一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原的制作方法

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原。

背景技术：

牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(oie)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起，因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染病牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为如下三类：细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法在样品采集过程中需要屠宰牛，不适于活畜检疫的要求。免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛是结核菌素皮内变态反应检测方法。

牛结核病结核菌素皮内变态反应的方法有两种，一种是单一皮内变态反应试验，包括如下的步骤：

①术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。

②注射：不论大小牛只，在剪毛处皮内注射牛型ppd0.1ml。

③观察反应：皮内注射后经72h(±4-6h)判定结果。

④结果判定：注射部位皮厚差大于等于4mm为阳性，皮厚差大于2mm同时小于4mm为可疑；可疑动物应至少间隔42天后再进行检测，结果为阳性或可疑的，判为阳性。

而比较变态反应与单一皮内变态反应方法类似，包括如下的步骤：

①术前处理：将牛只编号后在颈两侧中部上三分之一处(或颈单侧相距15cm以上的两点)剪毛，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。

②注射：不论大小牛只，分别在两个剪毛点处皮内注射牛型ppd0.1ml和禽型ppd0.1ml。

③观察反应：皮内注射后经72h(±4-6h)判定结果。

④结果判定，阳性：牛型ppd反应阳性，牛型皮厚比禽型皮厚厚4mm以上；可疑：牛型ppd阳性或可疑，牛型皮厚与禽型皮厚之差在1-4mm；阴性：牛型ppd反应阴性；或虽为牛型ppd阳性或可疑，但与禽型皮厚相等或小于禽型皮厚。

比较变态反应由于额外使用了禽型ppd进行检测的，可以显著增加变态反应的特异性，可以更为精确的诊断牛结核病。但是由于比较变态反应过于繁琐，几乎很难推广应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原，可用于诊断牛结核病。本发明的鸡尾酒抗原可以区分禽型ppd、牛型ppd，并能排除禽型分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染的影响。

本发明所使用的鸡尾酒抗原，包含有esat6抗原、cfp10抗原、fixb抗原和hspx抗原；其中，esat6抗原、cfp10抗原、fixb抗原和hsp抗原的质量比为2:2:1.5:1.5。

本发明所提供的鸡尾酒抗原可用于制备牛结核病变态反应的检测抗原。

本发明再一个方面提供一种牛结核病变态反应的检测抗原，是由上述的鸡尾酒抗原制备的；

一种牛结核病变态反应的检测抗原，其中esat6抗原、cfp10抗原、fixb抗原和hspx抗原的终浓度分别为40μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、30μg/ml。

本发明再一个方面提供一种牛结核病变态反应诊断试剂，其中包含有上述的鸡尾酒抗原和/或检测抗原。

本发明的鸡尾酒抗原可以替代比较变态反应使用的牛型ppd和禽型ppd，用本鸡尾酒抗原进行单一皮内变态反应，即可以达到比较变态反应的效果，将两点剪毛、测定皮厚、注射、72小时候再次返场测定皮厚、计算皮厚差等系列操作，简化成了单点操作且无需计算，整个检测过程更为简便。同时，可以排除禽型分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染，更为特异的诊断牛结核病。

附图说明

图1：不同抗原的鉴别诊断效果图

图2：不同抗原组合的鉴别诊断效果图

图3：esat6浓度曲线图；

图4：cfp10曲线图；

图5：fixb浓度曲线图；

图6：hspx浓度曲线图；

图7：蛋白电泳图；

图8：新型单点皮试和比较皮试的耗时比较图；

图9：新型单点皮试与传统方法排除禽型分枝杆菌感染的比较图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：变态反应用鸡尾酒抗原的筛选

1、抗原组分的筛选

将esat6、cfp10混合作为一种抗原称之为ec，其浓度按照单组分浓度标识。将ec、fixb、mpb83和hspx四种抗原稀释为终浓度10μg/ml的浓度，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行变态反应皮肤试验。

在四种抗原检测禽分枝杆菌感染动物和健康牛的平均皮厚差值几乎一致的情况下，ec抗原检测自然感染动物的平均皮厚差大于mpb83、fixb、hspx抗原的平均皮厚差。即ec作为鉴别诊断抗原时，其自然感染动物和非特异性感染动物的皮厚差远大于其他抗原，表明ec的鉴别诊断效果优于其他组分(图1)。

将ec作为必备组分，与将其他各组分进行组合，形成ec/fixb(简写为ecf)、ec/mpb83(简写为ecm)、ec/hspx(简写为ech)等3种组合，同时以ppdb/ppda(简写为ba)作用传统方法对照。结果表明ecf和ech组合优于ecp组合。将ec同时与fixb和hspx组合，形成ec/fixb/hspx(简写为ecfh)，并与ecf和ech和ba比较。结果认为ecfh优于ecf和ech。因此确定以esat6/cfp10/fixb/hspx组合作为鸡尾酒抗原组分(图2)。

2、4种抗原的浓度筛选

将ec、fixb、hspx3种抗原蛋白分别做梯度稀释为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml,冻干后重新稀释，分别作为变态反应皮肤试验抗原，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行试验。

结果表明禽分枝杆菌感染牛和健康牛等2组动物在所有抗原浓度上升时，其od值无明显变化。而自然感染牛，4种蛋白作为抗原时，其皮厚差均会随着蛋白的浓度上升而上升，即自然感染牛和其他2组牛之间的皮厚差差值会随着抗原浓度上升而加大，但ec在浓度达到40μg/ml后，其皮厚差不再明显上升(见图3-4)，fixb和hspx在浓度达到30μg/ml后，其皮厚差不再明显上升(图5-6)，证明ec的最佳使用浓度40μg/ml，fixb和hspx的最佳使用浓度为30μg/ml

实施例2：根据确定的抗原组合和浓度制备本发明的鸡尾酒抗原

一、制备方法

(一)试验材料

1.主要仪器

恒温振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司

脱色摇床：qilinbeier公司

稳流稳压电泳仪：北京君意仪器厂公司

超声波细胞粉碎机：宁波新芝科技生物有限公司

trans-sd通用型半干转印电泳槽：北京凯元信瑞仪器有限公司

制冰机：上海安亭科学仪器厂

紫外可见分光光度计：shimadzu

微量核酸蛋白测定仪：nanodrop

冷冻干燥仪：东芝

2.重组质粒

重组pet-28a-hspx、pet-28a-fixb、pet-28a-esat6和pet-28a-cfp10均为发明人构建。

3.主要试剂

冰醋酸、异丙醇、吐温-20、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、考马斯亮蓝、苯甲基磺酰氟、异丙基硫代半乳糖苷、丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、过硫酸铵、聚乙二醇20000、pbs缓冲液等购自国药集团化学试剂有限公司，十二烷基硫酸钠、氯化钠、氯化钾、考马斯亮蓝、甲基磺酰氟(pmsf)、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)等购自上海生工生物工程有限公司

4、主要试剂配置

(1)考马斯亮蓝r-250染色液：称取1g考马斯亮蓝r-250，量取250ml异丙醇，置于1l烧杯中搅拌均匀，加入100ml冰醋酸，定容至1l，滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。

(2)考马斯亮蓝r-250脱色液：量取冰醋酸100ml，无水乙醇50ml，加去离子水混匀后，定容至1l，室温保存。

(3)30％acrylamide(丙烯酰胺)：称取丙烯酰胺290g，甲叉-丙烯酰胺10g于1l烧杯中，加入约600ml去离子水，搅拌溶解后定容至1l，0.45μm滤膜过滤去杂质，置于棕色瓶中4℃保存。

(4)10％过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加入10ml去离子水后搅拌溶解，4℃保存2周左右。

(5)10％sds溶液：称取10gsds于100ml烧杯中，加75ml去离子水于68℃加热溶解，加浓盐酸调ph值至7.2，定容至100ml，室温保存。

(6)1mtris-hcl(ph6.8)：称取121.1gtris于1l烧杯中，加入800ml去离子水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph值为6.8，定容至1l。121℃高压灭菌后，室温保存。

(7)1.5mtris-hcl(ph8.8)：称取181.7gtris于1l烧杯中，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调ph值为8.8，定容至1l。121℃高压灭菌后，室温保存。

(8)5×sds-page电泳缓冲液：称取tris15.1g，glycine94g，sds5g于1l烧杯中，加入去离子水搅拌溶解后定容至1l，室温保存。

(9)1miptg溶液：称取2.38giptg于10ml离心管中，加入适量去离子，充分溶解后定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装1ml/份，于-20℃贮存。

(10)转膜缓冲液(transferbuffer)：称取tris5.81g，甘氨酸2.93g，sds0.375g，加去离子水溶解后，再加入200ml甲醇充分溶解，定容至1l，室温储存备用。

(二)制备方法

1.esat6、cfp10、fixb和hspx蛋白的诱导表达

(1)将构建的含有pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10、pet-28a-fixb和pet-28a-hspx菌株依次接种于含卡那霉素(kan+)抗性的lb液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h。

(2)分别取过夜培养的pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10、pet-28a-hspx和pet-28a-fixb菌液各50μl，以1:1000比例依次接种于50ml新鲜的lb液体培养基中(kan+40μg/ml)，37℃，200r/min培养2-3h至od600nm约0.6时，各取1ml菌液作为未诱导对照，4℃保存备用。

(3)加入iptg至终浓度为1mmol/l，37℃，200r/min，pet-28a-esat6、pet-28a-cfp10、pet-28a-fixb和pet-28a-hspx诱导培养，诱导4h后收集菌体。

(4)分别取出1ml菌液，12000r/min离心2min，弃去上清，收集菌体。

2.蛋白纯化

(1)细菌收集：取诱导表达后菌液，4℃以8000r/min离心10min，弃去培养基，用适量pbs缓冲液重悬菌体沉淀，4℃以8000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀。

(2)菌体裂解：用15ml结合/洗涤缓冲液(20mmtris-hcl，500mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)重悬菌体，冰上超声破碎30min，5s/次，间隔5s，400w。4℃以8000r/min离心10min，保留上清。

(3)柱子平衡：平衡柱子至室内温度，取下底帽，移去顶帽，让多余液体流下，夹紧柱子使其竖直放置，柱子顶部朝上。用两倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗涤柱子，流速控制在0.5-1ml/min。

(4)洗柱：将步骤(2)中获得的上清加到树脂上方(上样前用0.45μm滤膜过滤)，收集流过的液体。如果需要，将流过的液体重新加入柱子，以使蛋白最大能力结合在柱子上。

(5)洗柱：用两倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(若为包涵体，用两倍柱体积的含8mol/l尿素洗涤缓冲液)洗柱子，收集流过的液体。

(6)目的蛋白洗脱：用两倍柱体积的洗脱缓冲液(若为包涵体，用两倍柱体积的含8mol/l尿素洗脱缓冲液)从树脂上洗脱带his标签的蛋白。重复步骤两次，在不同的管中收集各组分。洗脱下来的蛋白质用sds-page分析。

(7)树脂清洗：如果观察到背压增加或树脂显著的污染，用15倍柱体积的0.5mnaoh清洗滤筒。允许的接触时间为30分钟，并相应地调整流率。用10体积的1xpbs重新平衡，柱子储存在20-30％乙醇或10-100mm的naoh中。

(8)透析：透析袋用透析袋处理液煮沸两次，每次10min，再用超纯水煮沸两次，每次10min，将纯化后的蛋白溶液装进透析袋，两端用夹子夹好，依次在含有4m、3m、2m和不含尿素的复性液中复性，保持4℃低温环境，每4-6h更换一次溶液直至透析袋两侧浓度一致。

(9)测定浓度：使用微量核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度。

3.esat6、cfp10、hspx和fixb蛋白的sds-page电泳

对洗脱的目的蛋白进行12％sds-page电泳。

(1)洗板装板：制胶前先用纯水将玻璃板洗净，再用milliq级水冲洗数次。然后将玻璃板固定在支架上，向两板的凹槽间注满超纯水，检查是否漏液，空出水分，烘干待用。

(2)制胶：配制12％分离胶和5％浓缩胶，见表1，依次加入各组分后混合均匀。

表1sds-page分离胶和浓缩胶配置体系

(3)灌胶：各组分混匀后，向制胶板内缓慢注入分离胶，避免产生气泡，约8ml左右，加无水乙醇液封，37℃孵育30min至完全凝固。倒掉无水乙醇，滤纸吸干残留液体。注满浓缩胶，插上梳子，37℃孵育30min至完全凝固。

(4)样品处理：向蛋白样品中加入等体积的2×proteinloadingbuffer，混匀后，100℃煮沸5min。

(5)加样电泳：15μl样品上样，80v恒压电泳30min浓缩蛋白样品，然后120v电泳1h。

(6)染色脱色：将电泳后的凝胶放入含适量考马斯亮蓝染色液的染色皿中，50r/min染色至少1h。染色完成后，于脱色摇床中，50r/min，考马斯亮蓝脱色液反复脱色至凝胶完全透明。

(7)纯化蛋白的电泳条带单一、清晰(图7)。

4.成品制备

将纯化的esat6、cfp10、fixb和hspx蛋白，使用聚乙二醇20000浓缩至0.7mg/ml的浓度，按照2:2:1.5:1.5的比例混合，分装成5ml/瓶，冻干后于4℃保存。

实施例3：变态反应用鸡尾酒抗原的应用

本发明制备的鸡尾酒抗原用作牛结核病变态反应用抗原，具体步骤如下：

1、制备抗原：

将纯化的esat6、cfp10、fixb和hspx蛋白，使用聚乙二醇20000分别浓缩至0.7mg/ml的浓度，按照2:2:1.5:1.5的比例混合制成本发明的鸡尾酒抗原，分装成1ml/瓶，冻干后于4℃保存。

2、变态反应试验

使用前取5mlpbs，加入至冻干好的鸡尾酒抗原中，混匀后使用，使esat6、cfp10、fixb和hspx的终浓度分别为40μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、30μg/ml。

按照如下的步骤进行变态反应试验：

①术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。

②注射：不论大小牛只，分别在颈侧皮内注射鸡尾酒抗原0.1ml。

③观察反应：皮内注射后经72h(±4-6h)判定结果。

④结果判定：注射部位皮厚差大于等于4mm为阳性，皮厚差大于2mm同时小于4mm为可疑，皮厚差小于2mm为阴性；可疑动物应至少间隔42天后再进行检测，结果为阳性或可疑的，判为阳性。

使用鸡尾酒抗原，进行单一皮内变态反应，(鸡尾酒抗原单点皮肤试验，简称为新型单点皮试)，即可达到同时使用牛型ppd和禽型ppd的比较变态反应(比较皮肤试验，简称为比较皮试)效果。对5头自然感染牛、5头禽分枝杆菌感染牛和5头健康牛，同时进行检测，结果新型单点皮试和比较皮试均有10头阳性，5头阴性，两者的符合率为100％。见表2。

表2：新型单点皮试和比较皮试的比较试验

新型单点皮试和传统牛结核病检疫方法即传统的牛结核病单纯颈部变态反应(简称为传统单点皮试)相比，可以鉴别禽型分枝杆菌感染，减少试验的非特异性干扰。对5头禽分枝杆菌感染牛进行牛结核病检测，传统单点皮试均为阳性结果，禽型分枝杆菌排除率为0％；而新型单点皮试均为阴性结果，禽型分枝杆菌排除率为100％(图8)。

新型单点皮试与比较皮试相比较，其剪毛、测量皮厚、注射、再次测量皮厚、计算等，均能节约约一半的时间(图9)。相应的，其工作量也减少一半，简化了试验流程，减少了试验操作。