一种牛结核病γ-干扰素ELISA检测用鸡尾酒刺激抗原的制作方法

本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及一种牛结核病γ-干扰素检测用鸡尾酒刺激抗原及其制备方法。

背景技术：

牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(oie)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起。因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为三类，细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法的样品采集需要屠宰牛，不适于活畜检疫。由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛的免疫学检测方法是结核菌素皮内变态反应和牛结核病γ-干扰素elisa检测技术。

牛结核菌素皮内变态反应是我国的法定检疫方法，但操作繁琐，耗时较长，难以满足牛结核病大量检疫的需求。近年来牛结核病γ-干扰素elisa检测技术的应用越来越广，现已被oie批准为皮内变态反应的试验的替代试验。

牛结核病γ-干扰素elisa检测技术的第一步是制备刺激上清。

其过程如下：

①采血，采集牛的血液(至少5ml)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养。

②加样，将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加3孔，每孔1.5ml抗凝血。

③加入刺激抗原，每头动物的3孔中，分别无菌加入100μl牛ppd、禽ppd作为刺激抗原，选用pbs作为阴性抗原对照。

④孵育，将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。

⑤收样，用移液器小心吸取约400μl的上层血浆，转入独立的1.5ml离心管中作为刺激上清。

牛结核病γ-干扰素elisa检测技术的第二步是使用elisa试剂盒检测已收获的刺激上清进行od值检测，对其结果判定的标准如下：牛ppd的od值－pbs的od值≥0.1且牛ppd的od值－禽ppd的od值≥0.1为阳性；牛ppd的od值－pbs的od值<0.1或牛ppd的od值－禽ppd的od值<0.1为阴性。

可见，目前牛结核病γ干扰素elisa试验中的刺激抗原主要是牛型ppd、禽型ppd。这些刺激抗原的不足之处主要有如下2点。

1、试验过程过于繁琐

在制备刺激上清的过程中，既要使用牛型ppd进行刺激，也要应用禽型ppd进行刺激，制备过程过于繁琐。刺激试验完毕后，尚需同时收集牛型ppd和禽型ppd刺激上清。同时，进行elisa试验时，也需同时检测牛型ppd刺激上清和禽型ppd刺激上清，并计算它们od值的差值，进而判定结果。因此，现有的同时应用牛型ppd和禽型ppd作为刺激抗原制备刺激上清的试验，增加了试验步骤，浪费了更多的时间和精力，使试验过程过于繁琐。

2、无法进行疫苗免疫株和野毒株自然感染的鉴别诊断

牛型ppd是由牛结核分枝杆菌培养滤液制成，内含多种混合蛋白，这些蛋白不仅存在于野毒株中，也存在于疫苗株中，因此疫苗免疫后，采集全血使用牛型ppd刺激，能够产生大量的γ-干扰素，在elisa检测中会呈阳性结果，这种阳性结果与野毒株自然感染的阳性结果是无法进行鉴别诊断的。因此，使用现有的牛型ppd刺激抗原无法进行疫苗免疫与自然感染鉴别的诊断。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型的鸡尾酒抗原，用作牛结核病γ干扰素elisa试验第一步的刺激抗原。该鸡尾酒刺激抗原可以替代现有的牛型、禽型ppd刺激抗原，简化检测的步骤，而且还可以用于区分待检测的牛是否经过疫苗免疫或发生了自然感染。

本发明所使用的鸡尾酒抗原，包含有esat6抗原、cfp10抗原、fixb抗原和rv3615c抗原，其中esat6抗原、cfp10抗原、fixb抗原和rv3615c抗原的质量比为2:2:1:1；

上述的鸡尾酒抗原用于制备牛结核病γ干扰素elisa检测用的刺激抗原,其中esat6抗原、cfp10抗原的浓度分别为20μg/ml；fixb抗原和rv3615c抗原的浓度为10μg/ml。

本发明的鸡尾酒抗原的优点如下：

1、本发明的组合抗原简化了检测过程

已有的方法在制备刺激上清的过程中，既要使用牛型ppd进行刺激，也要应用禽型ppd进行刺激来排除禽分枝杆菌等非特异性分枝杆菌引发的非特异性反应。本发明制备的鸡尾酒抗原无需同时使用牛型ppd和禽型ppd就可以排除非特异性分枝杆菌感染。由于简化了刺激试验的步骤和过程，相关的elisa试验步骤也得到简化，从而使原有的牛结核病γ-干扰素elisa试验得到了很大程度的简化。

2、可以进行疫苗免疫和野毒株自然感染鉴别诊断

本发明的组合抗原作为新型的刺激抗原，在使用卡介苗免疫动物后，采集全血使用进行刺激，刺激上清中并不能够产生的γ-干扰素；而对于野毒株感染的牛，使用本发明组合抗原的刺激上清中就会产生大量的γ-干扰素，从而对疫苗免疫和野毒株自然感染进行鉴别诊断。此前，由于没有相关的鉴别诊断刺激抗原，在临床上严禁对牛结核病进行免疫，本发明的应用，将使临床上进行牛结核病免疫成为可能，这是本发明在牛结核病防控领域取得的重大突破。

附图说明

图1：不同抗原的鉴别诊断效果图

图2：不同抗原组合的鉴别诊断效果图

图3：不同鸡尾酒抗原的鉴别诊断效果图

图4：esat6浓度曲线图；

图5：cfp10曲线图；

图6：rv3615c浓度曲线图；

图7：fixb浓度曲线图；

图8：鸡尾酒抗原和传统抗原的鉴别诊断比较图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：鸡尾酒抗原的筛选过程

1、抗原组分的筛选

将esat6、cfp10、mpb83、fixb、rv3615c稀释为终浓度1μg/ml的浓度，使用自然感染牛、卡介苗免疫牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等4组动物进行试验，最终进行γ-干扰素elisa检测，在5种抗原检测免疫动物和禽分枝杆菌感染动物的平均od值几乎一致的情况下，esat6、cfp10检测自然感染动物平均od值大于mpb83、fixb、rv3615c的平均od值。即esat6、cfp10作为鉴别诊断抗原时，其自然感染动物和疫苗免疫动物、非特异性感染动物的od差值远大于其他抗原，表明esat6、cfp10的鉴别诊断效果优于其他组分(图1)。

将esat6、cfp10作为必备组分，与将其他各组分进行组合，形成esat6/cfp10(简写为ec)、esat6/cfp10/mpb83(简写为ecm)、esat6/cfp10/fixb(简写为ecf)、esat6/cfp10/rv3615c(简写为ecr)等4种组合，同时以ppdb/ppda(简写为ba)作用传统方法对照。结果表明esat6/cfp10/rv3615c组合优于其他组合(图2)。

将esat6/cfp10/rv3615c(简写为ecr)与其他分子进行组合，形成esat6/cfp10/rv3615c(ecr)、esat6/cfp10/rv3615c/mpb83(ecrm)、esat6/cfp10/rv3615c/fixb(ecrf)、esat6/cfp10/rv3615c/mpb83/fixb(ecrmf)等4种组合，检测结果表明ecrm、ecrf、ecrmf均优于ecr，但ecrm、ecrf、ecrmf之间无明显区别(图3)。但这三种组合中，以ecrf的生产流程最为简单，因此确定以esat6/cfp10/rv3615c/fixb组合作为鸡尾酒抗原组分。

2、4种抗原的浓度筛选

将esat6、cfp10、rv3615c、fixb4种抗原蛋白分别做梯度稀释为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml,冻干后重新稀释，分别作为刺激抗原，使用自然感染牛、卡介苗免疫牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等4组动物进行试验。

结果表明卡介苗免疫牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物在所有抗原浓度上升时，其od值无明显变化。而自然感染牛，4种蛋白作为抗原时，其od值均会随着蛋白的浓度上升而上升，即自然感染牛和其他3组牛之间的od差值会随着抗原浓度上升而加大，但esat6、cfp10在浓度达到20μg/ml后，其od值不再明显上升(见图4-5)，rv3615c和fixb在浓度达到10μg/ml后，其od值不再明显上升(图6、图7)。证明esat6、cfp10的最佳使用浓度20μg/ml，rv3615c和fixb的最佳使用浓度为10μg/ml

实施例3：根据确定的抗原组合和浓度制备本发明的鸡尾酒抗原

一、制备方法

(一)试验材料

1.主要仪器

恒温振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司

脱色摇床：qilinbeier公司

稳流稳压电泳仪：北京君意仪器厂公司

超声波细胞粉碎机：宁波新芝科技生物有限公司

trans-sd通用型半干转印电泳槽：北京凯元信瑞仪器有限公司

制冰机：上海安亭科学仪器厂

紫外可见分光光度计：shimadzμ

微量核酸蛋白测定仪：nanodrop

冷冻干燥仪：东芝

2.主要试剂

冰醋酸、异丙醇、吐温-20、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、考马斯亮蓝、苯甲基磺酰氟、异丙基硫代半乳糖苷、丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、过硫酸铵、聚乙二醇20000、pbs缓冲液等购自国药集团化学试剂有限公司，十二烷基硫酸钠、氯化钠、氯化钾、考马斯亮蓝、甲基磺酰氟(pmsf)、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)等购自上海生工生物工程有限公司

3、主要试剂配置

(1)考马斯亮蓝r-250染色液：称取1g考马斯亮蓝r-250，量取250ml异丙醇，置于1l烧杯中搅拌均匀，加入100ml冰醋酸，定容至1l，滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。

(2)考马斯亮蓝r-250脱色液：量取冰醋酸100ml，无水乙醇50ml，加去离子水混匀后，定容至1l，室温保存。

(3)30％acrylamide(丙烯酰胺)：称取丙烯酰胺290g，甲叉-丙烯酰胺10g于1l烧杯中，加入约600ml去离子水，搅拌溶解后定容至1l，0.45μm滤膜过滤去杂质，置于棕色瓶中4℃保存。

(4)10％过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加入10ml去离子水后搅拌溶解，4℃保存2周左右。

(5)10％sds溶液：称取10gsds于100ml烧杯中，加75ml去离子水于68℃加热溶解，加浓盐酸调ph值至7.2，定容至100ml，室温保存。

(6)1mtris-hcl(ph6.8)：称取121.1gtris于1l烧杯中，加入800ml去离子水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph值为6.8，定容至1l。121℃高压灭菌后，室温保存。

(7)1.5mtris-hcl(ph8.8)：称取181.7gtris于1l烧杯中，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调ph值为8.8，定容至1l。121℃高压灭菌后，室温保存。

(8)5×sds-page电泳缓冲液：称取tris15.1g，glycine94g，sds5g于1l烧杯中，加入去离子水搅拌溶解后定容至1l，室温保存。

(9)1miptg溶液：称取2.38giptg于10ml离心管中，加入适量去离子，充分溶解后定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装1ml/份，于-20℃贮存。

(10)转膜缓冲液(transferbμffer)：称取tris5.81g，甘氨酸2.93g，sds0.375g，加去离子水溶解后，再加入200ml甲醇充分溶解，定容至1l，室温储存备用。

(二)制备方法

1.esat6、cfp10和rv3615c蛋白的诱导表达

(1)将构建的含有pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10、和pet-28a-rv3615c菌株依次接种于含卡那霉素(kan+)抗性的lb液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h。

(2)分别取过夜培养的pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10、和pet-28a-rv3615c菌液各50μl，以1:1000比例依次接种于50ml新鲜的lb液体培养基中(kan+40μg/ml)，37℃，200r/min培养2-3h至od600nm约0.6时，各取1ml菌液作为未诱导对照，4℃保存备用。

(3)加入iptg至终浓度为1mmol/l，37℃，200r/min，pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10和pet-28a-rv3615c诱导培养，诱导4h后收集菌体。

(4)分别取出1ml菌液，12000r/min离心2min，弃去上清，收集菌体。

3.2.2：esat6、cfp10和rv3615c蛋白的纯化

2.蛋白纯化

(1)细菌收集：取诱导表达后菌液，4℃以8000r/min离心10min，弃去培养基，用适量pbs缓冲液重悬菌体沉淀，4℃以8000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀。

(2)菌体裂解：用15ml结合/洗涤缓冲液(20mmtris-hcl，500mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)重悬菌体，冰上超声破碎30min，5s/次，间隔5s，400w。4℃以8000r/min离心10min，保留上清。

(3)柱子平衡：平衡柱子至室内温度，取下底帽，移去顶帽，让多余液体流下，夹紧柱子使其竖直放置，柱子顶部朝上。用两倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗涤柱子，流速控制在0.5-1ml/min。

(4)洗柱：将步骤(2)中获得的上清加到树脂上方(上样前用0.45μm滤膜过滤)，收集流过的液体。如果需要，将流过的液体重新加入柱子，以使蛋白最大能力结合在柱子上。

(5)洗柱：用两倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(若为包涵体，用两倍柱体积的含8mol/l尿素洗涤缓冲液)洗柱子，收集流过的液体。

(6)目的蛋白洗脱：用两倍柱体积的洗脱缓冲液(若为包涵体，用两倍柱体积的含8mol/l尿素洗脱缓冲液)从树脂上洗脱带his标签的蛋白。重复步骤两次，在不同的管中收集各组分。洗脱下来的蛋白质用sds-page分析。

(7)树脂清洗：如果观察到背压增加或树脂显著的污染，用15倍柱体积的0.5mnaoh清洗滤筒。允许的接触时间为30分钟，并相应地调整流率。用10体积的1xpbs重新平衡，柱子储存在20-30％乙醇或10-100mm的naoh中。

(8)透析：透析袋用透析袋处理液煮沸两次，每次10min，再用超纯水煮沸两次，每次10min，将纯化后的蛋白溶液装进透析袋，两端用夹子夹好，依次在含有4m、3m、2m和不含尿素的复性液中复性，保持4℃低温环境，每4-6h更换一次溶液直至透析袋两侧浓度一致。

(9)测定浓度：使用微量核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度。

2、esat6、cfp10和rv3615c蛋白的sds-page电泳

对洗脱的目的蛋白进行12％sds-page电泳。

(1)洗板装板：制胶前先用纯水将玻璃板洗净，再用milliq级水冲洗数次。然后将玻璃板固定在支架上，向两板的凹槽间注满超纯水，检查是否漏液，空出水分，烘干待用。

(2)制胶：配制12％分离胶和5％浓缩胶，见表1，依次加入各组分后混合均匀。

表1：sds-page分离胶和浓缩胶配置体系

(3)灌胶：各组分混匀后，向制胶板内缓慢注入分离胶，避免产生气泡，约8ml左右，加无水乙醇液封，37℃孵育30min至完全凝固。倒掉无水乙醇，滤纸吸干残留液体。注满浓缩胶，插上梳子，37℃孵育30min至完全凝固。

(4)样品处理：向蛋白样品中加入等体积的2×proteinloadingbμffer，混匀后，100℃煮沸5min。

(5)加样电泳：15μl样品上样，80v恒压电泳30min浓缩蛋白样品，然后120v电泳1h。

(6)染色脱色：将电泳后的凝胶放入含适量考马斯亮蓝染色液的染色皿中，50r/min染色至少1h。染色完成后，于脱色摇床中，50r/min，考马斯亮蓝脱色液反复脱色至凝胶完全透明。

(7)电泳结果表明纯化蛋白的电泳条带应单一、清晰。

将纯化的esat6、cfp10、fixb和rv3615c蛋白，使用聚乙二醇20000浓缩至0.6mg/ml的浓度，按照2:2:1:1的比例混合制成本发明的鸡尾酒抗原，分装成5ml/瓶，冻干后于4℃保存。

实施例4：鸡尾酒抗原的现场应用

本发明制备的鸡尾酒抗原用作牛结核病γ-干扰素elisa检测的刺激抗原来使用，具体步骤如下：

第一步制备刺激抗原：

将纯化的esat6、cfp10、fixb和rv3615c蛋白，使用聚乙二醇20000分贝浓缩至0.6mg/ml的浓度，按照2:2:1:1的比例混合制成本发明的鸡尾酒抗原，分装成5ml/瓶，冻干后于4℃保存。使用时将其作10倍稀释，esat6、cfp10、fixb和rv3615c的终浓度分别为20μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、10μg/ml。同时以ppdb/ppda作为传统抗原对照。

第二步制备刺激上清：

①采血：

采集牛的血液(至少3ml)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养。

使用已知的牛分枝杆菌感染牛、卡介苗免疫牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等4组动物进行试验。

②加样：将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加2孔，每孔1.5ml抗凝血。

③加入刺激抗原：每头动物的3孔中，分别无菌加入100μl鸡尾酒抗原和100μlpbs溶液作为阴性抗原对照。

④孵育：将含有血液和刺激抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。

⑤收样：

用移液器小心吸取约400μl的上层血浆，转入独立的1.5ml离心管中获得刺激上清。

第三步：使用elisa试剂盒检测已收获的刺激上清。

①所有试剂(除酶标抗体)恢复至室温22℃±3℃，在稀释板上每孔加入50μl样品稀释液，在稀释板上相应孔中每孔加入50μl样品和对照，震荡1分钟。

②盖上盖板，室温孵育(22℃±5℃)60±5分钟，弃去板内液体，洗涤6次，拍干。

③每孔加入100μl新鲜配制的酶标抗体。

④盖上盖板，室温孵育(22℃±5℃)60±5分钟，弃去板内液体，洗涤6次，拍干。

⑤每孔加入100μl新鲜配制的底物溶液

⑥盖上盖板，避光，室温孵育(22℃±5℃)30±5分钟。

⑦每孔加入50μl终止液。

⑧终止后5分钟内读出od450nm，以620—-650nm作为参照波长，然后用od值计算结果。

结果判定：鸡尾酒的od值－pbs的od值≥0.1为阳性；鸡尾酒的od值－pbs的od值<0.1为阴性。阳性结果表明牛只为牛结核病自然感染阳性，阴性结果表明牛只为牛结核病阴性。结果表明本发明制备的鸡尾酒抗原可以有效进行卡介苗疫苗免疫和野毒自然感染鉴别诊断，并可以有效排除禽分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染(图8)。