一种油分相关基因分子标记Indel6及其应用的制作方法

本发明属于分子标记
技术领域：
，具体涉及一种油分相关基因分子标记indel6及其应用。
背景技术：
：大豆是我国重要的粮食作物和油料作物。但目前对外依存度已高达85％以上。因此，发掘大豆自身的遗传潜力，通过分子育种等技术手段培育高油大豆新品种是解决上述问题的有效途径。尽管大豆油分相关的研究也已取得很多进展，但在不同油分基因型的筛选上仍存在着一些困难，主要是因为油分含量必需以大豆籽粒样品进行测定，而籽粒样品具有季节性，而且油分含量在籽粒样品保存不当时会发生降解等变化，所以对大群体测定时不仅费时费力，还存在较大的误差。为了加快高油大豆育种进程，十分关键的问题是大豆种质含油量高低的准确鉴定，育种学家通常通过田间收获后，在实验室利用索氏抽提等常规的化学测定方法来鉴定大豆种质的粗脂肪含量，然而，这些方法在对大的群体进行选择时，尤其对于含油量这样数量性状具有一定的局限性。例如，数量性状受环境的影响很大，一两次的鉴定结果难以准确可靠，多年多点鉴定又费时费力，还必需有保存得当的种子才能测定。因此，准确、快速、简单地对大豆油分含量进行鉴定有利于提高油分相关育种进程。近年来，随着分子标记技术的发展，许多的研究者利用与油分相关qtl连锁的标记对大豆种质进行辅助选择，这种方法在一定的程度上提高了选择的速度，且操作简单，但是这些标记都是大豆油分基因的连锁标记，因此准确性一般较低。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于油分相关基因分子标记及其鉴定引物对和应用，利用基因cds本身进行分子标记，与油分相关基因gmoleo1及其等位基因表现为共分离，可准确快速的鉴定大豆种质资源的油分品质，大大提高油分相关材料的选择效率和分型鉴定效率，加速油分相关分子标记辅助选择育种进程。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种油分相关性状的功能分子标记indel6，在大豆油分相关基因gmoleo1的cds起始位点atg下游6bp处存在14bp的缺失，所述缺失的14bp序列如seqidno.2所示；所述高油单倍型基因gmoleo1的cds序列如seqidno.1所示。本发明还提供了一种鉴定上述功能分子标记indel6的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明还提供了上述引物对在鉴定大豆油分相关性状中的应用。优选的，所述鉴定的pcr程序包括：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸3s，33个循环；72℃延伸1min，4℃保存。本发明还提供了一种鉴定大豆油分相关性状的功能分子标记试剂盒，包括上述引物对。本发明提供了一种油分相关性状的分子标记indel6，所述标记indel6为基因cds本身的标记，和油分相关基因gmoleo1及其等位基因表现为共分离，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。在本发明实施例中，利用这所述标记indel6进行大豆高油种质的分型鉴定，其准确率可以达到85％以上。利用本发明所述标记indel6进行分型和鉴定新的大豆高油材料，不仅可以进一步研究油分的分子和遗传机制，同时也可以拓宽油分育种的遗传背景，选育出高产、优质的高油大豆新品种，克服传统鉴定方法存在的时间限制，工作量大而且花费的周期长，利用本发明的标记可以简单快速的鉴定大豆材料的油分特性；同时，还可以在大豆植株生长的任何时期提取dna通过ssr标记判断其油分含量，为快速有效选育油分大豆品种提供了技术。附图说明图1为本发明实施例中15种材料的基因比对结果；图2为本发明实施例的电泳结果图。具体实施方式本发明提供了一种油分相关性状的功能分子标记indel6，在大豆油分相关基因gmoleo1的cds起始位点atg下游6bp处存在14bp的缺失，所述缺失的14bp序列如seqidno.2所示；所述高油单倍型基因gmoleo1的cds序列如seqidno.1所示。本发明所述分子标记indel6，在gmoleo1基因的cds转录起始位点atg下游6bp处存在等位基因，即与低油的材料相比，高油材料在indel6存在着14bp的缺失，所述缺失的cds序列如seqidno.2所示：tttgcatgcaagcc。本发明所述油分相关基因gmoleo1位于大豆第20号染色体上，所述油分相关基因gmoleo1为控制油分的主效基因，且所述基因编码膜蛋白-油体蛋白。本发明所述油分相关基因gmoleo1全长876bp，序列如seqidno.5所示，所述高油单倍型基因gmoleo1的cds序列长625bp。本发明还提供一种鉴定上述功能分子标记indel6的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明所述引物对基于所述分子标记基因indel6进行设计，其中indel6正向引物序列如seqidno.3所示：cttgagatcactacaacacacc；indel6反向引物序列如seqidno.4所示：gatagaagaacaacacaaaaac。在本发明中，利用所述分子标记引物对进行油分相关性状鉴定时，如电泳结果有157bp的单条谱带，则为不含标记indel6的大豆低油材料；如果有143bp单条谱带，则为含标记indel6的油分相关材料。本发明还提供了上述引物对在鉴定大豆油分相关性状中的应用。本发明所述应用，优选利用pcr进行分子标记，本发明对所述分子标记的方法并没有特殊限定，优选利用ssr。本发明在进行所述分子标记时，所述分子标记的体系优选为50μl体系，包括：goldenstart6superpcrmix(1.1×)45μl，10μmol/lprimer各2.0μl,100ng/μl模板dna1μl。本发明对所述模板dna的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述应用时的鉴定pcr程序包括：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸3s，33个循环；72℃延伸1min，4℃保存。本发明还提供了一种鉴定大豆油分相关性状的分子标记试剂盒，包括上述引物对。下面结合实施例对本发明提供的油分相关基因及其分子标记和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1(1)供试材料利用由国家大豆改良中心对外提供的15份油分含量不同的大豆核心种质，包括6份高油分种质，7份低油种质和2份中等油分含量种质，具体如表1所示：表1.15份不同油分含量大豆种质编号材料油分含量(％)油分含量1南农1138-217.52低/l2周豆2917.25低/l3苏协1号17.18低/l4中豆1416.91低/l5南农94-15617.83低/l6豫豆1616.79低/l7波高18.52中/m8春豆18.04中/m9商丘7317.19低/l10科丰1号20.25高/h11周豆9401019.95高/h12监利牛毛黄21.96高/h13磨石大豆22.12高/h14安邑小黑豆20.66高/h15西平褐面豆21.3高/h对上述15种大豆材料进行cds序列比对，比对结果如图1所示：南农1138-2、周豆29和苏协1号等序列中包含tttgcatgcaagcc，在科丰1号、周豆94010和监利牛毛黄等序列中不包含tttgcatgcaagcc。(2)indel6标记的获得根据gmoleo1基因cds位置的14bp缺失位点，设计一对indel标记引物，上游引物为5’-cttgagatcactacaacacacc-3’,下游引物为5’-gatagaagaacaacacaaaaac-3’。(3)dna的提取以苗期新鲜叶片为材料，采用ctab法提取dna，详细步骤如下：i取大豆嫩叶3～5g左右，在液氮中研成粉末，倒入保温的ctab提取缓冲液中，65℃水浴30～60min，其间轻摇3～5次；ii加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀，放在摇床上轻摇1h；iii经5000rpm离心15min，将上清夜转入一个新的离心管中；iv加入10ml冰冻的异丙醇，上下摇匀；v离心倒掉液体，加入1.5～3mlhs-te缓冲液，待完全溶解后，等体积氯仿：异戊醇再抽提一次；vi经8000rpm离心5min，吸取上清液转到另一个新的离心管中；vii用三倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下静置20min以沉淀dna；viii10000rpm离心5min，弃去上清夜；ix70％乙醇清洗两次，真空干燥机上吹干；x将dna溶于te中，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。置于-20℃待用。(4)pcr反应及电泳检测pcr扩增反应体系为：extaq×masterpcrmix5μl，primer(3pmol/l)2.0μl,模板dna(约15ng/μl)2μl,灭菌双蒸水1μl；反应总量10μl.pcr反应在mjresearchptc-200热循环仪上进行，反应程序包括：94℃预变性5min，每个循环95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸7min，12℃保存。反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。(5)电泳结果分析利用indel6对15份供试材料进行基因型检测，结果如图2所示，其中图2中泳道编号与表1材料编号对应，cds缺失的油分材料能扩增出144bp的dna条带，而cds不缺失的低油材料能扩增出157bp的dna条带，在供试材料中2份中等油分含量材料中扩出157bp的dna条带。本发明提供了一种油分相关基因的分子标记indel6及其应用，所述indel6标记可用于分型和鉴定新的大豆高油材料，并且用于对前期通过常规化学方法筛选的不同油分含量的大豆种质进行验证，正确率达到了85％以上。较之常规的筛选方法省时，省力，节省成本，并具有很高的可靠性，为以后大豆高油基因型种质鉴定和大豆品种育种分子标记辅助选择提供了新的材料和技术。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>河南农业大学<120>一种油分相关基因分子标记indel6及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>625<212>dna<213>glycinemax<400>1atgggtttgcatgaaaagcttgccaacacgtgccaaaccacctcctcaggtgttgccacc60caagcctccactcaccaatttctccatttataccctcattaccaccaccttaaaccctac120cacattaattactcactcttcactcaaaactcttgtctttcattttgataattcccacac180tatggctgagcttcactaccaacaacaacaccaataccctcaccgataccctaatgatcc240atacgaacaacaaactagctactccactcaggtcgtcaaggcggccaccgccgtcaccgc300gggcggctccctcttgatcctcgcctcgttgatccttgccggcaccatcatcgccctcac360catcgtcacaccaccgctcgtcatcttcagtccggttctcgtccccgcggtgatcaccgt420cgcgctgctgagcctggggttccttgcctccggcgggttcggtgtggcggcgatcacggt480gctggcgtggatctacaggtacgtcaccgggaagtacccacctggcgcggatcagttgga540cagcgcgcctcacaagatcatggacaaggcgcgtgagatcaaggactatggacagcagca600aatcagtggggtgcaggcttcttaa625<210>2<211>14<212>dna<213>glycinemax<400>2tttgcatgcaagcc14<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cttgagatcactacaacacacc22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gatagaagaacaacacaaaaac22<210>5<211>876<212>dna<213>glycinemax<400>5atgggttttgcatgcaagccttgcatgaaaagcttgccaacacgtgccaaaccacctcct60caggtgttgccacccaagcctccactcaccaatttctccatttataccctcattaccacc120accttaaaccctaccacattaattactcactcttcactcaaaactcttgtctttcatttt180gataattcccacactatggctgagcttcactaccaacaacaacaccaataccctcaccga240taccctaatgatccatacgaacaacaaactagctactccactcaggtcgtcaaggcggcc300accgccgtcaccgcgggcggctccctcttgatcctcgcctcgttgatccttgccggcacc360atcatcgccctcaccatcgtcacaccaccgctcgtcatcttcagtccggttctcgtcccc420gcggtgatcaccgtcgcgctgctgagcctggggttccttgcctccggcgggttcggtgtg480gcggcgatcacggtgctggcgtggatctacaggtacgtcaccgggaagtacccacctggc540gcggatcagttggacagcgcgcctcacaagatcatggacaaggcgcgtgagatcaaggac600tatggacagcagcaaatcagtggggtgcaggcttcttaatcgtgtgcacgcacgcacccg660atcaaatccatctcgtggatttctctctttgtctagttagttatatttacgatttatgaa720tgaatgaatgcaggaatgagcgttaaagttgaatttgaatctcctcttttctttgtattt780tcgtttattgtgggtgttcgatcatcatcacttgttgtagttgtaatgtcttaattttgt840gtgcatgctgcgactattcaaggacgatccatttgt876当前第1页12