实施方案中，活化培养基包括醇，例如乙醇。在不同的实施方案中，活化培养基包括硫柳汞。在不同的实施方案中，活化培养基包括1、2、3、4、5、5或更多微摩尔浓度的伊屋诺霉素。在其它实施方案中，所述方法包括mii期卵母细胞的电活化。在一个实施方案中，电活化包括电融合培养基中的电脉冲。在不同的实施方案中，电融合培养基包括0.1-0.5m甘露糖醇、0.01-1mmmgso4·7h2o、0.01-1mg/ml聚乙烯醇、1-10mg/ml人血清白蛋白、0.005-0.5mmcacl2·2h2o。在一个实施方案中，电融合培养基包括0.3m甘露糖醇、0.1mmmgso4·7h2o、0.1mg/ml聚乙烯醇、3mg/ml人血清白蛋白、0.05mmcacl2·2h2o。在一个实施方案中，活化重构的核转移卵母细胞允许染色质凝聚、纺锤体形成和化学活化。在其它实施方案中，可以应用电脉冲、任选地接着6-dmap的组合，例如0.25md-山梨糖醇缓冲液中(2x50μsdc脉冲，2.7kv/cm)和6-dmap(2mm，4小时)。在其它实施方案中，各种描述的培养基，例如无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基任选地包括生长因子，例如gm-csf或igf1。在不同的实施方案中，生长因子可以在核转移后1、2、3、4、5、6、7或更多天添加。在不同的实施方案中，核转移卵母细胞在后活化培养基中处理以完全活化。在不同的实施方案中，接着活化的重构的核转移卵母细胞在后活化培养基中培育。在不同的实施方案中，后活化培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基。在不同的实施方案中，所述后活化培养基包括6-dmap、嘌呤霉素、乙醇、放线菌酮(chx)、曲古霉素a(tsa)和/或细胞分裂抑素b(cb)。在不同的实施方案中，活化的卵母细胞在后活化培养基中培育不到30、30-45、45-60、60-90、90-120、120-150、150-180、180-210、210-240、240-270、300-330、330-360、360-390或超过390分钟。在某些实施方案中，活化的卵母细胞培育240、300或360分钟。在不同的实施方案中，活化和后活化步骤在减少氧条件下进行。在某些实施方案中，减少氧条件包括约80-85％、85-90％、90-95％、95％或更多n2、约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多o2和约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多co2。在某些实施方案中，减少氧条件包括约90％n2、约5％o2和约5％co2。在不同的实施方案中，后活化培养基包括裂解培养基中1、2、3、4、5、5或更多毫摩尔浓度的6-dmap，历时1、2、3、4、5、5或更多小时，在例如37℃等温度中在例如约90％n2、约5％o2和约5％co2的气体混合物中培育。在后活化培养基中培育后，将后活化的卵母细胞在洗涤培养基中培育。在不同的实施方案中，洗涤培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基。在另一个实施方案中，培养基不需要连续改变培养基，例如普遍人胚胎培养培养基。在某些实施方案中，洗涤培养基包括tsa。在某些实施方案中，后活化的卵母细胞在包括tsa的洗涤培养基中培育240、300或360分钟。在一个实施方案中，洗涤后活化的重构核转移卵母细胞，并进一步培养。在一个实施方案中，后活化的重构核转移卵母细胞在无6-dmap的培养基中洗涤。在其它实施方案中，各种描述的培养基，例如无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基任选地包括生长因子，例如gm-csf或igf1。在不同的实施方案中，生长因子可以在核转移后1、2、3、4、5、6、7或更多天添加。在另一个实施方案中，活化和/或后活化步骤包括添加从精子、其衍生物和提取物分离的因子。在一个实施方案中，使用任何描述的注射法将人精子因子注射至活化的重构卵中。在一个实施方案中，使用任何描述的注射法将人精子因子注射至后活化的重构卵中。在不同的实施方案中，约一、二、三或四天后，将后活化的重构的核转移卵母细胞转至裂解培养基。在某一实施方案中，后活化约一天后，将重构的核转移卵母细胞转至裂解培养基。在不同的实施方案中，精子因子包括例如从精细胞内部或外部存在的细胞蛋白质分离的因子。在一个实施方案中，使用清洁剂和射出精液的机械掺合获得全精子提取物。在另一个实施方案中，全精细胞提取物用dna酶i和rna酶处理。在另一个实施方案中，将粗提取物在缓冲液中洗涤并离心(20,000g，2小时)。在其它实施方案中，收集新鲜的射出的人精液，并在900g下离心10分钟，以去除精清，接着离心块在含有5mg/ml牛血清白蛋白的sperm-talp中再悬浮，并在相同的设定下离心，接着去除上清液且离心块在核分离培养基(nim：125mmkcl、2.6mmnacl、7.8mmna2hpo4、1.4mmkh2po4、3.0mmedta二钠盐；ph7.45)中再悬浮至每毫升20×108个精液的最终浓度并离心以去除sperm-talp。去除sperm-talp后，离心块用含有1mm二硫苏糖醇、100mm抗纤维蛋白溶酶肽、100mm抗蛋白酶和100mg＝ml大豆胰蛋白酶抑制剂的nim再悬浮至相同体积，接着冷冻(每个循环液体n2中5分钟)和解冻(每个循环15℃下5分钟)循环四次，其中在2℃下在20,000x下50分钟形成致密的精子离心块。最后，小心地去除所得上清液，等分，并保持在-80℃下，直至使用。在不同的实施方案中，将后活化的重构的核转移卵母细胞进一步培养成胚泡。在一个实施方案中，后活化的重构的核转移卵母细胞在例如奎因培养基(quinn’smedium)等sage裂解培养基中进一步培养。在另一个实施方案中，培养基促进多潜能性，例如3i培养基(神经基础培养基50％、dmem/f-1250％、n2补充物1/200v/v、b27补充物1/100v/v、100mml-谷氨酰胺1/100v/v、0.1mβ-me1/1000v/v、su5402(fgfr抑制剂)2μm、pd184352(erk级联抑制剂)0.8μm、chir99021(gsk3抑制剂)3μm)或经改性的3i培养基(包括pd0325901(mapk抑制剂)0.4μm)。在一个实施方案中，进一步培养1、2、3、4、5、5或更多天。在一个实施方案中，在具有程序重排因子和/或甲基化改变试剂的培养基中提供额外的培养。在不同的实施方案中，额外的培养为在补充有carm1和/或esrrb的g2培养基中3天。举例来说，carm1和/或esrrb每一者可以按培养基中每毫升0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或更多微克的浓度提供。在一些实施方案中，carm1和/或esrrb每一者按培养基中2μg/ml的浓度提供。在不同的实施方案中，进一步培养成胚泡和从胚泡衍生多潜能干细胞(psc)包括用酸性台式液(tyrode’ssolution)处理培养的胚泡以去除透明带(zp)。在不同的实施方案中，处理历时几(例如1-5)秒。在不同的实施方案中，去除zp后面为在hepes-htf培养基中洗涤。在不同的实施方案中，分离内细胞团(icm)包括抛弃胚泡的滋养层。在不同的实施方案中，icm细胞涂铺在小鼠胚胎饲养层(mef)上，mef在涂铺前一天制备。在一些实施方案中，将全胚泡涂铺在mef上。举例来说，此方法包括使胚泡的透明带裸露。在不同的实施方案中，所述方法包括用hepes-htf培养基中0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％链霉蛋白酶去除胚泡的透明带。在一个实施方案中，所述方法包括用hepes-htf培养基中0.5％链霉蛋白酶去除胚泡的透明带。。在另一个实施方案中，所述方法包括施加含链霉蛋白酶的th3(sage胚泡培养基)培养基，历时1-10、10-20、20-30、30-60、60-120、120-180或>180秒。在另一个实施方案中，所述方法包括施加含0.5％链霉蛋白酶的htf培养基，历时30-60秒。在一个实施方案中，胚泡来源于从卵母细胞的单性生殖中获得的单性生殖体。在一个实施方案中，hpsc谱系是单性生殖体衍生的人多潜能hpsc(pn-hpsc)细胞系。在另一个实施方案中，胚泡来源于从供体细胞核之体细胞核转移(scnt)至接受体卵母细胞中所获得的重构的核转移卵母细胞。在一个实施方案中，hpsc谱系是体细胞核转移人多潜能hpsc(nt-hpsc)细胞系。在另一个实施方案中，本发明描述了一种免疫外科的方法，其包括内细胞团(icm)从滋养外胚层细胞的机械分散。在不同的实施方案中，将裸露的胚泡在37℃下用兔抗人脾血清处理约10、20、25、30、35、40、45或60分钟。在一个实施方案中，将裸露的胚泡在37℃下用兔抗人脾血清处理约30分钟。在一个实施方案中，所述方法包括用th3(sage胚泡培养基)洗涤裸露的胚泡，在37℃下在用hecm-9(sage胚泡培养基)重构的豚鼠补体中培育30分钟。在不同的实施方案中，通过短暂暴露(45-60秒)于th3(hepes-htf)培养基中0.5％链霉蛋白酶或酸性台式液去除扩展的胚泡的透明带。在一个实施方案中，所述方法任选地包括使用小孔吸移的机械细胞分散，或使用zilos-tk单元(hamiltonthorne)将内细胞团细胞与滋养外胚层细胞分离的激光辅助的孵化法。在一个实施方案中，用于scnt的方法包括卵母细胞的去核、供体核的转移、重构的核转移卵母细胞的活化和任选地进一步培养成胚泡、多潜能干细胞(psc)从胚泡的衍生。在一个实施方案中，卵母细胞去核包括去除中期ii期卵纺锤体。在不同的实施方案中，去除第一极体(1pbe)。在一个实施方案中，供体核的转移包括对注射吸移管(例如12um直径)提供3-4个供体细胞，在含有仙台病毒包膜蛋白的一些溶液中排出供体细胞，使用注射吸移管取回细胞，以一定距离(4-5个细胞长)将供体细胞分开，呈直线排列，用固持吸移管固持卵母细胞，将具有供体细胞的注射吸移管推进卵母细胞中。在不同的实施方案中，推进注射吸移管包括不破坏卵膜和将一个核供体细胞插入卵黄周隙中，以使核供体细胞与卵膜接触。在不同的实施方案中，取出吸移管不干扰卵膜与供体细胞之间的接触。在不同的实施方案中，进一步培育卵母细胞。在不同的实施方案中，细胞在供体插入后10分钟融合。任选地，对于未成功融合的细胞，重复以上程序。在不同的实施方案中，在整个过程中使用例如oosighttm成像系统等偏光显微镜。在其它实施方案中，去核在含有细胞分裂抑素b和任选地蛋白质磷酸酶抑制剂(例如咖啡因)的去核培养基中进行。在其它实施方案中，所述方法包括使用例如mg132等蛋白酶体抑制剂。在某些实施方案中，scnt方法可以包括一个或多个供体核的转移，接着卵母细胞去核。在一个实施方案中，重构的核转移卵母细胞的活化包括在37℃下在活化培养基中处理重构的核转移卵母细胞5分钟，接着在裂解培养基中洗涤。在不同的实施方案中，活化培养基包括5μm伊屋诺霉素。在不同的实施方案中，核转移卵母细胞在后活化培养基中处理以完成活化。在不同的实施方案中，后活化培养基包括在5％co2/5％n2/90％n2氛围中在37℃下，裂解培养基中2mm6-dmap，历时4小时。在一个实施方案中，洗涤活化的核转移卵母细胞，并进一步培养。在一个实施方案中，后活化的重构的核转移卵母细胞在无6-dmap的培养基中洗涤。在一个实施方案中，后活化的重构的核转移卵母细胞在sage裂解培养基中进一步培养。在一个实施方案中，进一步培养2天。在一个实施方案中，在具有程序重排因子和/或甲基化改变试剂的培养基中提供额外的培养。在不同的实施方案中，额外的培养在补充有carm1和/或esrrb的g2培养基中3天。在不同的实施方案中，将活化的核转移卵母细胞进一步培养成胚泡。在不同的实施方案中，进一步培养成胚泡和从胚泡衍生多潜能干细胞(psc)包括用酸性台式液(例如ph2.0)处理培养的胚泡以去除透明带(zp)。在不同的实施方案中，处理历时几(例如1-5)秒。在不同的实施方案中，去除zp后面为在hepes-htf培养基中洗涤。在不同的实施方案中，分离内细胞团(icm)包括抛弃胚泡的滋养层。在不同的实施方案中，icm细胞涂铺在小鼠胚胎饲养层(mef)，mef在涂铺前一天制备。在一些实施方案中，将全胚胎涂铺在mef上。在不同的实施方案中，psc衍生培养基由补充有血清替代品(5％sr，invitrogen)、fbs(10％，hyclone)、plasmamate(5％)、bfgf(32ng/ml)和人lif(2000单元/毫升，sigma-aldrich)的knockout-dmem构成。本文中还描述了一种来源于体细胞核转移的人多潜能干细胞系(nt-hpsc)。在不同的实施方案中，nt-hpsc与供体核在遗传上一致，或几乎一致。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系含有正常46染色体的xx/xy核型。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系能够形成所有三个胚层。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系表达一个或多个多潜能标记物，多潜能标记物包括阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、ssea-3、肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)、tra-1-60、八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、锌指蛋白-42(rex1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)、端粒重复序列结合因子(terf-1)和发育多潜能性相关基因2(dppa-2)。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系不含隐性致死率。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系具有高碱性磷酸酶(ap)和/或端粒酶活性。在不同的实施方案中，nt-hpsc细胞系能够在免疫缺乏动物中形成悬浮的拟胚体和/或包括来源于所有三个胚层的细胞的畸胎瘤。本文中还描述了一种用于人卵母细胞的单性生殖的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在活化培养基中培育中期ii(mii)期卵母细胞以引发单性生殖卵母细胞的形成。在某些实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在不同的实施方案中，所述钙离子载体是伊屋诺霉素、a23187、白僵菌毒素、x-537a、燕麦曲菌素、单一大环聚醚或大二环化合物或穴状化合物。在不同的实施方案中，活化培养基包括醇，例如乙醇。在不同的实施方案中，活化培养基包括硫柳汞。在不同的实施方案中，活化培养基是活化培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基。在其它实施方案中，所述方法包括mii期卵母细胞的电活化。在一个实施方案中，电活化包括电融合培养基中的电脉冲。在不同的实施方案中，电融合培养基包括0.1-0.5m甘露糖醇、0.01-1mmmgso4·7h2o、0.01-1mg/ml聚乙烯醇、1-10mg/ml人血清白蛋白、0.005-0.5mmcacl2·2h2o。在一个实施方案中，电融合培养基包括0.3m甘露糖醇、0.1mmmgso4·7h2o、0.1mg/ml聚乙烯醇、3mg/ml人血清白蛋白、0.05mmcacl2·2h2o。在其它实施方案中，一个或多个卵母细胞首先注射精子因子，接着电学上活化。在某些实施方案中，mii期卵母细胞在活化培养基中在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或超过40℃温度下培育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10分钟，接着在洗涤培养基中洗涤。在某些实施方案中，在37℃温度下mii期卵母细胞暴露于钙离子载体5分钟，接着在洗涤培养基中洗涤。在不同的实施方案中，洗涤培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基。在不同的实施方案中，接着活化的单性生殖卵母细胞在后活化培养基中培育。在不同的实施方案中，后活化培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基或普遍人胚胎培养培养基。在不同的实施方案中，所述后活化培养基包括6-dmap、嘌呤霉素、乙醇、放线菌酮(chx)、曲古霉素a(tsa)和/或细胞分裂抑素b(cb)。在不同的实施方案中，活化的单性生殖卵母细胞在后活化培养基中培育不到30、30-45、45-60、60-90、90-120、120-150、150-180、180-210、210-240、240-270、300-330、330-360、360-390或超过390分钟。在某些实施方案中，活化的单性生殖卵母细胞培育240、300或360分钟。在不同的实施方案中，活化和后活化步骤在减少氧条件下进行。在某些实施方案中，减少氧条件包括约80-85％、85-90％、90-95％、95％或更多n2、约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多o2和约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多co2。在某些实施方案中，减少氧条件包括约90％n2、约5％o2和约5％co2。在后活化培养基中培育后，将后活化的单性生殖卵母细胞在洗涤培养基中培育。在不同的实施方案中，洗涤培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基。在另一个实施方案中，培养基不需要连续改变培养基，例如普遍人胚胎培养培养基。在某些实施方案中，洗涤培养基包括tsa。在某些实施方案中，后活化的单性生殖卵母细胞在包括tsa的洗涤培养基中培育240、300或360分钟。在洗涤培养基中培育后，后活化的单性生殖卵母细胞转移至培养基。在不同的实施方案中，培养基是无hepes的培养基、无蛋白质的培养基、g1或g2培养基、裂解培养基、裂解辅助培养基、ivf培养基、胚泡形成培养基。在另一个实施方案中，培养基不需要连续改变培养基，例如普遍人胚胎培养培养基。在不同的实施方案中，后活化的单性生殖卵母细胞可以在裂解培养基中培养1、2、3、4、4或更多天。在某些实施方案中，在裂解培养基中培养2天。在裂解培养基中培养后，卵母细胞在胚泡形成培养基中培养1、2、3、4、4或更多天。在某些实施方案中，在胚泡形成培养基中培养3天。在一个实施方案中，卵母细胞的活化包括在37℃下培育活化培养基5分钟，接着在裂解培养基中洗涤。在不同的实施方案中，活化培养基包括5μm伊屋诺霉素。在不同的实施方案中，卵母细胞在后活化培养基中处理以完成活化。在不同的实施方案中，后活化培养基包括在5％co2/5％n2/90％n2氛围中在37℃下，裂解培养基中2mm6-dmap，历时4小时。在一个实施方案中，洗涤活化的卵母细胞，并进一步培养。在一个实施方案中，活化的单性生殖卵母细胞在无6-dmap的培养基中洗涤。在一个实施方案中，活化的单性生殖卵母细胞在例如奎因培养基等sage裂解培养基中进一步培养。在另一个实施方案中，培养基促进多潜能性，例如3i培养基(神经基础培养基50％、dmem/f-1250％、n2补充物1/200v/v、b27补充物1/100v/v、100mml-谷氨酰胺1/100v/v、0.1mβ-me1/1000v/v、su5402(fgfr抑制剂)2μm、pd184352(erk级联抑制剂)0.8μm、chir99021(gsk3抑制剂)3μm)或经改性的3i培养基(包括pd0325901(mapk抑制剂)0.4μm)。在一个实施方案中，进一步培养2天。在一个实施方案中，在具有程序重排因子和/或甲基化改变试剂的培养基中提供额外的培养。在不同的实施方案中，额外的培养是在补充有carm1和/或esrrb的g2培养基中3天。在不同的实施方案中，将活化的单性生殖卵母细胞进一步培养成胚泡。在不同的实施方案中，进一步培养成胚泡和从胚泡衍生多潜能干细胞(psc)包括用酸性台式液(例如ph2.0)处理培养的胚泡以去除透明带(zp)。在不同的实施方案中，处理历时几(例如1-5)秒。在不同的实施方案中，去除zp后面为在hepes-htf培养基中洗涤。在不同的实施方案中，分离内细胞团(icm)包括抛弃胚泡的滋养层。在不同的实施方案中，icm细胞涂铺在小鼠胚胎饲养层(mef)上，mef在涂铺前一天制备。在一些实施方案中，将全胚胎涂铺在mef上。在不同的实施方案中，psc衍生培养基由补充有血清替代品(5％sr，invitrogen)、fbs(10％，hyclone)、plasmamate(5％)、bfgf(32ng/ml)和人lif(2000单元/毫升，sigma-aldrich)的knockout-dmem构成。本文中还描述了一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hpsc)系。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系来源于杂合或纯合的卵母细胞。在某些实施方案中，杂合的pn-hpsc细胞系包括如通过人种群体中等位基因变异频率所确定，具有与人种群体的1％、2％、3％、4％、5％、6％或更多免疫相容的hla血清型的hla单倍体的等位基因变异。在某些实施方案中，使用一个原核卵母细胞的单性生殖衍生纯合的pn-hpsc细胞系。在某些实施方案中，使用一个原核纯合卵母细胞的单性生殖衍生纯合的pn-hpsc细胞系。在其它实施方案中，使用包括第二极体排出的单性生殖衍生纯合的pn-hpsc细胞系。在某些实施方案中，纯合的pn-hpsc细胞系包括如通过人种群体中等位基因变异频率所确定，具有与人种群体的1％、2％、3％、4％、5％、6％或更多免疫相容的hla血清型的hla单倍体的等位基因变异。举例来说，hla单倍体a*01、b*08、drb1*03在白种人群体中以超过5％的频率存在。在其它实施方案中，hla-血清型包括hla-a、hla-b、hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr的等位基因变异体。在其它实施方案中，hla血清型包括hla-a、hla-b和hla-dr的等位基因变异体。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系来源于中期i(mi)期卵母细胞。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系来源于中期ii(mii)期卵母细胞。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系含有与供体卵母细胞一致或几乎一致的线粒体基因组。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系含有正常46染色体的xx核型。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系能够形成所有三个胚层。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系表达一个或多个多潜能标记物，多潜能标记物包括阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、ssea-3、肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)、tra-1-60、八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、锌指蛋白-42(rex-1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)、端粒重复序列结合因子(terf-1)和发育多潜能性相关基因2(dppa-2)。。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系不含隐性致死率。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系具有高碱性磷酸酶(ap)和/或端粒酶活性。在不同的实施方案中，pn-hpsc细胞系能够在免疫缺乏动物中形成悬浮拟胚体和/或畸胎瘤。本文中还描述了一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hpsc)的库。在某些实施方案中，库包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20或更多个pn-hpsc细胞系。在不同的实施方案中，库包括具有与人种群体的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多免疫相容的hla血清型的pn-hpsc细胞系。举例来说，hla单倍体a*01、b*08、drb1*03在白种人群体中以超过5％的频率存在。在其它实施方案中，hla-血清型包括hla-a、hla-b、hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr的等位基因变异体。在其它实施方案中，hla血清型包括hla-a、hla-b和hla-dr的等位基因变异体。举例来说，此包括hla-a血清型a1-a3、a9-a11、a23-a26、a28、a29、a30-34、a36、a43、a66、a68、a69、a74和a80、hla-b血清型b5、b7、b8、b12、b13、b14、b15、b16、b17、b18、b21、b22、b27、b35、b37-b72、b75-b78、b81、b*82b*83、hla-c血清型cw01-cw08。主要组织相容复合物ii(mhcii)包括hla-dp血清型dpa1和dpb1、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq血清型dq2-dq9、hla-dr血清型dr1-d18。在其它实施方案中，库包括pn-hpsc细胞系，每个都对人群体中存在的至少一个mhc等位基因是半合或纯合的，其中相对于库的剩余成员，pn-hpsc的所述库的每一成员对不同组的mhc等位基因是半合或纯合的。在其它实施方案中，人胚胎干细胞的库包含对人群体中存在的所有mhc等位基因是半合或纯合的pn-hpsc。所述方法可以应用于产生pn-hpsc的库，每个都对人群体中存在的至少一个mhc等位基因是半合或纯合的，其中相对于库的剩余成员，pn-hpsc的所述库的每一成员对不同组的mhc等位基因是半合或纯合的。在其它实施方案中，这些方法产生对人群体中存在的所有mhc等位基因是半合或纯合的pn-hpsc的库。因此，本发明也提供了通过此类方法制备的pn-hpsc的库。本文中还描述了一种特定波状轮廓的去核吸移管，描述为“刀型吸移管”。在一个实施方案中，波状轮廓的去核吸移管通过牵引无菌的玻璃管来制备，玻璃管接着破裂，通过火琢熔成钝圆形珠粒末端，通过在显微拉制仪上接触和再牵引而锐化。在不同的实施方案中，波状轮廓的去核吸移管包括：1)实心尖锐的精细尖端，2)由牵引的珠粒末端引起的微圆形轮廓边缘，和3)直径大概50um的较大中空管体。在不同的实施方案中，本文中描述的任何去核方法都可以使用波状轮廓的去核吸移管实践。举例来说，去核可以通过以下进行：将卵母细胞与微量吸液管固持在一边，抵着卵母细胞的侧边推进波状轮廓的去核吸移管的精细尖端，其中刺穿后经由圆形牵引的珠粒末端进行卵母细胞操纵以修剪刺穿裂缝且极体定位在裂缝边缘附近，接着可以挤出定位在裂缝附近的极体以供提取。本文中描述了一种用于诱发人卵母细胞释放和/或分离的方法。在一个实施方案中，释放和/或分离的人卵母细胞用于单性生殖。在另一个实施方案中，释放和/或分离的人卵母细胞用于体细胞核转移(scnt)。在不同的实施方案中，卵巢过度刺激用以通过促卵泡激素(fsh)类似物刺激许多卵的产生且通过使用促性腺激素释放激素(gnrh)促效剂/拮抗剂或其它黄体化激素(lh)潮抑制剂预防自发性排卵。在另一个实施方案中，所述方法包括用2d或3d超声波和雌二醇水平监测进行卵泡成熟追踪。在另一个实施方案中，所述方法利用使用人绒毛膜促性腺激素(hcg)或hcg类似物进行卵泡内人卵母细胞的体内成熟。在一个实施方案中，最终卵泡成熟通过hcg刺激发生在卵母细胞供体内。在另一个实施方案中，跟踪惯性减少ohss(卵巢过度刺激综合症)的风险。在另一个实施方案中，所述方法包括使用2d或3d超声波进行囊状卵泡计数。在另一个实施方案中，所述方法包括在无hcg刺激下分离人卵母细胞，和使用第一极体排出(1pbe)的基于非紫外线的实时监测，体外完成卵母细胞成熟。在另一个实施方案中，所述方法包括测定1pbe速率，以定量卵母细胞成熟速率。在另一个实施方案中，所述方法包括提高卵母细胞成熟速率以增强单性生殖和/或scnt的胚泡形成速率，由此提高人多潜能干细胞(hpsc)产生的效率。在另一个实施方案中，所述方法包括使用经阴道的卵提取以通过抽吸辅助的超声波引导的针吸卵泡收获许多成熟卵母细胞，其使用利用iv镇静、全身性或宫颈旁阻滞麻醉的经阴道方法。在另一个实施方案中，不使用局部麻醉。实施例提供以下实施例以更好地说明所要求的发明且不应被解释为限制主题物质的范围。在提及特定材料的程度上，其目的仅仅是说明且不意图限制本发明。本领域的技术人员可以在不运用创新能力和不脱离本发明的范围下发展同等的措施、组合物或反应物。实施例1与单性生殖相关的一般程序单性生殖的关键程序涉及1)制备人mii期卵母细胞，2)活化卵母细胞，3)产生单性生殖体，4)进一步体外培养达至胚泡期，和5)从培养的胚泡衍生人多潜能干细胞(hpsc)。经由此过程衍生的细胞是单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hpsc)。实施例2与scnt相关的一般程序体细胞核转移(scnt)涉及与单性生殖重叠的技术，不过关键差别涉及供体核转移至接受者卵母细胞和胚胎重构。更确切地说，scnt包括1)制备核供体细胞，2)制备人mii期卵母细胞，3)卵母细胞去核，4)体细胞核转移至去核的卵母细胞，5)活化体细胞核转移(重构)的卵，6)体外培养重构卵达至胚泡期，和7)从那些胚胎衍生胚胎干细胞系。经由此过程衍生的细胞是体细胞核转移人多潜能干细胞(nt-hpsc)。实施例3使用成人成纤维细胞制备核供体细胞系供体患者的成纤维细胞可以由皮肤活检产生，其中个别细胞通过胰蛋白酶消化或类似的过程从单层提取。接着可以使用以下示例方案从成人成纤维细胞中获得核。1.在局部麻醉下获得皮肤或其它组织活检(50mg，0.5×0.5cm)。2.在pbs中洗涤组织片段两次。3.在100mm培养皿上用外科手术刀机械粉碎组织并从粉碎的组织小心地去除pbs。4.将组织团粒再悬浮于4.5ml补充有10％fbs、1％非必需氨基酸和10ug/ml青霉素-链霉素溶液以及500ul(2000单元/毫升)ii型胶原酶(lifetechnologies)的dmem中。5.置于培育箱中过夜。6.在300×g下离心3分钟，并将细胞团粒再悬浮于具有10％fbs的dmem中。7.将细胞接种至60mm培养皿中并随后在具有10％fbs、1％非必需氨基酸和10ug/ml青霉素-链霉素溶液的dmem中在37℃下在5％co2和95％空气下培养直至汇合。8.一旦细胞达到80％汇合，低温保存1/2初始产物，并将剩余细胞分成1:3比率，且在上文提及的培养基中培养它们。再重复此程序2次以获得足够细胞用于scnt和将来的基因型分析。在细胞培养结束时，在补充有10％dmso的fbs中低温保存所有剩余的细胞。新鲜制备的细胞或者低温保存的细胞都可以用作核供体。实施例4使用卵丘细胞制备核供体细胞系对于scnt，还将如下所述从供体的卵丘细胞中获得供体核，或从其它组织，包括市售的成人干细胞中获得供体核。接着可以使用以下示例方案从卵丘细胞中获得核。1.大概一半的来自每一个体的细胞制剂作为核供体用于scnt，且其余细胞制剂将迅速冷冻用于基因型分析。2.在裸露过程期间收集卵丘细胞至1.5ml微量离心管中。添加hepes-htf达1.5ml并在1200rpm下离心1分钟。3.倾析上清液，仅仅剩下细胞团粒，添加并混合团粒与100ul4％pvp溶液(pvp，mw36000，calbiochem和sandiego,ca)。这些细胞准备用于核注射。实施例5卵巢刺激方案和卵母细胞提取将患者预先用低剂量口服避孕药处理7-14天。停服口服避孕药后，将施用促性腺激素(果纳芬(gonal-f)或佛尔替姆(follistim))和(微剂量路普诺(lupronor)hcg或美诺孕(menopur))。起始剂量基于患者特性(年龄、第3天fsh、apc)并通过个别医师测定。在第6天开始对卵泡生长和子宫内膜厚度进行经阴道的超声波评估，且在八次连续临床就诊的每一次，测量血清e2水平。此后，基于超声波检查的结果和血清e2水平，可以调整监测频率和促性腺激素的量。除血清e2水平之外，hcg触发的天数(和因此刺激的总天数)还将基于卵泡大小和数目。路普诺(lupron)或hcg的剂量可以按250μg剂量施用。施用hcg后36小时进行卵提取。患者将在其卵提取后一天重新开始口服避孕药。实施例6具体来说卵巢刺激可以使用以下示例程序进行卵提取。1.在低剂量口服避孕药7-14天后用重组卵泡刺激激素(fsh)佛尔替姆，100-150单元，schering-plough)处理年龄在20-34之间的健康女性供体，并从第1天开始，微小剂量重组lh(路普诺或hcg，250ug)emdserono。2.fsh通常从100-150单元开始，并可以在卵泡形成进行时调整。3.当两个主要卵泡到达18mm直径时给予单一剂量的路普诺或hcg(250ug)，以诱发卵母细胞成熟。实施例7收集卵母细胞可以使用以下示例程序进行卵母细胞的收集。1.从吸出的卵泡液中收集卵丘细胞团于具有奎因的advantage受精培养基(sage目录号1021)的50×9mm皮式培养皿中。2.在37℃、5％co2、湿润培育箱中用透明质酸酶(40u/ml)处理收集的卵丘细胞团约2-3分钟，直至卵丘细胞分散。3.使用剥离器尖端(mid-atlanticdiagnostic，#mxl3-100u)去除任何残余的颗粒细胞。4.用奎因受精培养基洗涤卵母细胞两次。5.制备50ul液滴，于willco-dish玻璃培养皿(50×9mm)中经矿物油覆盖。实施例8卵母细胞提取和制备将在绿光(波长>500nm)照射的实验室中进行卵母细胞提取和制备。1.在路普诺或hcg注射后36小时给患者服用镇静剂咪达唑仑(midazolam)5-7.5mg(versed，roche和nutley.nj，usa)和芬太尼(fentanyl)50-75ug(abbottpharmaceutical，abbottpark，ilusa)，且接着使用如先前描述的超声波指导提取卵母细胞。2.在具有5％co2的湿润培育箱中在ivf培养基(奎因ivf培养基，sagebiopharma，bedminster，nj)中洗涤和培育新鲜分离的卵丘细胞-卵母细胞复合物(coc)2小时。3.用透明质酸酶(100iu/ml，sigma，st.louis，mousa)处理coc2分钟并用小孔微量吸液管(150um直径)使其裸露。具有单一第一极体的裸露卵母细胞分类为中期ii(mii)并用于scnt。实施例9体细胞核转移使用oosighttm纺锤体成像系统(cambridgeresearch&instrumentation,woburn,mausa)目测中期ii(mii)纺锤体的去核。此方法避免了hoechst染色和紫外光暴露。将卵母细胞在具有含有0.5ug/ml细胞分裂抑素b的hepes(coopersurgical)的奎因培养基中预先培育5分钟。使用具有去核吸移管(20um直径)的piezo冲击式钻机(primetech,tokyo,japan)进行卵母细胞的去核。将通过操纵吸移管中明亮的椭圆形核复合物的存在确认中期纺锤体的去除。将制备供体人成纤维细胞(或同等的其它类型细胞)。使用用于去核的相同系统融合或注射那些核供体细胞。所有程序都在不直接接触荧光下进行。实施例10体细胞核转移i：直接注射法a)卵母细胞的去核1.将具有可见的第一极体的一批卵母细胞(10个)移至含有细胞分裂抑素b(5ug/ml)的预平衡过的培养基。2.将卵母细胞移至在显微操作皿上制备的小滴去核培养基(hepes-htf+5ug/ml细胞分裂抑素b，coopersurgical)中。3.将具有卵母细胞的皿盘负载至具有加热台的显微操作系统上。4.使用oosighttm成像系统(cambridgeresearch&instrumentation,woburn,mausa)目测纺锤体，固持中期板在2点与4点位置之间的卵母细胞。5.将去核吸移管置于透明带表面上(3点位置)并传递piezo(primetech,tokyo,japan)脉冲以穿过带打孔。6.在刺穿带后立即推进去核吸移管(在非常轻微的正压下)至压紧区域中。7.通过吸取，去除染色体-纺锤体复合物，以及小体积的细胞质。8.对所有卵母细胞重复程序。9.在培养基(裂解培养基，coopersurgical)中彻底洗涤去核卵母细胞以去除痕量细胞分裂抑素b，并在核注射前在新鲜培养基中培养10-15分钟。b)核转移在nt之前，通过在37℃下用0.25％(v/v)胰蛋白酶-edta(lifetechnologies)进行胰蛋白酶消化30秒，从单层提取个别成纤维细胞(或其它类型核供体细胞)，并随后用于nt。轻轻混合供体成纤维细胞至具有奎因受精培养基的液滴中。供体核可以来自裸露细胞，和/或细胞在核转移之前经受表观遗传修饰。1.将核供体细胞(卵丘细胞、皮肤成纤维细胞)在hepes-htf(sagebiopharma)中洗涤，离心，并在4％pvp溶液中复原。2.通过使用piezo系统施加若干脉冲和有力的吸移，分离核。3.使用piezo系统将核注射至去核卵母细胞的卵质中。4.将注射的卵母细胞去除至新鲜培养基；在蛋白质注射前培育30分钟。5.将注射的卵母细胞去除至操纵皿以注射中心体核心蛋白的混合物(人极光b激酶+hset+numa)。所有蛋白质都可得自cbilabs。6.注射蛋白质，大概每一卵4pl。7.在活化前去除注射的卵母细胞并在培养基中培育30分钟。c)重构卵的活化1.在37℃下在活化培养基(5um伊屋诺霉素)中处理nt卵5分钟，并在裂解培养基中彻底洗涤它们。2.在后活化培养基(具有5nm曲古霉素a(trichostatina，tsa)的裂解培养基中2mm6-dmap)中再处理卵4小时。3.在无6-dmap培养基中洗涤活化卵并在含有5nmtsa的培养基(裂解培养基)中培育6小时，接着将其转移至正常培养基。4.开始2天在sage裂解培养基中培养活化卵，并在随后3天在sage胚泡培养基中培养。实施例11改良的卵母细胞去核技术一些用于卵母细胞去核的主要技术包括上述的压电性钻头刺穿和吸取，或空心针尖刺穿和排出。另一众所周知的技术包括使用大孔吸持吸移管的“筷子”法和经由精细尖端吸移管的卵母细胞的侧边刺穿和剥掉一部分细胞膜。经由剪切运动，精细尖端吸移管允许通过螯合刺穿破缝与的精细尖端吸移管之间的极体进行提取来提取遗传物质。这些技术的一个缺点是置于操纵卵母细胞上的机械应力，其可能减弱细胞存活力并引起细胞系产生效率低。本文中描述了一种改良的去核技术，其使用特别设计的去核吸移管。此“刀型吸移管”可以通过牵引无菌玻璃管，接着玻璃管破裂并通过火琢熔成钝圆形珠粒末端来制备。吸移管的钝圆形珠粒末端通过接触和在显微拉制仪上再牵引来锐化。此过程形成“刀型移液管”，包括多个特征：1)实心尖锐的精细尖端，2)由牵引的珠粒末端引起的略微圆形轮廓边缘，和3)直径大概50um的较大中空管体。与用于保持人成熟卵母细胞稳定的火琢的保持吸移管(外径：120-150um；内径：20-30um)组合，可以实现优良的去核显微操作。举例来说，如图1中所示，“刀型吸液管”的轮廓允许在尖端抵着(b)通过保持吸移管来保持稳定的细胞的侧边前进时，经由(a)实心尖锐的精细尖端有效刺穿透明带。(c)刺穿之后，经由圆形牵引的珠粒末端操纵卵母细胞以“修剪”裂缝和(d)极体定位于裂缝边缘附近。在较大的中空管体为使用者提供整体结构以更容易地抓住刀型吸移管下，(e)定位于裂缝附近的极体接着可以(f)挤出以供提取。这些特征一起组合在单一去核吸移管中允许每一步用单一装置快速地进行，由此减少卵母细胞的物理操纵并减小细胞膜裂缝的大小。接着可以通过oosighttm成像系统(偏光显微术)确认去核。实施例12体细胞核转移ii：体细胞融合法a)卵母细胞的去核，如所述。b)体细胞转移在卵黄周隙中1.在注射吸移管(12um直径)中获取3-4个供体细胞，排成一行。在此过程期间，应注意不破坏质膜。2.用保持吸移管保持卵母细胞。3.将注射吸移管置于透明带表面上并施加piezo脉冲以穿过带打孔。4.将具有供体细胞的注射吸移管推进至卵母细胞中，不打破卵膜，并以核供体细胞紧密地接触卵膜的方式将一个核供体细胞轻轻地插入卵黄周隙中。5.轻轻地取出吸移管，最初相对迅速，接着缓慢。6.对整个卵母细胞组完成此程序，并将其返回至培育箱中。c)卵母细胞-体细胞融合在电融合缓冲液(0.3md-山梨糖醇、0.1mm乙酸钙、0.5mm乙酸镁、0.1mmhepes、0.5mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、50umd-myo-2,4,s、三磷酸肌醇)中用btx200electrocellmanipulatortm(btxharvardapparatus,holliston,mausa)使用0.5mm电融合腔室进行电融合。1.将3-4个卵母细胞-体细胞偶联体排列在用电融合缓冲液覆盖的电融合腔室的2个线之间。2.施加160kev/cm的dc脉冲5微秒。或者，可以施加例如20秒的更长时间。3.在胚胎培养基中彻底洗涤重构卵母细胞，并在4孔皿(10个细胞/孔)中在普遍培养基(0.3％人血清白蛋白+普遍培养基)中培养它们。4.在起始脉冲后30分钟内检查融合。针对未融合的偶联体再重复一次。d)重构卵的活化使用与体细胞核转移i中相同的方法活化重构的卵母细胞。实施例13基于仙台病毒的卵母细胞-体细胞融合本文中描述了一种改良的用于实现卵母细胞-体细胞融合的技术，其依赖于来自反义的单股rna仙台病毒(sev)的重组蛋白质包膜的应用。sev病毒因其融合胚胎细胞的能力而众所周知，且可以应用不含任何遗传物质的重组sev表面包膜蛋白质(sev-e)而无感染或增殖能力的风险。sev用于卵母细胞-体细胞融合从根据制造商方案(genomone-cfex,ishiharasangyokaisha,目录号isk-cf001-ex)在悬浮缓冲液中制备冻结干燥的sev-e开始。接着悬浮缓冲液中的sev-e添加至先前稀释的20x细胞融合缓冲液中。接着经由微滴添加，添加组合的混合物缓冲液中的sev-e，位于含有供体核体细胞的吸移管尖端与接受者去核卵母细胞之间。细胞可以来自裸露细胞，和/或细胞在核转移之前经受表观遗传修饰。经由微滴用混合物缓冲液中的sev-e涂布供体核体细胞和接受者去核卵母细胞的细胞膜表面允许在不使用电融合下发生体细胞融合。接受者卵母细胞上物理和电生理学应力的此减少改善了细胞存活力和有效的细胞系产生。实施例14使用基于仙台病毒的卵母细胞-体细胞融合的改良技术a)卵母细胞的去核使用实施例11和其它地方(图1)中描述的“刀型吸移管”法去除mii期卵纺锤体复合物。整个此程序中使用oosighttm(纺锤体图)以消除卵母细胞暴露于紫外光。重要的是去除每个卵母细胞中的第一极体，另外其可以在融合过程期间与卵母细胞融合。b)体细胞转移在卵黄周隙中1.在注射吸移管(12um直径)中获取3-4个供体细胞，排成一行。在此过程期间，应注意不破坏质膜。2.在仙台病毒包膜蛋白质的小滴中排出供体细胞并再次获取它们，每一细胞之间的距离短(4-5个细胞长)。3.用保持吸移管保持卵母细胞。4.将具有供体细胞的注射吸移管推进至卵母细胞中，不打破卵膜，并以核供体细胞紧密地接触卵膜的方式将一个核供体细胞轻轻地插入卵黄周隙中。5.在不干扰卵膜和供体细胞接触下轻轻取出吸移管。6.对整个卵母细胞组完成此程序，并将其返回至培育箱中。7.供体细胞插入后10分钟检查融合。融合过程相对迅速地发生，因此如果融合在细胞插入后15分钟未发生，那么重复以上程序。d)重构卵的活化和培养1.在37℃下在活化培养基(5um伊屋诺霉素)中处理nt卵5分钟，并在裂解培养基中彻底洗涤它们。2.在5％co2/5％n2/90％n2氛围中在37℃下在后活化培养基(裂解培养基中2mm6-dmap)中再处理卵4小时。实施例15改良的重构卵母细胞活化技术目前，有关nt的各种报告提出在8细胞期活化重构核转移卵母细胞(胚胎)作为预防有效细胞系产生的限制性步骤，因为卵母细胞发育从基于母系rna的转录变成宿主基因组活化。至多少至2％的重构卵母细胞跨过此关键界限，但目前不知道什么生物因素可以增强基因组活化。本文中描述了迄今未知的发现：精子因子，例如精子头部和尤其中间连接段和精子尾部中存在的因子可以应用于改良nt期间重构卵母细胞的基因组活化。不受任何具体的理论束缚，中心粒(有丝分裂纺锤体形成所需的重要复合物)在mii期卵母细胞中是缺乏的。重构卵母细胞中中心粒的缺乏可以解释在nt期间对基因组活化的关键限制。而已知这些蛋白质位于人精子的精子头部与中间连接段之间的连接段内，且在活化过程期间精子因子的添加可以通过提供有丝分裂所必需的生物机构而改善基因组活化。实施例16用于卵母细胞活化的精子因子的制备更确切地说，可以通过用清洁剂和机械掺合处理射出的精液，分离精细胞内部或外部存在的细胞蛋白质，获得精子因子，接着用dna酶i和rna酶处理全精细胞提取物以消除任何遗传物质污染。最终步骤是通过在缓冲液中洗涤并离心(20,000g，2小时)来浓缩粗提取物。1.收集新鲜的射出的人精液，并在900g下离心10分钟以去除精清。2.在含有5mg/ml牛血清白蛋白的sperm-talp中再悬浮团粒，并在相同设置下离心。3.去除上清液并将精液团粒在核分离培养基((nim：125mmkcl、2.6mmnacl、7.8mmna2hpo4、1.4mmkh2po4、3.0mmedta二钠盐；ph7.45(kuretake等人,1996))中再悬浮至20×108个精子/毫升的最终浓度且离心以去除sperm-talp。4.用含有1mm二硫苏糖醇、100mm抗纤维蛋白溶酶肽、100mm抗蛋白酶和100mg＝ml大豆胰蛋白酶抑制剂的nim将团粒再悬浮至相同体积。5.接着悬浮液进行冷冻(每个循环液体n2中5分钟)和解冻(每个循环15℃下5分钟)循环四次，接着精子在2℃下在20,000x下形成团粒，历时50分钟。6.小心地去除所得上清液，等分，并保持在-80℃下，直至使用。接着使用任何描述的注射法将人精子因子注射至重构的卵中。在约二十四小时后，卵母细胞转至裂解培养基。又二十四小时后，卵母细胞转移至g2培养基。使用此方法，本发明者可以实现高达40-80％成功率的成功的重构卵母细胞活化，实际上消除了成功nt先前麻烦的障碍。实施例17改良的用于建立多潜能干细胞系的技术虽然过去十年间已经显著地发展了从培养的胚泡建立多潜能干细胞的普遍技术，但还有待实现成功应用于nt。不受任何具体理论的束缚，似乎至少一个显著限制是供体核的表观遗传状态。具体地说，成人核的甲基化状态或其它表观遗传因子可以预防转移至接受者卵母细胞的胚胎发育过程中时有效的程序重排。关于此，在nt之前供体细胞和其核向胚胎甲基化状态的修饰可能呈现了一个在产生nt-hpsc细胞系中回避障碍的机会。提出了两种方法。第一种方法包括在nt之前使用传递至核供体细胞的程序重排因子。程序重排因子的实例包括八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、克里佩尔样因子4(kruppel–likefactor-4，klf-4)、c-myc和nanog。此类程序重排因子先前已经用于从成人体细胞产生诱发的多潜能干细胞(ipsc)，由此证明其改变核状态至更原始发育状态的潜能。其它近来描述的程序重排因子，例如孤儿核受体雌激素相关受体β(esrrb)可以类似地应用，因为程序重排因子能够接近核可以增强标靶细胞中程序重排作用的效率。类似地，例如myod等其它早期胚胎转录因子的转活化结构域可以与程序重排因子融合(例如oct4-myod融合蛋白)，从而实现相同的作用。第二种方法依赖于甲基化改变试剂，所述试剂在nt之前改变供体核的甲基化状态。使用此方法，甲基转移酶，例如蛋白质精氨酸甲基转移酶(prmt1)和辅助活化子相关的精氨酸甲基转移酶1(carm1/prmt4)(已知涉及改变组蛋白甲基化的辅助活化子相关的蛋白质)可以在nt之前传递至供体核供体细胞。这些甲基化改变蛋白质的应用提供了一种产生表观遗传修饰的机制，其允许产生nt-hpsc细胞系。如本文中描述，本发明者已经成功地应用两种重组蛋白质esrrb和carm1，与7x精氨酸(7r)-细胞穿透肽(cpp)结合，可再生地以几乎30％的效率从活化的重构的卵母细胞产生nt-hpsc。使用人短串联重复序列(str)探针的分子dna指纹分析证实所得nt-hpsc细胞系具有与核供体一致或几乎一致的特性。在各种应用中，有利的是应用已知支持多潜能性的培养条件。此包括例如应用3i培养基(神经基础培养基50％dmem/f-1250％、n2补充物1/200v/v、b27补充物1/100v/v、100mml-谷氨酰胺1/100v/v、0.1mβ-me1/1000v/v、su5402(fgfr抑制剂)2μm、pd184352(erk级联抑制剂)0.8μm、chir99021(gsk3抑制剂)3μm)或经改性的3i培养基(包括pd0325901(mapk抑制剂)0.4μm)。不受任何具体理论的束缚，提出esrrb和carm1的应用利用了与参与建立和维持多潜能性的关键转录因子的相互作用。举例来说，esrrb对未分化的状态的维持具有重要的作用，且调节作为干细胞和胚胎中转录因子的oct-4和nanog基因的表达。carm1使h3精氨酸残基17(h3r17)甲基化且已知r26经由调节各种转录因子来控制许多基因的表达。据报导cpp-esrrb和cpp-carm1的处理上调成人干细胞的oct-4、sox-2和nanog的表达。在每种情况下，穿透细胞膜和在简单添加至培养基后的入核似乎促进多潜能标记物的表达。另外，培养基中cpp-esrrb和cpp-carm1可以增加oct4的表达。反过来，这些相互作用似乎有助于衍生自玻璃化冷冻/温热小鼠胚胎和克隆人胚胎的胚泡的细胞数。先前通过其它方法未实现的nt-hpsc细胞系产生中的此突破性实现证明了如下概念证明：在nt之前使用程序重排因子和/或甲基化改变试剂对供体核的修饰是成功的nt-hpsc细胞系产生的一个关键步骤。实施例18使用改良的用于建立多潜能干细胞系的技术的结果a)卵母细胞的去核使用实施例11、14和其它地方(图1)中描述的“刀型吸移管”法去除mii期卵纺锤体复合物。b)体细胞转移在卵黄周隙中如实施例14和其它地方中所描述转移体细胞供体核。d)重构卵的活化和培养1.在37℃下在活化培养基(5um伊屋诺霉素)中处理nt卵5分钟，并在裂解培养基中彻底洗涤它们。2.在5％co2/5％n2/90％n2氛围中在37℃下在后活化培养基(裂解培养基中2mm6-dmap)中再处理卵4小时。3.在无6-dmap培养基中洗涤活化卵，且开始2天在sage裂解培养基中培养活化卵，并在随后3天在补充有carm1和/或esrrb(每一者2μg/ml)的g2培养基中培养。e)多潜能干细胞衍生1.用酸性台式液(ph2.0)处理培养的胚泡几秒，以去除透明带(zp)。zp去除后，在hepes-htf培养基中有力地洗涤胚胎，以去除任何痕量的台式液。2.如果内细胞团(icm)可见，那么使用激光辅助的胚泡解剖系统(hamilton-thorneinc.)分离icm。抛弃胚泡的剩余部分(滋养层)以确保胚泡不再完整。3.将icm涂铺在mef之上，mef是在涂铺前一天制备。如果克隆的胚泡具有无法区别的icm，那么涂铺整个胚胎。hpsc衍生培养基由补充有血清替代品(5％sr，invitrogen)、fbs(10％，hyclone)、plasmamate(5％)、bfgf(32ng/ml)和人lif(2000单元/毫升，sigma-aldrich)的knockout-dmem构成。4.在无任何改变下，在相同培养基中培养icm3天。5.在第4天置换大概1/3的培养基。6.从第6天起，每隔一天置换1/2的培养基。7.在涂铺后7天内看见初始产物。8.在第12天前扩展和低温保存群落。如所述，使用常规技术，仅仅至多2％的重构卵母细胞跨过8细胞界限，由此通过不能诱发胚泡形成，有效地限制nt-hpsc的产生。然而，使用本文中描述的技术，本发明者已经使用例如carm和esrrb等甲基化改变试剂去除了此障碍。如表1中所示，16个样品中未处理的重构卵母细胞未进展至早期胚泡形成。与已存在的报告一致，大多数的此类卵母细胞无法发育超过4细胞和8细胞分裂期。对比之下，47个样品中9个carm处理的重构卵母细胞能够到达早期胚泡阶段。显著地，几乎2/3的这些carm处理的重构卵母细胞进一步能够形成扩展胚泡。类似地，6个样品中3个esrrb处理的重构卵母细胞能够形成早期胚泡，不过这些重构卵母细胞中无一者形成扩展胚泡。在任一情况下，与对照相比，carm和/或esrrb处理清楚地允许重构卵母细胞发育超过8细胞分裂期，由此消除了产生nt-hpsc细胞的先前无法逾越的鸿沟(表1)。表1.carm和esrrb蛋白质对scnt胚胎培养的作用处理卵母细胞数2细胞4细胞8细胞桑椹胚早期胚泡扩展胚泡未处理1615143100carm474337281696esrrb6666330证明此类细胞形成可以分离和培养nt-hpsc的胚泡的能力，进一步培养重构卵母细胞，如所述涂铺在小鼠胚胎饲养层(mef)上，其中观测到初始长出。额外培养后，内细胞团(icm)细胞与滋养外胚层分离且能够或幸存下来进行初始传代。此展示于图2中，其中(a)展示体细胞核转移胚泡，其接着(b)在去除透明带后涂铺。此类细胞能够存活，因为观测到(c)nt-胚胎的初始长出。icm细胞的分离引起(d)胚细胞样群落在3个传代后形成。在carm处理的至少一种情况下，从胚泡分离的细胞能够存活超过3个传代，由此证明了成功产生nt-hpsc细胞系(表2)。表2.carm蛋白质对nt-hpsc细胞衍生的作用处理涂铺初始长出传代1≥3个传代carm7221esrrb3000实施例19卵母细胞的单性生殖单性生殖是可以用于产生hpsc细胞的第二种不同方法。hpsc细胞通过单性生殖的产生，本文中描述为单性生殖体衍生的hpsc(pn-hpsc)与供体卵母细胞遗传学上一致，且提供了一种为任何产卵女性产生hpsc细胞的方法。另外，因为单性生殖不涉及父系的影响，所以与使用任何父系影响产生的hspc细胞比较，pn-hpsc的hla复杂性基本上降低。pn-hpscs细胞降低的hla复杂性极大地减少了组织相容性问题，因为pn-hpsc可以经工程化以与群体的相当大部分广泛相容，甚至是在缺乏确切的遗传组织匹配的情况下。举例来说，虽然存在高度的hla多态现象，但在美国白种人群体内仅仅存在接近200种共同hla单倍体。已经估计针对共同单倍体而选择的一组少至十种hla纯合hpsc谱系可以提供几乎40％英国接受者的完全hla-a、hla-b和hla-dr匹配，和几乎65％的有益匹配。与宽泛群体的此免疫相容性产生hpsc细胞组作为移植材料可再生来源的可能性。关键地，具有宽组织相容性的干细胞库内hpsc谱系的自我更新能力将减少对新的卵母细胞不间断供应的需要。实施例20单性生殖活化的可变方法：pn-hpsc细胞系特性经由以上描述的程序获得的一些mii期卵可以用于产生单性生殖的胚细胞系。使用与体细胞核转移i中针对pn-hpsc的产生描述的相同程序活化和培养完整的卵母细胞。重要的是认为已存在的人单性生殖的报告证明卵母细胞活化和后活化技术的差异对界定所得pn-hpsc细胞系的免疫特征的遗传组分具有直接影响。举例来说，两种特定方法为产生整体上与卵母细胞供体hla匹配的杂合pn-hpsc，或与群体的显著部分组织相容的纯合pn-hpsc。尽管单性生殖经由消除父系影响而减少pn-hpsc细胞系的遗传变异，但纯合的hpsc产生经由通过消除等位基因变体的一个来源，且提供与宽范围的个体组织相容的细胞产生hla单倍体，进一步减少遗传异质性。实施例21单性生殖i：产生杂合pn-hpsc如所述，卵母细胞活化的一般方法是模拟通常由精子进入所引起的钙改变作用。作为一个实例，杂合的hlapn-hpsc谱系可以通过应用伊屋诺霉素活化卵母细胞，接着添加嘌呤霉素类似物6-dmap(6-二甲基氨基-嘌呤，其通过抑制组蛋白h1激酶的活化而可逆地预防自发胚泡分解)产生。伊屋诺霉素和6-dmap的逐步添加最初引发钙流动，引起蛋白质磷酸化的抑制，这些过程诱发原核形成，而非减数分裂的完成。其它方法依赖于卵母细胞的电活化，接着添加伊屋诺霉素和6-dmap。然而，这些技术共同之处是添加6-dmap以促进原核形成，此预防第二极体的排出，且引起二倍体细胞的产生。归因于在早期胚胎发生期间交叉(父系和母系基因组重组)的形成，此通常不允许纯合hpsc细胞系的产生。因此，第一减数分裂后，剩余卵母细胞核是杂合的，具有母系与父系基因组。更确切地说，用于产生杂合pn-hpsc谱系的卵母细胞的单性生殖可以经由以下程序获得：a)卵母细胞提取和制备1.将卵丘细胞-卵母细胞单元复合物(coc)用透明质酸酶(100iu/ml，sigma，st.louis，mousa)处理2分钟并用小孔微量吸液管(150um直径)来使其裸露。不使用具有胚泡(gv)或没有第一极体的裸露卵母细胞。具有单一第一极体的裸露卵母细胞分类为中期ii(mii)卵母细胞。或者，coc可以用synvitrohyadase处理以去除卵丘细胞，接着与具有石蜡涂覆层的ivf培养基一起培育30分钟。b)卵母细胞的活化1.在37℃下在活化培养基(5um伊屋诺霉素)中处理mii卵母细胞5分钟，并在裂解培养基中彻底洗涤它们。2.在后活化培养基(具有5nm曲古霉素a(tsa)的裂解培养基中1-2mm6-dmap)中再处理卵4小时。3.在无6-dmap培养基中洗涤活化卵并在含有5nmtsa的裂解培养基中培育6小时，接着将其转移至正常培养基。4.开始2天在sage裂解培养基中培养活化卵，并在随后3天在sage胚泡培养基中培养。或者，可以在具有石蜡涂覆层的ivf培养基中，通过连续暴露于5um伊屋诺霉素5分钟，和1-2mm6-dmap4小时，小心洗涤和在具有石蜡涂覆层的新鲜ivf培养基中培养，接着第二天在裂解培养基中培养进行活化。实施例22单性生殖ii：产生纯合pn-hpsc对比之下，产生hla纯合hpsc细胞系的一种直接方法是从hla纯合卵母细胞供体，包括一个原核卵母细胞，产生此类谱系。然而，此方法的一个关键缺点是群体中纯合供体相对稀少。或者，hla纯合hpsc细胞系可以从杂合供体中，通过除去6dmap添加的方法允许第二极体排出(2pbe)获得。此方法依赖于诸如ca2+离子载体、a23817或伊屋诺霉素和后来嘌呤霉素或无细胞分裂抑素b的环己酰胺等活化剂的初始添加，其允许第二极体的排出，因此产生仅仅具有中期ii染色体组一半的单倍体单性生殖体。这些单倍体单性生殖体可以进一步培养成二倍体胚泡，用于形成纯合基因型。更确切地说，用于产生纯合pn-hpsc谱系的卵母细胞的单性生殖可以经由以下程序获得：a)卵母细胞提取和制备，如所述。b)卵母细胞的活化1.在37℃下在活化培养基(5uma23187)中处理mii卵母细胞5分钟，并在裂解培养基中彻底洗涤它们。2.在后活化培养基(10ug/ml嘌呤霉素裂解培养基或无细胞分裂抑素b的环己酰胺)中再处理卵4小时。3.洗涤活化卵并在裂解培养基中培育24小时，或直至其发育成2细胞分裂期胚胎。这2个分裂球接着在基于甘露糖醇或山梨糖醇的融合培养基中使用电融合机(btx2000，harvardelectric)通过施加160mv电20微秒来电融合。任选地，可以施加单一脉冲，且此已经被证明是足够使分裂球融合。在sage裂解培养基中再培养再融合卵1天，并随后3天在sage胚泡培养基中培养。实施例23hpsc细胞系的产生产生单性生殖体(经由单性生殖)后，随后培养引起胚泡形成，由此可以从内细胞团中，经由分离周围滋养层组织获得hpsc。1.用链霉蛋白酶(0.5％，sigma-aldrich)或酸性台式液(ph2.0)处理培养的胚泡几秒，以去除透明带(zp)。zp去除后，在hepes-htf培养基中有力地洗涤胚胎，以去除任何痕量的链霉蛋白酶或台式液。2.使用激光辅助的胚泡解剖系统(hamilton-thorneinc.)分离内细胞团(icm)。抛弃胚泡的剩余部分(滋养层)以确保胚泡不再完整。3.将icm涂铺在mef之上，mef是在涂铺前一天制备。hpsc衍生培养基由补充有血清替代品(10％sr，invitrogen)、fbs(5％，hyclone)、plasmamate(5％)、bfgf(32ng/ml)和人lif(2000单元/毫升，sigma-aldrich)的knockout-dmem构成。4.在无任何改变下，在相同培养基中培养icm3天。5.在第4天置换大概1/3的培养基。6.从第6天起，每隔一天置换1/2的培养基。7.在涂铺后7天内看见初始产物。8.在第12天前扩展和低温保存群落。实施例24pn-hpsc和nt-hpsc细胞系的表征可以进行多种基因组、转录物组、表观遗传、蛋白质和/或功能研究以表征所得pn-hpsc和nt-hpsc细胞系。在一个实例中，可以在转录本(例如微阵列、qrt-pcr)或蛋白水平(例如蛋白质印迹法、免疫细胞化学、2d凝胶)测量hpsc多潜能性标记物。这些多潜能标记物尤其包括碱性磷酸酶(ap)、阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、ssea-3、肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)、tra-1-60、八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、锌指蛋白-42(rex1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)、端粒重复序列结合因子(terf-1)和发育多潜能性相关基因2(dppa-2)。另外，使用人短串联重复序列(str)探针的dna指纹分析可以用于pn-hpsc和nt-hpsc细胞系的基因组分析。在pn-hpsc情况下，所得细胞系与卵母细胞供体一致或几乎一致。在nt-hpsc情况下，所得细胞系具有与核供体一致或几乎一致的特征。证实nt-hpsc成功产生的另一关键问题是消除去核失败的可能性和随后单性生殖活化。在其它实例中，可以使用单核苷酸多态现象(snp)微阵列分析基因组dna以确定遗传等效。在一个实例中，二元snp标记物的杂合性具有0.5的最大值，且可以在杂合性超过0.375(群体中频率超过0.25，但不到0.75)的snp标记物上进行分析。在另一实例中，内标记物距离，例如0.1cm，可以用于除去具有紧密键的snp标记物，因为其提供较少的基于个体的信息。在另一实例中，可以进行表观遗传研究。举例来说，也可以在亚硫酸氢盐处理后使用基因组dna应用于阵列，分析甲基化，允许cpg位点的问讯。最终，hpsc的主要特性是从外胚层、中胚层和内胚层所有三个胚层分化成体细胞的多潜能能力，以及自我更新。因而，可以经由畸胎瘤形成，经由肌肉内(im)注射至适当动物模型(例如scid小鼠)中，或在低附着条件下培养后通过拟胚体(eb)形成，评估多潜能性。此外，可以通过长期(例如1年、>50传代)的高度增殖和连续繁殖、端粒酶活性水平和/或稳定的核型观测到自我更新能力。实施例25mhc-hla匹配主要组织相容性复合物(mhc)-人白细胞抗原(hla)匹配是器官捐赠期间免疫耐受性的关键。在缺乏mhc-hla匹配的情况下，需要免疫抑制药品。因为免疫排斥风险的程度随供体与受体细胞表面抗原呈递蛋白质之间的差异程度而变，所以评估通过各种描述的方法产生的pn-hpsc和nt-hpsc细胞系的mhc-hla型态是关键的。mhci类和ii类hla单倍体是一起从亲代遗传的特定组的hla-a、hla-b、hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr基因座等位基因。虽然存在高度的hla多态现象，但在美国白种人群体内仅仅存在接近200种共同hla单倍体。此mhc-hla匹配提供了在pn-hpsc细胞系的产生中不存在单性生殖误差的额外证据。如与nt-hpsc细胞系相关，重要的是验证成功的核转移，从而除去偶然的单性生殖活化。为建立每一nt-hpsc细胞系不是偶然产生的pn-hpsc细胞系，针对所有hla同型的相应供体，检查nt-hpsc。实施例26mhc-hlai和ii血清型在不同的实例中，可以通过从各种供体来源，例如血液或卵丘细胞提取基因组dna，并经由等位基因特定的测序引物的pcr分析等位基因变异，来进行hla基因型分析。主要组织相容性复合物i(mhci)包括hla-a血清型a1-a3、a9-a11、a23-a26、a28、a29、a30-34、a36、a43、a66、a68、a69、a74和a80、hla-b血清型b5、b7、b8、b12、b13、b14、b15、b16、b17、b18、b21、b22、b27、b35、b37-b72、b75-b78、b81、b*82、b*83、hla-c血清型cw01-cw08。主要组织相容复合物ii(mhcii)包括hla-dp血清型dpa1和dpb1、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq血清型dq2-dq9、hla-dr血清型dr1-d18。实施例27hla纯合hla类型es细胞系库如前述，即使存在高度的hla多态现象，在美国白种人群体内也仅仅存在接近200种共同hla单倍体。已经估计针对共同单倍体而选择的一组少至十种hla纯合hpsc谱系可以提供几乎40％英国接受者的完全hla-a、hla-b和hla-dr匹配，和几乎65％的有益相配。与宽泛群体的此免疫相容性产生hpsc细胞库作为移植材料可再生来源的可能性。关键地，具有宽组织相容性的干细胞库内hpsc谱系的自我更新能力将减少对新的卵母细胞不间断供应的需要。一种产生hla纯合hpsc细胞系的直接方法是使用从hla纯合供体中获得的体细胞产生此类细胞系。然而，此方法的一个关键缺点是群体中纯合供体相对稀少。克服此缺点的一个策略是筛选成组的脐带血细胞。在大多数情况下，在低温保存前，测试并记录给定脐带血的hla类型，因此通过简单的文献筛选，容易发现那些hla纯合脐带血细胞(尤其是单核细胞、cd34+)样品，接着可以分选，获得并用作核转移供体细胞。产生30-50之间的hla纯合细胞系并分组为移植材料。所有核转移程序和胚胎干细胞衍生程序均与本申请中所述相同。上述各种方法和技术提供了大量进行本发明的方式。当然，应了解不一定所描述的所有目标或优点都可以根据本文中描述的任何具体的实施方案实现。因此，举例来说，本领域的技术人员将认识到所述方法可以按实现或优化如本文中传授的一个优点或一组优点的方式进行，不一定实现如本文中可能传授或建议的其它目标或优点。本文中提及多种有利和不利的替代物。应了解一些优选的实施方案特定包括一个、另一个或若干个有利的特征，而其它特定除去一个、另一个或若干个不利的特征，而再其它通过包括一个、另一个或若干个有利的特征，特定减少当前不利的特征。此外，熟练技工将从不同的实施方案认识到各种特征的适用性。类似地，以上讨论的各种要素、特征和步骤以及每一此类要素、特征或步骤的其它已知的同等物可以由本领域技术人员进行混合和匹配以进行根据本文中描述的原理的方法。在各种要素、特征和步骤中，在各种实施方案中，将特定包括一些，且特定除去其它。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开本发明，但本领域的技术人员应了解本发明的实施方案扩展超过具体公开的实施方案至其它替代实施方案和/或用途和其修改和同等物。已经在本发明的实施方案中公开了许多变体和替代要素。本领域技术人员将显而易见其它变体和替代要素。这些变体为(不限于)单性生殖、体细胞核转移、制备、分离或修饰用于所述单性生殖或体细胞核转移技术中的细胞、衍生来自上述技术的多潜能细胞系、治疗涉及本发明的传授的疾病和/或病状的方法、其中使用的技术和溶液的组成和用途以及通过本发明的传授产生的产物的具体用途。本发明的各种实施方案可以具体地包括或除去这些变体或要素的任一者。在一些实施方案中，应了解用于描述和要求本发明的某些实施方案的表示成分、特性(例如浓度)、反应条件等的量的数字在一些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和随附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，它们可以视设法通过具体实施方案获得的所需特性而改变。在一些实施方案中，数字参数应按照报导的有效数的数字并通过应用一般舍入技术来解释。尽管阐述本发明的一些实施方案的宽广范围的数值范围和参数是近似值，但以下特定实施例中所阐述的数值尽可能准确地报导。本发明的一些实施方案中呈现的数值可能含有某些必然由各别测试测量中存在的标准偏差所引起的误差。在一些实施方案中，在描述本发明的具体的实施方案的上下文中(特别是以下权利要求书的某些权利要求的上下文中)术语“一种(a和an)”和“所述”以及类似的提及可以解释为涵盖单数与复数。本文中值范围的叙述仅仅意图用作个别地提及范围内每个单独值的一种速记方法。除非本文中另外指明，否则每个个别的值如同其在本文中个别地叙述一般并入说明书中。除非本文中另外指明或上下文另外明显矛盾，否则本文所描述的所有方法都可以按照任何适合的次序执行。本文中关于某些实施方案所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如“例如”)的使用仅仅意图更好地阐明本发明且不对另外要求的本发明的范围造成限制。不应将说明书中的措辞看作是指示任何未要求的要素对实施本发明来说是不可或缺的。本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应看作是限制。每个组成员可以个别，或与组的其它成员或本文中发现的其它要素呈任何组合来提及和要求。出于便利和/或专利性，组的一个和/或多个成员可以包括在组中和/或从其中删除。当任何此类包括或删除发生时，说明书在本文中视为含有改变的组，因此满足随附权利要求书中使用的所有马库什组(markushgroup)的书面描述。本文中描述了本发明的优选的实施方案，包括本发明者已知进行本发明的最佳方式。本领域技术人员在阅读上述描述后将显而易见那些优选的实施方案的变体。预期熟练技工可以视情况采用此类变体，且可以按不同于本文中具体描述的方式，实践本发明。因此，本发明的许多实施方案包括如适用法律所允许，随附本文的权利要求书中叙述的主题物质的所有修改和同等物。此外，除非本文中另外指明或上下文另外清楚地矛盾，否则本发明涵盖其所有可能的变体中以上描述的要素的任何组合。此外，在整个本说明书中已经大量参考专利和印刷出版物。上面引用的参考和印刷出版物每一者以引用的方式整体个别地并入本文中。最后，应了解本文公开的本发明的实施方案说明本发明的原理。可以采用的其它修改可以在本发明的范围内。因此，举例来说而非限制，可以根据本文中的传授利用本发明的替代配置。因此，本发明的实施方案不限于明确展示和描述的实施方案。本发明还涉及以下实施方案：1.一种产生单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)的方法，其包括：通过在活化培养基中培育来活化卵母细胞；通过在后活化培养基中培育所述活化的卵母细胞产生单性生殖体；通过在培养基中培育所述单性生殖体形成胚泡；以及从所述胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中所述icm细胞能够进一步培养为pn-hpsc细胞系。2.如实施方案1所述的方法，其中所述活化培养基包含钙离子载体。3.如实施方案2所述的方法，其中所述钙离子载体包括伊屋诺霉素、a23187、白僵菌毒素、x-537a和/或燕麦曲菌素。4.如实施方案1所述的方法，其中所述后活化培养基包含6-dmap、嘌呤霉素、乙醇、放线菌酮(chx)、曲古霉素a(tsa)和/或细胞分裂抑素b(cb)。5.如实施方案1所述的方法，其中所述后活化培养基包含不阻止第二极体排出的化合物。6.如实施方案1所述的方法，其中所述卵母细胞包括中期ii(mii)期卵母细胞。7.如实施方案1所述的方法，其中所述卵母细胞包括中期i(mi)期卵母细胞。8.如实施方案1所述的方法，其中所述卵母细胞包括单原核卵母细胞。9.如实施方案1所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系是杂合的。10.如实施方案1所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系是纯合的。11.如实施方案1所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系包含具有与至少1％的群体免疫相容的人白细胞抗原(hla)单倍体。12.如实施方案11所述的方法，其中所述hla单倍体包括hla-a、hla-b和hla-dr。13.如实施方案1所述的方法，其包括注射精子因子至所述卵母细胞。14.如实施方案1所述的方法，其中所述卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。15.一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)，其包括：从单性生殖体衍生的胚泡的内细胞团(icm)细胞分离的多潜能细胞。16.如实施方案15所述的方法，其中所述单性生殖体衍生的胚泡包含通过在活化培养基中培育卵母细胞所产生的单性生殖体。17.如实施方案16所述的方法，其中所述活化培养基包含钙离子载体。18.如实施方案17所述的方法，其中所述钙离子载体包括伊屋诺霉素、a23187、白僵菌毒素、x-537a和/或燕麦曲菌素。19.如实施方案16所述的方法，其中所述单性生殖体衍生的胚泡包含通过在后活化培养基中培育活化的卵母细胞所产生的单性生殖体。20.如实施方案19所述的方法，其中所述后活化培养基包含6-dmap、嘌呤霉素、乙醇、放线菌酮(chx)、曲古霉素a(tsa)和/或细胞分裂抑素b(cb)。21.如实施方案15所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系是杂合的。22.如实施方案15所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系是纯合的。23.如实施方案15所述的方法，其中所述pn-hpsc细胞系包含具有与至少1％的群体免疫相容的人白细胞抗原(hla)单倍体的多潜能细胞。24.如实施方案15所述的方法，其中所述多潜能细胞表达来自由以下组成的组的一种或多种标记物：阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、ssea-3、肿瘤排斥抗原1-81(tra-1-81)、tra-1-60、八聚体结合转录因子-4(oct-4)、性别决定区y-box-2(sox-2)、nanog、锌指蛋白-42(rex-1/zfp-42)、leftya、畸胎癌衍生生长因子(tdgf)和端粒重复序列结合因子(terf-1)。25.如实施方案15所述的方法，其中所述多潜能细胞能够分化成衍生自内胚层、中胚层和外胚层的细胞。26.如实施方案15所述的方法，其包括注射精子因子至所述卵母细胞。27.如实施方案15所述的方法，其中所述卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。28.一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hpsc)的库，其包含一个或多个如实施方案15所述的pn-hpsc细胞系。29.一种产生核转移人多潜能干细胞系(nt-hpsc)的方法，其包括：去除卵母细胞的核；通过添加至少一个供体细胞的至少一个核，产生核转移(nt)卵母细胞；通过在活化培养基中培育来活化所述nt卵母细胞；从所述活化的nt卵母细胞产生胚泡；以及从所述胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中所述icm细胞能够进一步培养为nt-hpsc细胞系。30.如实施方案29所述的方法，其中添加至少一个供体细胞的所述至少一个核包含直接注射。31.如实施方案29所述的方法，其中添加至少一个供体细胞的所述至少一个核包含体细胞融合。32.如实施方案31所述的方法，其中体细胞融合包括使仙台病毒、其蛋白质或提取物接触所述至少一个供体细胞。33.如实施方案29所述的方法，其中所述至少一个供体细胞包括体细胞或生殖细胞。34.如实施方案29所述的方法，其中所述方法是在缺乏紫外光下进行。35.如实施方案29所述的方法，其包括注射精子因子至所述卵母细胞。36.如实施方案29所述的方法，其中所述卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。37.一种nt-hpsc细胞系，其通过如实施方案29所述的方法产生。38.一种核转移方法，其包括：通过添加至少一个供体细胞的至少一个核至卵母细胞，产生核转移(nt)卵母细胞；以及去除所述卵母细胞的主体核。39.如实施方案38所述的方法，其中所述方法包括：通过在活化培养基中培育来活化所述nt卵母细胞；从所述活化的nt卵母细胞产生胚泡；以及从所述胚泡分离内细胞团(icm)细胞，其中所述icm细胞能够进一步培养为nt-hpsc细胞系。40.如实施方案39所述的方法，其包括注射精子因子至所述卵母细胞。41.如实施方案39所述的方法，其中所述卵母细胞是在carm1和/或esrrb存在下培育。当前第1页12