内耳畸形/不完全分隔III型耳蜗畸形致病基因POU3F4突变检测用试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形中应用的pou3f4基因突变c.255_297del43(p.glu86thrfs87*)分型检测试剂盒。
背景技术：
：遗传性非综合征耳聋的遗传方式分为五种：一、常染色体显性及不完全显性，占22％；二、常染色体隐性遗传，占77％；三、x-连锁遗传；四、y-连锁遗传；五、线粒体母系遗传。x染色体连锁引起的非综合征耳聋约占遗传性耳聋的1％-2％。目前，在x染色体上已确定的引起非综合征耳聋的基因有4个，分别是col4a6、prps1、pou3f4和smpx，其中x-连锁引起的非综合征耳聋中40％是由pou3f4基因引起的。pou3f4基因是首个发现的导致x-连锁非综合征型耳聋的基因，人类pou3f4基因位于xq21.1区域，仅有一个外显子，外显子区域全长1491bp，开放阅读框架全长1083bp，编码361个氨基酸。pou3f4基因是一种转录因子，属于pou结构域家族成员之一，该家族基因均含有一个pou区域。在pou区域由一个高度保守的看家区域(含60个氨基酸)和一个pou特异区(含76-78个氨基酸)组成。pou家族基因对于器官形成、细胞分化发挥着极其重要的作用，pou3f4基因与内耳的发育关系密切。minowa等在dfn3老鼠模型中发现老鼠中耳发育正常，但是听性脑干反应阈值增加；进一步研究发现其内耳螺旋韧带中的纤维细胞发生形态学改变，而内耳中其他组织细胞没有发生变化，故认为brn4基因(人类pou3f4基因的同源基因)突变导致纤维细胞功能异常，而纤维细胞在维持耳蜗内电位中发挥重要的作用。phippard等研究也证明brn4基因产物是内耳中胚层间充质的塑型关键因子，brn4基因突变会导致耳蜗、上半规管等结构发育异常。pou3f4基因突变会引起听力损失，其临床特征主要体现在听力学、颞骨影像学及镫骨手术中的发现三方面。pou3f4基因突变的患者通过颞骨轴位ct可能发现以下异常：①内听道异常扩大；②内听道底部与耳蜗或前庭有异常交通；③耳蜗畸形(扩大或形态异常)；④后半规管脚扩大。pou3f4基因突变的耳聋表型为传导性聋、混合性聋、感音神经性聋，尤其是镫骨底板固定，在手术时易导致外淋巴液从前庭窗涌出，发生“镫井喷”的现象。已有学者建议将“x-连锁遗传性聋伴有镫骨井喷”的影像表现型称为“不完全分隔iii型”即ip-iii，属于一类内耳畸形。目前已发现pou3f4基因多种类型的突变，其中超过80％的患者表现出上述的典型临床特征。根据文献报道，pou3f4基因已有74种突变被确定，包括41种错义/无义突变、11种小片段(<10bp)的缺失、3种小片段的插入，15种大片段(整个pou3f4基因)的缺失，1种大片段的插入，3种复杂的染色体重排。在具有特征性影像学表现患者中开展pou3f4基因的全序列检测，对于明确病因、进行准确的遗传咨询以及充分的外科手术术前准备都具有非常重要的指导意义。目前尚未见到关于pou3f4基因c.255_297del43(p.glu86thrfs87*)突变的报道，主要原因在于ip-iii病例数量极低。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形致病基因pou3f4突变检测用试剂盒。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种用于检测pou3f4基因c.255_297del43(p.glu86thrfs87*)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增dna片段的pcr反应试剂，所述pcr反应试剂包括pcr引物，该pcr引物扩增的目标片段包含人pou3f4基因(参考序列nm_000307.4)编码区第255-297位所对应的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取pcr扩增所需的模板dna的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对pcr扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述pcr引物选自引物对p1，引物对p1的序列为：pou3f4-f1：5’-taacccgtgctagcgtcttt-3’；pou3f4-r1：5’-cgagcgaacgagagagagag-3’。优选的，所述pcr引物选自引物对p2，引物对p2的序列为：pou3f4-f2：5’-acctcccgcaccgctatt-3’；pou3f4-r2：5’-cgagcgaacgagagagagag-3’。利用上述试剂盒检测pou3f4基因c.255_297del43(p.glu86thrfs87*)突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取dna；2)以步骤1)提取的dna为模板，以上述pcr引物进行pcr反应，得到pcr反应产物；从pcr反应产物中分离pcr反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人pou3f4基因(参考序列nm_000307.4)编码区第255-297位的碱基进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与所述参考序列进行比对，确定待测个体对应于人pou3f4基因(参考序列nm_000307.4)编码区第255-297位的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型cgaagacctgcaactgggtgcgatcatccatcaccgctcgcca/cgaagacctgcaactgggtgcgatcatccatcaccgctcgcca、突变杂合型cgaagacctgcaactgggtgcgatcatccatcaccgctcgcca/-或突变纯合型-/-。上述试剂盒在内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测待测样本(来自于患者的pou3f4基因片段)中对应于人pou3f4基因(参考序列nm_000307.4)编码区第255-297位是否存在c.255_297del43突变，从而判断该患者内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形发生的遗传性原因。其中，pou3f4基因发生的c.255_297del43突变为移码突变，导致pou3f4基因编码的第86位的氨基酸由谷氨酸变成苏氨酸，并在第87位提前形成终止密码子(p.glu86thrfs87*)。本发明的有益效果体现在：本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测pou3f4基因特定突变位点，通过检测来自患者的dna样本中是否存在pou3f4基因c.255_297del43突变，可以判断该患者的内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形发生原因，进而为临床诊断提供依据。本发明所提出的试剂盒在用于内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形的诊断时：1)本发明将为在内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查及新生儿pou3f4基因突变的普遍筛查，降低内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形患儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。附图说明图1为pou3f4基因编码区核苷酸与氨基酸的对照：缺失突变位于pou3f4基因第255-297位碱基，突变后的碱基序列使第86位的氨基酸由谷氨酸变成苏氨酸，并在第87位提前形成终止密码子。图2为pcr反应过程示意图：示出了反应温度和时间。图3a为患者pou3f4基因测序结果图：突变等位基因序列，箭头表示突变位点位置。图3b为正常对照pou3f4基因测序结果图：野生型等位基因序列。图4为扩增产物的电泳图谱：泳道1为marker，泳道2为扩增的目标序列(1305bp)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。pou3f4基因突变相关的内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形以x-连锁隐性遗传的方式传递。本发明应用候选基因筛查的方法对8例不完全分隔iii型耳蜗畸形患者进行筛查，在一例不完全分隔iii型耳蜗畸形患者中发现pou3f4基因存在c.255_297del43杂合突变，导致其耳蜗发育异常。目前报道的pou3f4基因突变有74种，尚无c.255_297del43突变的报道。参见图1，上述突变(c.255_297del43)使位于pou3f4基因编码区的第255-297位碱基发生缺失(野生型pou3f4基因的标准序列可以参考，nm_000307.4)，导致第86位的氨基酸由谷氨酸变成苏氨酸，并在第87位提前形成终止密码子(p.glu86thrfs87*)。检测上述突变(c.255_297del43)可采用pcr(聚合酶链反应)扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组dna；2)以该dna为模板，以针对pou3f4基因编码区第255-297位碱基附近设计的pcr引物进行pcr反应，得到pcr扩增产物；3)将得到的pcr扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与pou3f4正常基因的序列(参考序列nm_000307.4)进行比较，确定待测个体pou3f4基因是否存在c.255_297del43突变；4)根据以上结果判断待测个体是否为pou3f4基因突变c.255_297del43导致的内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形。在上述步骤2)中使用的pcr引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计原则：通常为15～30个碱基，gc含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。上述步骤2)所得到的pcr反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的pou3f4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。根据检测方法的不同，用于检测pou3f4基因c.255_297del43突变的试剂盒中，除了包括pcr反应试剂，还包括检测pcr扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。试剂盒容器内装有用以检测pou3f4基因c.255_297del43突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于pcr反应试剂，例如，可含有扩增引物、dntps、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液等。实例1通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，建立耳聋样本资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取3～5ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用试剂盒提取基因组dna，定量后入库，-20℃保存，每份dna样品均详细对应于登记的患者临床资料。应用在线引物设计软件primer3设计引物(包含pou3f4整个编码区)，以基因组dna为模板，pcr扩增目标片段。pcr扩增产物直接测序：测序引物与pcr扩增引物相同，正反向测序，应用abi公司3730dna测序仪。测序得到的序列与genbank中的序列(nm_000307.4)比较，确定pou3f4基因突变位点的基因型。具体如下：(一)待测血样提取与pou3f4基因编码区的pcr扩增1、待测对象血样dna的制备1.1研究对象对就诊于西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科门诊的具有特征性影像学表型的不完全分隔iii型耳蜗畸形患者按照下述方法进行pou3f4基因的筛查。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估、ct和mri。在签署知情同意书以后每人采集血样3～5ml(2013年2月)。1.2基因组dna提取1.2.1实验前准备及重要注意事项(1)所有离心操作均在室温下完成。(2)血样样品的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如southern杂交等，需要得到完整全长的基因组dna，将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组dna的降解程度较轻。1.2.2操作步骤1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清，注意不要吸取或损坏中间层的黄膜层。2)将全部血细胞转移至5ml离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4ml，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。3)6500g离心10min，弃去上清。4)加入3ml红细胞裂解液，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。6)配制dna提取液与蛋白酶k的混合液，混合比例为dna提取液:蛋白酶k＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀，按需配制，现配现用。7)向样品中加入配制好dna提取液与蛋白酶k的混合液1ml，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。9)向样品中加入2ml异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。10)取干净无菌的1.5ml离心管，做好标记，加入500μl预冷的75％乙醇。11)用干净无菌的1ml移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，注意不要倒掉白色絮状沉淀。11)再次加入500μl预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。13)加入380μldna溶解液，置于65℃水浴/金属浴中温育2h，同时进行振荡使dna充分溶解。14)分光光度计定量及检测纯度。15)-20℃保存dna。2、pou3f4基因编码区的pcr扩增2.1引物序列(使用primer3在线设计软件，参考序列nm_000307.4，序列合成后用于此检测，引物设计完成时间为2017年2月)上游引物pou3f4-f1：5’-taacccgtgctagcgtcttt-3’下游引物pou3f4-r1：5’-cgagcgaacgagagagagag-3’使用该引物进行pcr扩增所获得的片段大小为1305bp。2.2pcr反应体系的建立(表1)表1.pou3f4基因的pcr反应体系其中，pcr扩增使用擎科新业生物技术有限公司金牌mix(green)(含dnapolymerase、buffer、dntp等组分)。反应条件：pcr反应在bioradmycycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示：1)98℃预变性2分钟；2)98℃变性10秒，60℃(起始退火温度，后每个循环降低0.5℃)退火30秒，72℃延伸20秒，9个循环；3)再98℃变性10秒，56.5℃退火30秒，72℃延伸20秒，25个循环；4)反应结束后再72℃延伸1分钟，4℃保存。pcr产物电泳流程：1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40ml×tae中(500ml锥形瓶)。2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴eb(约10μl，10mg/ml)，摇匀。4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×tae，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入markerdl2000。7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，markerdl2000(takara)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。取5μldl2000和5μlpcr产物进行电泳。根据pcr产物电泳后的条带位置与dl2000条带位置的比较，判断pcr产物的大小，参见图4。(二)pou3f4基因编码区pcr扩增产物的纯化和定量pcr扩增产物的纯化(96孔板法)：1)pcr扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。2)4000rpm离心1min，加入500μl溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min。3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μl混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μl8道电动移液器向每孔移入500μl洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。6)弃废液，重复步骤5)。7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。9)2μl样品加6μl1.4x溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，markerdl2000取5μl，300v电泳11min。10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。dl2000的总浓度是300ng/5μl，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp，每条带的含量为50ng。根据pcr产物电泳后的灰度值与dl2000的灰度值的比较判断pcr纯化产物的含量。(三)纯化的pou3f4基因编码区pcr扩增产物的直接测序1、纯化的pcr扩增片段的纯度与用量要求dna纯度：od260/od280＝1.6～2.0。dna浓度：pcr产物10ng/μl。dna用量与pcr产物长度对应关系如表2所示：表2.dna用量pcr产物长度(bp)测序加入量(ng)100～2001～3200～5003～10500～10005～201000～200010～40>200040～1002、测序反应1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3)目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量如表3所示。表3.pou3f4基因pcr扩增产物的测序反应体系其中，bdt为美国应用生物系统公司(abi)生产的一种用于测序反应的荧光染料。4)样品放于bioradmycycle热循环仪上，所作反应的过程见表4。表4.pou3f4基因pcr扩增产物的测序反应过程5)反应完的样品要及时从pcr仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。3、测序反应物的纯化和测序1)向每孔中加入20μl80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；2)在每孔中加入30μl70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；3)重复步骤2)再两次；4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；5)加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上abi3730测序仪。测序结果如图3a、图3b所示。(四)检测耳聋相关基因pou3f4突变位点(c.255_297del43)试剂盒及其应用1、试剂盒的组成(1)扩增用引物：上游引物pou3f4-f1：5’-taacccgtgctagcgtcttt-3’下游引物pou3f4-r1：5’-cgagcgaacgagagagagag-3’(2)pcr扩增用taq酶5u/μl(3)10×缓冲液(含mgcl2)(4)dntp2.5mm(5)bdt(美国应用生物系统公司)2、使用方法主要包括如下步骤：1)pcr扩增利用软件primer3对pou3f4基因的编码区设计的pcr引物进行pcr反应，反应条件见图2。2)pcr产物纯化pcr产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。3)测序反应及验证以pcr引物作为测序引物进行测序反应，在bioradmycycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，产物上样于abi3730dna序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与ncbi网站检索到的pou3f4基因标准序列(nm_000307.4)比较，以确定突变是否存在。实例2扩增引物(设计完成时间2017年2月)如下，其他同实例1：上游引物pou3f4-f2：5’-acctcccgcaccgctatt-3’；下游引物pou3f4-r2：5’-cgagcgaacgagagagagag-3’。<110>中国人民解放军第四军医大学<120>内耳畸形/不完全分隔iii型耳蜗畸形致病基因pou3f4突变检测用试剂盒<160>4<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1taacccgtgctagcgtcttt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2cgagcgaacgagagagagag20<210>3<211>18<212>dna<213>人工合成<400>3acctcccgcaccgctatt18<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4cgagcgaacgagagagagag20当前第1页12