本发明涉及一种生物
技术领域：
，具体涉及纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物。
背景技术：
：乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量约67000。1909年，beurer和reich第一次报道了人尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用。另具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子(mdf)产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。乌司他丁多样的生物功能与其独特的分子结构相关，乌司他丁主要由3个功能域构成，包括o连接糖基化区域(alal-lys21)、n端kunitz型结构域i(lys22-arg77)和具有胰蛋白酶抑制活性的c端kunitz型结构域ii(thr78leul43)。两个kunitz型结构域具有一定的同源性，每个结构域中都含有6个保守的半胱氨酸，通过形成3对二硫键维持一定的空间构型。乌司他丁的酶抑制活性主要存在于主体蛋白骨架中的kunitz型结构域。专利cn100528898c公开了高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，其中乌司他丁粗品经过阴离子交换柱、金属螯合柱、亲和层析柱等多重柱层析制备得到。专利cn100425286c公开了纯化的乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，同样经过阴离子交换柱、金属螯合柱、疏水柱吸附、凝胶柱层析等多种柱层析制备得到。上述专利中纯化方法经过多次柱层析，工艺过程复杂，产品收率低，生产周期长，不易放大生产。cn107827976a公开了一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，仅仅通过一步疏水柱实现纯化，并且纯度达到了99.90％以上，比活力至少为5100u/mg，但是其疏水柱采用尿素进行保藏而实现重复利用，再次使用大大影响了乌司他丁纯品的收率。技术实现要素：基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种乌司他丁及其制备方法与应用，该乌司他丁中杂质含量少，通过改变粗品制备方法和改进纯化工艺，进一步控制乌司他丁分子量范围，显著提高了药物活性。本发明提供一种乌司他丁，其浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.09，人尿激肽原酶的含量不超过0.00025pnau，重金属含量不超过0.8μg/ml，细菌内毒素含量不超过3.0eu。进一步地，所述乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.08，人尿激肽原酶的含量不超过0.0002pnau，重金属含量不超过0.5μg/ml，细菌内毒素含量不超过2.5eu。进一步地，所述乌司他丁采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为37,000-43,000da或采用高效液相色谱法测定的分子量为62,000-72,000da。本发明进一步提供一种上述乌司他丁的制备方法，包括以下步骤：(1)尿液中加入亚硝酸盐，调节ph，搅拌，硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加水溶解，调节ph，加入聚乙二醇，过滤，沉淀物干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，透析，干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过凝胶柱层析，蒸馏水洗脱，收集组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入阳离子交换层析柱上样，用盐酸洗脱，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。进一步地，所述步骤(1)中尿液与亚硝酸盐的重量比为1吨：13-16kg。更进一步地，所述步骤(1)中调节ph至4.0-6.0。更进一步地，所述亚硝酸盐选自亚硝酸铵、亚硝酸钠中的一种。更进一步地，所述亚硝酸盐为亚硝酸铵。亚硝酸盐中的亚硝酸根离子可以与尿液中的尿素反应生成氮气、二氧化碳气体，有利于尿液中尿素的处理。进一步地，所述步骤(1)中硫酸铵溶液浓度为8-12％。硫酸铵溶液的加入促使尿液中的乌司他丁蛋白类物质发生可逆性变性而沉淀下来。进一步地，所述步骤(2)中滤饼加1-3倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入8-12倍聚乙二醇，搅拌20-40min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥。进一步地，所述步骤(3)中沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换3-5次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品。进一步地，所述步骤(4)中凝胶柱层析填料为葡聚糖凝胶g-75，洗脱速度为0.4-0.6ml/min。进一步地，所述步骤(5)中阳离子交换柱为732型阳离子交换树脂。进一步地，所述步骤(5)中盐酸浓度为1.5-3mol/l。本发明还提供了含有上述乌司他丁或上述制备方法制备得到的乌司他丁的组合物。进一步地，所述组合物包括乌司他丁和甘露醇。更进一步地，所述组合物制备方法为：甘露醇注射用水溶解，加入乌司他丁混合后调节ph6-7，滤膜过滤，即得。本发明还提供了上述乌司他丁上述制备方法制备得到的乌司他丁在制备蛋白酶抑制剂药物中的应用。本发明的有益效果：(1)本发明采用亚硝酸盐、硫酸铵、聚乙二醇、调节ph等方法对尿液进行预处理，其中亚硝酸盐中的亚硝酸离子和尿液中尿素反应，生成氮气、二氧化碳气体，有利于尿液中尿素的处理，大大提高了预处理后乌司他丁的纯度，提高后续柱层析的效率；同时在过柱前采用透析的方法先进行初步的纯化，避免过多的杂质影响柱层析的效率。若仍有少量过量的亚硝酸根离子，也可在透析的过程中被去除。透析液中的亚硝酸根离子通过加入氧化剂即可完全去除，避免环境污染。(2)本发明采用凝胶柱层析和阳离子交换柱层析结合的方法，对杂质进行更有效的去除，不仅提高了药物纯度，还提高了产物收率和药物活性。具体实施方式实施例1乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入14.7kg亚硝酸铵，调节ph至5.0，搅拌50min，用浓度为10％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加2倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入10倍聚乙二醇，搅拌30min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换4次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入732型阳离子交换层析柱上样，用2mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.05人尿激肽原酶的含量0.0001pnau重金属＜0.5μg/ml细菌内毒素＜2.5eusds-page分子量40,276dahplc分子量67,116da实施例2乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入13kg亚硝酸铵，调节ph至6.0，搅拌60min，用浓度为12％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加1倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入8倍聚乙二醇，搅拌20min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换3次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.4ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入732型阳离子交换层析柱上样，用1.5mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.07人尿激肽原酶的含量0.0002pnau重金属＜0.5μg/ml细菌内毒素＜2.5eusds-page分子量39,984dahplc分子量68,453da实施例3乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入16kg亚硝酸铵，调节ph至4.0，搅拌50min，用浓度为8％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加3倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入12倍聚乙二醇，搅拌40min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换5次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.6ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入732型阳离子交换层析柱上样，用3mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.07人尿激肽原酶的含量0.00015pnau重金属＜0.5μg/ml细菌内毒素＜2.5eusds-page分子量41,349dahplc分子量66,841da对比例1采用甲壳素代替亚硝酸盐制备得到的乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入500g甲壳素，搅拌50min，用浓度为10％的硫酸铵溶液进行洗脱，抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加2倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入10倍聚乙二醇，搅拌30min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换4次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入732型阳离子交换层析柱上样，用2mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.1人尿激肽原酶的含量0.0005pnau重金属＜1.0μg/ml细菌内毒素＜3.125eusds-page分子量40,338dahplc分子量67,273da对比例2不进行透析制备得到的乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入14.7kg亚硝酸铵，调节ph至5.0，搅拌50min，用浓度为10％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加2倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入10倍聚乙二醇，搅拌30min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥，得乌司他丁粗品；(3)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(4)步骤(3)样品加水溶解，加入732型阳离子交换层析柱上样，用2mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：对比例3采用阴离子交换柱制备得到乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入14.7kg亚硝酸铵，调节ph至5.0，搅拌50min，用浓度为10％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加2倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入10倍聚乙二醇，搅拌30min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换4次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过葡聚糖凝胶g-75，蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min，收集洗脱组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入阴离子交换层析柱qaesephadexa-25上样，用含1mol/lnacl和0.3mol/l的磷酸盐缓冲液洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品。其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.08人尿激肽原酶的含量0.0001pnau重金属＜0.5μg/ml细菌内毒素＜2.5eusds-page分子量42,459dahplc分子量68,971da对比例4不使用凝胶柱层析制备得到乌司他丁及其制备方法(1)1吨尿液中加入14.7kg亚硝酸铵，调节ph至5.0，搅拌50min，用浓度为10％的硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加2倍水溶解，调节ph5.0-6.0，加入10倍聚乙二醇，搅拌30min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，4℃透析，期间更换4次水，冷冻干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，加入0.3gedta-na/升，用分子量为3万的超滤膜超滤；(5)步骤(4)样品加入阳离子交换层析柱上样，用2mol/l盐酸洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液；其中，步骤(3)中透析采用透析袋md40(6000-8000)，压平宽度40mm，直径25.5mm。取乌司他丁纯品1亿单位，称取30g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节ph6-7，再添加注射用水至2000ml，滤膜无菌过滤，分装于西林瓶中，冻干即得乌司他丁药物组合物。得到的乌司他丁纯品稀释至每毫升5万单位进项理化检测：重金属检测：按照中国药典2015版第四部0821重金属检查法第二法进行检测。分子量hplc法：(1)液相条件：多孔硅胶排阻色谱柱；检测波长280nm；调节流速使得牛血清白蛋白的保留时间约为36分钟。(2)流动相制备：取16.33克磷酸二氢钾和124.15克乙二醇溶解并稀释至1000ml，必要时用磷酸调节ph至4.0。(3)样品制备：取乌司他丁，用流动相稀释制成每1ml中约含6500单位的溶液，作为样品溶液。(4)参照品溶液：用流动相溶解适量的γ球蛋白(分子量160,000)，牛血清白蛋白(分子量67,000)，肌血球蛋白(分子量17,000)并制成1mg/ml的混合溶液。(5)测定：各取样品溶液以及参照品溶液50ul进行高效液相色谱实验，以参照品分子量的对数值为纵坐标，以保留时间为横坐标制备标准曲线。根据参照品标准曲线求得样品的分子量。其余参照中国药典2015版第一增补本212页-213页乌司他丁及乌司他丁溶液项下检测项目进行检测，结果如下：检查项目检查结果颜色a4050.05人尿激肽原酶的含量0.0001pnau重金属＜0.5μg/ml细菌内毒素＜2.5eusds-page分子量37,865dahplc分子量63,581da实施例4不同乌司他丁比较按照药典方法测定乌司他丁比活，同时比较乌司他丁制备方法的收率及其纯度。上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。当前第1页12