本申请属于病虫防治领域，具体涉及一种豌豆蚜海藻糖酶基因的rna干扰序列的制备方法及应用。
背景技术：
豌豆蚜(acyrthosiphonpisum)属同翅目(homoptera)蚜科(aphididae)，在世界各地广泛分布，是许多豆科作物及牧草的主要害虫之一。在我国西北苜蓿种植区，豌豆蚜每年可造成苜蓿生产10％～30％的经济损失。豌豆蚜危害植物时，以刺吸式口器吸取植物韧皮部汁液，从而影响植物的生长发育，开花结果等正常生命活动，危害严重时造成整株植物死亡。豌豆蚜可以作为植物病毒的传播者，可以传播苜蓿花叶病毒，豌豆耳突花叶病毒等25种病毒。由于豌豆蚜繁殖力强，发生代数多，生态适应性强等原因，对蚜虫的防治至关重要。由于化学杀虫剂的高频率和高浓度的等不合理使用，污染生态环境，危害人类和牲畜健康。为了探索新的防治方法对于减少农药污染，提高牧草产量与品质具有重要意义。
海藻糖作为昆虫血糖，几乎存在于昆虫的所有组织和器官中。主要分布在脂肪体、肠道、血液、卵巢甚至在腿部肌肉也有合成。海藻糖不仅作为能源和碳源，而且作为蛋白质和细胞膜的稳定器、作为敏感化合物或生长调节器和昆虫细胞壁的结构组成的前体物，对昆虫的生存与死亡起着决定性的重要作用。海藻糖对昆虫的生长发育和蜕皮变态过程发挥着重要作用，如昆虫迁飞、取食行为、免疫抗性、越冬和滞育等。海藻糖可以通过浓度的高低调节味觉感受器和中枢神经系统从而影响昆虫对食物的选择和取食行为。海藻糖酶对豌豆蚜体内海藻糖分解和几丁质合成中都有重要作用。海藻糖突变体造成昆虫体内海藻糖累积，提高死亡率和影响取食行为。抑制海藻糖酶的活性，显著抑制昆虫的生长，造成蜕皮困难和大幅度增加死亡率。过量海藻糖、葡萄糖影响几丁质代谢，显著增加昆虫畸形和死亡率，高海藻糖比低海藻糖的对昆虫影响大。可见，海藻糖酶在维持昆虫体内海藻糖平衡和几丁质合成中有重要作用，海藻糖酶的活性对昆虫的生长发育十分重要。
rnai是fireetal在1998年阐述双链rna(doublestrandrna，dsrna)能引发生物体同源序列mrna降解而最终导致特异性基因转录后沉默的效应，由于主要作用于转录之后，所以又称rnai为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，ptgs)。随后陆续在斑马鱼、果蝇、锥虫、拟南芥和大小鼠中也发现了rnai现象。rnai技术作为基因沉默的工具，已被广泛应用于基因功能研究、基因治疗和病毒防治等方面，也为农作物害虫防治提供了新的策略。rnai技术在害虫方面的运用还处于初级阶段，并且存在很多挑战，如如何进入昆虫体内和在昆虫体内快速降解等问题。随着rnai技术的成熟，rnai技术广泛应用于植物病虫害防治，以及保护经济昆虫等，2007年首次报道了高表达dsrna的农作物防治农业害虫。昆虫体内海藻糖酶也有两种形式可溶性海藻糖酶(tre1)和结合型藻糖酶(tre2)，海藻糖酶作为水解海藻糖和几丁质合成的起始酶，不仅影响几丁质合成而且与昆虫生长发育和繁殖都有着密切联系。在昆虫体内tre1基因较高表达与表皮和马氏管，tre2主要表达与脂肪体和中肠。沉默甜菜夜蛾tre基因表达，显著影响几丁质合成还影响昆虫的变态发育与飞行。tre在昆虫生长发育中起重要作用。利用rnai来验证其功能，有利于为今后海藻糖相关靶向药物和转dsrna基因植物提供很好理论依据。
技术实现要素：
本申请提供了一种豌豆蚜海藻糖酶基因的rna干扰序列的制备方法，该方法包括以下步骤：
①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(xm_003245847.3，由3大国际数据库ncbi提交的序列)选取rnai的靶标区域，并利用primer5.0设计靶标区域的pcr扩增引物：
正义链5’-3’ggcgtggtttgactgggata
反义链5’-3’caaccaaaacctgtctgcgg；
②、提取豌豆蚜的总rna并通过反转录过得cdna，然后用扩增引物对cdna中含有海藻糖酶基因进行pcr扩增，纯化产物获得目的基因；
③、对①中的特异性引物5’-端加上t7promoter序列：
tre-1：taatacgactcactatagggggcgtggtttgactgggata
tre-2：taatacgactcactatagggcaaccaaaacctgtctgcgg，用于扩增含t7promoter序列的双链目的dna，然后利用试剂盒合成双链rna。
进一步地，将上述制得的双链rna溶解到蚜虫人工饲料中饲喂豌豆蚜，获得rnai的豌豆蚜。
进一步地，上述步骤③中的试剂盒为transcriptaidt7highyieldtranscriptionkit试剂盒。
本发明还提供了通过上述制备方法制备得到的豌豆蚜海藻糖酶基因的rna干扰序列在防治豌豆蚜中的应用。
附图说明
图1带有t7promoter序列的dna片段；
其中：m，dnamarkerdl2000；1，pcr扩增的绿色荧光蛋白(gfp)基因片段；2，pcr扩增的gfp基因片段；3，pcr扩增的tre基因片段；4，pcr扩增的tre基因片段。
图2目的双链rna片段；
其中：m，riborulerrnaladder；1，合成的dsgfp片段；2，合成的dstre片段。
图3豌豆蚜tre基因沉默水平；
其中：red-24h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；red-48h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；green-24h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；green-48h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；dsgfp，为对照组；dstre，处理组；
图4豌豆蚜海藻糖酶活性影响；
其中：red-24h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；red-48h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；green-24h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；green-48h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；
图5rnai对豌豆蚜繁殖的影响；
其中：单头繁殖数，平均每雌产蚜数；
图6rnai对豌豆蚜表型的影响；
其中：对照，正常表型；蜕皮困难，蜕皮失败产生的致死表型；
图7取食行为的影响；
其中：red-dsgfp，红色型豌豆蚜对照组；red-dstre，红色型豌豆蚜处理组；green-dsgfp，绿色型豌豆蚜对照组；green-dstre，绿色型豌豆蚜处理组。
具体实施方式
本申请结合以下实施例用于进一步描述技术方案，但这些实施例并非限制本申请的范围。
实施例1：一种豌豆蚜海藻糖酶基因的rna干扰序列的制备及应用检测
实验步骤：
1dsrna设计合成
根据3大国际数据库ncbi提交的序列，海藻糖酶(xm_003245847.3)利用mega软件比对推断保守区域，利用软件primer5.0设计特异性扩增引物，用于扩增豌豆蚜海藻糖合成酶和海藻糖酶保守区域基因。将扩增产物送往西安擎科测序，比对基因测序结果，引物序列如下：正义链5’-3’ggcgtggtttgactgggata
反义链5’-3’caaccaaaacctgtctgcgg
2.饲喂dsrna对两种色型豌豆蚜死亡率，基因沉默水平，生命表参数，取食行为及海藻糖酶活性的影响
将合成的dsrna(416bp)用超微量紫外分光光度计(quawellq5000,quawell,usa)测定其浓度，用蚜虫人工饲料稀释至400ng/μl饲喂豌豆蚜，对照为溶解dsgfp的人工饲料。将发育一致的3天若蚜饥饿12h后放入饲养小室中，每个饲养小室饲养15头若蚜，重复3次。双开口短玻管，直径2.5cm，高度3cm，一段覆盖一层parafilm膜，滴加75μl人工饲料，再覆盖第二层膜，形成饲料囊。用parafilm膜封住短玻管另一段并用昆虫针插小孔无数，让其取食4天，每隔2天更换一次饲料。然后挑选无翅豌豆蚜转接到新鲜的蚕豆叶片饲养，观察其生长发育情况。转接到蚕豆片后，分别在24h和48h取样，测定基因沉默效果，海藻糖酶活。
2.1rnai对豌豆蚜海藻糖酶基因沉默效果
分别对转移到蚕豆叶片24h和48h的豌豆蚜海藻糖酶基因表达量的测定，结果表明，dstre有效降低了海藻糖基因的表达量如图3。在红色型中转移后24小时沉默效果达到80％，在48小时后沉默效果达到50％；在绿色型中转移24和48小时后沉默效果都达到70％以上。由此可见dstre有效沉默了豌豆蚜海藻糖基因的表达。
2.2rnai对豌豆蚜海藻糖酶活性的影响
分别对转移到蚕豆叶片24h和48h的豌豆蚜海藻糖酶酶原，测定蛋白含量和60min内酶反应消耗底物的物质的量，并计算tre酶比活。显著性检验结果如图4所示。rnai有效降低了豌豆蚜海藻糖酶活性。
2.3rnai对豌豆蚜生命表参数、繁殖和表型的影响
将取食人工饲料4天的豌豆蚜转接到蚕豆叶片进行单头饲养，每3天更换一次叶片，每隔1天统计蚜虫生长发育情况，每组30头蚜虫重复三次。蚜虫开始产蚜后，每1天移除若虫并统计产蚜数量。计算豌豆蚜种群净增值率(r0＝∑lxmx)、平均世代周期(t＝∑xlxmx/∑lxmx)、种群内禀增长率(rm＝lnr0/t)、周限增长率(λ＝exp(rm)和相对生长率。结果表名rnai豌豆蚜海藻糖酶后，在红色型中减小了净生殖率、平均世代历期、内禀增长率、周限增长率和相对生长率，并且净生殖率从37.70减小到28.59达到显著差异(表1)；在绿色型中显著减小了净生殖率、内禀增长率、周限增长率和相对生长率，平均世代历期也减小但是没有达到显著差异水平，尤其在净生殖率从33.11较小到22.49(表2)。在繁殖能力的观察中，发现rnai豌豆蚜海藻糖酶基因有效减少了繁殖能力，平均每雌生殖数减少10头(图5)。rnai海藻糖酶基因出现致死表型(蜕皮困难)如图6。海藻糖酶是几丁质合成途径的起始酶，对几丁质的合成起调节作用。rna干扰豌豆蚜海藻糖酶基因减少新表皮生成过程中几丁质的含量，影响昆虫旧表皮褪去，旧表皮束缚在虫体上造成死亡。
表1.红色型豌豆蚜生命参数
表2.绿色型豌豆蚜生命表参数
表1和2的数据都是平均值±标准误(mean±sem)，不同的小写字母表示显著差异，差异水平在p＝0.05。
2.4rnai对豌豆蚜取食行为的影响
取食行为的检测，采用dc-epggiga-8d，8通道昆虫刺探电位图谱记录仪，将不采取任何麻醉措施的豌豆蚜用水溶性银胶将金丝(直径18um，长度7cm)的一段直接连接到豌豆蚜的前胸背板上，另一端与放大器相连。将连接好金丝的试虫轻轻放到蚕豆叶片背面，epg植物电极直接插在蚕豆根茎的土壤中。整个记录系统放置于法拉第金属屏蔽罩内，以防止外源声波干扰。受试豌豆蚜饥饿处理1h后，开始epg记录，放大器的放大倍数为50×，在昆虫刺探过程中对每个通道单独进行增益调整，最好使其稳定在4v电压处。每头豌豆蚜的测定时间为8h，每一试验组取有效数据(n≥15)进行统计。考虑到tre沉默会影响豌豆蚜取食行为，因此我们分析了30个epg参数。结果表明(表3、表4和图7)，rnai豌豆蚜海藻糖酶基因增加了豌豆蚜在c波的取食时间，减少了豌豆蚜e2和f波的取食时间，表明豌豆蚜增加了在表皮和细胞间隙之间的刺探活动，减少了在韧皮部取食汁液的时间，降低了豌豆蚜的危害水平。
表3红色型豌豆蚜刺吸参数
表4绿色型豌豆蚜刺吸参数
注：表3和4的数据都是平均值±标准误(mean±sem)，不同的小写字母表示显著差异，差异水平在p＝0.05。