一种调控辣椒青果紫色基因标记的开发与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控辣椒青果紫色基因标记的开发与应用。

背景技术：

花青素(anthocyanins)是一类重要的水溶次生代谢物，广泛的存在于自然界中，主要分布于作物的花和果实当中，但在作物的叶、茎和种子中也都普遍存在。辣椒(capsicumannuuml.)是世界上重要的农艺作物，是维生素、类胡萝卜素和黄酮类化合物的良好来源。辣椒果实中的叶绿素和类胡萝卜素使其呈现绿色、黄色、橙色及红色等颜色果实。在栽培辣椒种质资源中，存在几个紫果基因型，可能是一个花青素的重要来源。然而，紫色的色素沉着只出现在未成熟的果实中。

提高辣椒的抗逆性及其果实营养品质一直是辣椒育种的重要目标。花青素作为一种重要的抗氧化性物质，不仅可以延长辣椒果实的耐储运性，提高其对病害的抵抗能力，同时还可提高辣椒果实的营养品质；在营养器官中，花青素则可提高辣椒对环境胁迫的抵抗能力。

利用同源克隆及表达分析，在辣椒中存在多个与花青素合成相关的基因，位于不同的染色体，这些基因在不同组织中，不同程度的影响辣椒中花青素的含量。2005年，yelenaborovsky等通过番茄est标签对an2基因同源克隆获得辣椒a基因，该基因编码r2r3myb型转录因子，为调控花青素合成过程的调控型基因，位于辣椒10号染色体，并获得一个与a基因完全共分离的标记(f:5’ggagtnaggaaaggtncatgg3’；r:5’gtcatctttgtctaatgtgtttgtg3’)，但未应用在花青素含量或紫色性状的鉴定及筛选中。

分子标记辅助育种作为当前育种工作的重要辅助手段，其关键就是开发出高效的分子标记。与目标性状紧密连锁并且稳定、检测方便快捷的分子标记直接对基因型进行选择,能极大的提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期。因此，开发高效的分子标记对于品种改良及新品种选育具有重要意义。

技术实现要素：

为了鉴定辣椒青果期的颜色，本发明一个目的是提供检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质的用途。

辣椒青果为辣椒青果成熟期。

本发明提供的检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定辣椒青果颜色中的应用；

或检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定辣椒青果颜色产品中的应用；

所述snp位点为辣椒基因组第10号染色体的第193360134位。

本发明还提供了检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在鉴定或筛选青果颜色为紫色的辣椒中的应用；

或，检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在鉴定或筛选青果颜色为绿色的辣椒中的应用；

或，检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在制备鉴定或筛选青果颜色为紫色的辣椒产品中的应用；

或，检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在制备鉴定或筛选青果颜色为绿色的辣椒产品中的应用；

或，检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在鉴定或筛选青果颜色为紫色辣椒的紫果基因或基因型中的应用；

或，检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质在制备鉴定或筛选青果颜色为紫色辣椒的紫果基因或基因型产品中的应用；

所述snp位点为辣椒基因组第10号染色体的第193360134位。

上述应用中，所述辣椒青果的颜色为紫色或绿色。

上述应用中，所述snp-78-708位点的基因型为gg或aa或ga。

上述应用中，所述检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质包括引物对和限制性内切酶sfcⅰ；

所述引物对由引物f和引物r组成；

所述引物f为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；

所述引物r为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的单链dna分子；

b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子。

上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链dna分子的衍生物为将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述序列表中序列2所示的单链dna分子的衍生物为将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的dna分子。

本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定辣椒青果颜色的产品。

本发明提供的产品，其为上述检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型的物质。

本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定辣椒青果颜色的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型为gg或aa或ga，根据基因型判断所述待测辣椒青果颜色；

若所述snp-78-708位点的基因型为gg，则待测辣椒青果颜色为或候选为绿色；

若所述snp-78-708位点的基因型为aa，则待测辣椒青果颜色为或候选为紫色；

若所述snp-78-708位点的基因型为ga，则待测辣椒青果颜色为或候选为紫色。

上述方法中，所述检测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型为gg或aa或ga为如下a)或b)：

a)直接测序；

b)用权利要求5中的所述引物对所述待测辣椒基因组dna进行pcr扩增，再用sfcⅰ酶切扩增产物，检测酶切产物：

若酶切产物仅含有183bp片段，则待测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型为aa；

若酶切产物为183bp和232bp片段，则待测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型为ga；

若酶切产物仅含有232bp片段，则待测辣椒基因组的snp-78-708位点的基因型为gg。

本发明第4个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定辣椒青果颜色的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对所述待测辣椒基因组dna进行pcr扩增，再用sfcⅰ酶切扩增产物，检测酶切产物：

若酶切产物仅含有183bp片段，则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物为183bp和232bp片段，则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物仅含有232bp片段，则待测辣椒青果的颜色为或候选为绿色。

本发明的实验证明，本发明在10号染色体a基因下游约37.8.3mb处发现分子标记，并根据其设计了dcaps标记caps-78-708，可以检测辣椒青果的颜色，为筛选紫果基因型提供基础。

附图说明

图1为分子标记caps78-708在亲本及f1代单株中扩增结果。

图2为40份已知基因型材料对分子标记caps-78-708的验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、分子标记caps-78-708的获得

本试验母本：紫贵人(18c2458)，青果紫色(为先正达公司育成的品种“紫贵人”自交纯化的自交系，房换香，彩色甜椒日光温室栽培技术要点[j].乡村科技2013(4):20-20)；父本：cm334(18c3375)，青果绿色(cm334辣椒高代自交系，徐小万等，辣椒疫病抗性资源‘cm334’的抗性遗传分析[j].植物保护2011(05)32-33)；通过杂交获得f1，然后自交获得f2分离群体18c2459，639株f2代群体中青果紫色、青果绿色植株分别为458株和181株，经卡方检验，遗传分离符合孟德尔遗传分离比例，辣椒青果紫色性状为单基因显性遗传。

1、辣椒青果颜色检测

f2分离群体18c2459于2018年4月5号定植于中国农业大学上庄实验站温室大棚内，在青果时期调查果实颜色。639株f2代群体中青果紫色、青果绿色植株分别为458株和181株。

2、辣椒dna提取

f2分离群体植株长至5叶一心时期，取0.5g左右叶片，采用改良的ctab法提取植株总dna。微量分光光度计测定样品dna浓度和纯度，再用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，冷冻备用。

3、分子标记筛选与辣椒青果紫色基因定位

调控辣椒青果基因初定位所用的分子标记来源于开发的辣椒全基因组ssr标记。精细定位所用到的ssr、caps分子标记亦为本实验室开发，所有引物由上海捷瑞生物公司合成。通过对639株f2群体多态性引物的统计，将候选基因定位到辣椒10号染色体ssr18213、ssr18228之间，两标记之间遗传距离为0.8cm，物理距离约为110.5kb。候选区间内存在3个orfs，通过3个orfs基因功能注释及表达分析，确定候选基因。

4、分子标记开发

克隆亲本候选基因序列发现，基因cds区第708个碱基存在差异，在708bp位置上青果紫色与青果绿色亲本的碱基分别为g、a，该位点为snp位点，该snp位点命名为snp-78-708，该位点为辣椒基因组第10号染色体的第193360134位，该snp位点的基因型为gg、ga或aa。

根据该碱基的差异开发了一个dcaps标记caps-78-708(表1)。

表1为caps-78-708引物序列

dcaps标记caps-78-708的扩增产物用sfcⅰ酶切，得到232bp和183bp这2种片段。

若酶切产物仅含有183bp片段，则该snp位点的基因型为aa；

若酶切产物为183bp和232bp片段，则该snp位点的基因型为ga；

若酶切产物仅含有232bp片段，则该snp位点的基因型为gg；

5、检测

用dcaps标记caps-78-708对f1及其亲本进行pcr扩增，pcr扩增产物用sfcⅰ酶切后，检测酶切产物。

丙烯酰胺检测结果如图1所示，a,青果紫色亲本；b,青果绿色亲本；c,f1代单株；发现该caps-78-708标记在两亲本及f2代单株间具有稳定的多态性，在亲本间差异明显，在f1基因组dna扩增产物为183bp的片段。

用dcaps标记caps-78-708对639株f2分离群体18c2459进行pcr扩增，扩增产物用sfcⅰ酶切后，进行丙烯酰胺检测。结果表明：分子标记caps-78-708在f2分离群体的458株青果紫色单株的扩增产物含有大小为232bp和183bp的片段，在f2分离群体的181株青果绿色单株的扩增产物只含有大小为232bp的片段。与田间颜色调查表型能一致，说明该分子标记与紫色青果基因共分离，为一个基因标记。

因此，可以用dcaps标记caps-78-708引物和sfcⅰ酶鉴定待测辣椒青果的颜色，具体如下：

用dcaps标记caps-78-708引物对待测辣椒进行扩增，扩增产物用sfcⅰ酶切后，检测酶切产物：

若酶切产物仅含有183bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为aa；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物为183bp和232bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为ga；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物仅含有232bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为gg；则待测辣椒青果的颜色为或候选为绿色。

因此，也可以用caps-78-708标记对应的snp位点的基因型判断待测辣椒青果颜色，

若caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为aa；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为ga；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为gg；则待测辣椒青果的颜色为或候选为绿色。

实施例2、分子标记caps-78-708的应用

本发明利用40份已知青果颜色表型的辣椒自交系品种(表2)，对分子标记caps-78-708的适用性进行验证。所用自交系品种可从中国农业大学园艺学院蔬菜系茄科课题组获得。

17c604，紫晶1号高代自交系，江海坤等，设施栽培紫色辣椒品种“紫晶1号”的选育[j].安徽农学通报2017,23(17)50-51

17c613，冀育二号自交系，刘建兵等，辣椒新品种——冀育二号[j].蔬菜2004,(04)8-9

17c628，绿洲真辣自交系，孙志刚等，干鲜两用型辣椒新品种绿洲真辣[j].2003(7)57-58

17c630,扬椒2号自交系,祁建波等，早熟辣椒新品种扬椒2号的选育[j].长江蔬菜2011,(6)16-17

17c741，超越2010自交系，王玮玮等，辣椒新品种“超越2010”的选育[j].北方园艺2017,(3)222-224

17c743，江蔬2号自交系，王述彬等，辣椒杂交新品种——江蔬2号[j].江苏农业学报2002,(11)43-45

表2为40份已知青果颜色辣椒自交系品种

1、分子标记caps-78-708鉴定

利用分子标记caps-78-708对表2所示的供试材料进行pcr扩增，模板为上述供试材料的基因组dna，得到pcr扩增产物。

pcr反应体系(10μl)为：dna工作液1μl、10×buffer缓冲液(生工生物,b650060)5μl、dntps0.4μl、dna聚合酶(生工生物,b500010)0.2μl、正向引物和反向引物各0.5μl(10um/l；0.4um/l)，用2.4μlddh2o将总体积补齐至20μl。

pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

酶切体系：向上述pcr扩增产物中加sfcⅰ酶0.1μl(在体系中的终浓度为100u/ul),cutsmart(sfcⅰ酶缓冲液，neb(北京)，b7204s)1μl,之后37℃酶切1.5h。

酶切产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对酶切产物进行测序。

若酶切产物仅含有183bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为aa；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物为183bp和232bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为ga；则待测辣椒青果的颜色为或候选为紫色；

若酶切产物仅含有232bp片段，则caps-78-708标记对应的snp位点的基因型为gg；则待测辣椒青果的颜色为或候选为绿色。

结果如图2所示，a,青果紫色亲本18c2458；b,青果绿色亲本18c3375；c,40份纯合自交系材料；分子标记caps-78-708在鉴定40份辣椒自交系和品种的青果紫色性状中，特异性条带统计结果与40份材料青果颜色完全一致，正确率为100％，表明，该分子标记适用性较强，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒青果紫色性状进行快速鉴定筛选。

对比例：

现有的引物ssr18213f：acccacaattcattccactct

r：atgcctgtagcttggcgg

用上述引物对40份辣椒自交系进行pcr鉴定，若得到175bp,则待测辣椒青果的颜色为紫色，若得到196bp,则待测辣椒青果的颜色为绿色。

结果该引物在40份自交系材料中，特异性条带统计结果有4份材料与40份材料青果颜色结果不同，正确率为90％。

sequencelisting

<110>中国农业大学

<120>一种调控辣椒青果紫色基因标记的开发与应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

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