人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及人源化幽门螺旋杆菌caga真核表达载体构建方法。
背景技术：
：幽门螺杆菌(helicobacterpylori,h.pylori)是一种螺旋状的革兰式阴性微需氧菌，感染全球一半的人口，是引起胃炎、消化性溃疡、胃癌的主要病因。在感染人群中，大多数人引起无症状性胃炎，大约有20—25％发展为慢性胃炎，10％发展为消化性溃疡，有1-3％发展为胃癌。胃癌的发生是多因素综合作用的结果，主要包括幽门螺旋杆菌感染、宿主遗传因素及环境因素。其中幽门螺旋杆菌感染是胃癌最重要的始发因素，已被世界卫生组织列为人类胃癌的ⅰ类致癌因子。细胞毒素相关基因a(cytotoxinassociatedgenea,caga)编码的蛋白，是目前所知的唯一被幽门螺旋杆菌注入胃上皮细胞并能模拟细胞内蛋白发挥作用的“癌蛋白”，caga基因编码的蛋白在细胞内被磷酸化后激活多种信号通路，参与胃癌的发生发展，但其致癌机制尚不完全清楚。为研究进一步研究caga基因对胃癌发生相关信号通路的影响，本发明人pcr扩增出幽门螺旋杆菌caga基因全长片段后构建克隆载体pmd18-t/caga，经限制性酶切处理后，将原核载体上的caga基因酶切后连接到pcdna3.1/zeo(-)真核表达载体上,构建真核表达载体pcdna3.1zeo(-)/caga。将该真核表达载体转染胃癌细胞株，实现了caga基因的真核表达，并检测到了caga基因或caga基因编码的蛋白对下游基因的调控作用。但上述技术方案存在以下问题：虽然将原核基因caga构建到真核表达载体并实现了该原核基因的真核表达，但原核caga基因在真核细胞中异源表达存在表达量较低并且表达水平不稳定，甚至在更换培养条件或胃癌细胞株时，经常出现基因不表达的情况，不能满足现阶段的进一步研究caga调控通路的要求。因为caga基因表达量过低或不表达，产生的相关蛋白量较少或无相关蛋白产生，不能够完全激活或不能激活所有caga基因效应蛋白、效应基因或下游通路，使得对caga基因引起胃癌的分子机制的深入研究受到了一定的限制。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种人源化幽门螺旋杆菌caga真核表达载体构建方法，该方法通过对幽门螺旋杆菌caga基因进行密码子优化实现了caga的人源化，利用人源化的caga构建真核表达载体，可使人源化caga基因在人胃癌细胞中高表达。为解决上述技术问题，本发明提出了一下技术方案：人源化幽门螺旋杆菌caga真核表达载体构建方法，包括：(1)密码子优化步骤：合成核苷酸序列为seqidno:1的人源化caga基因；(2)人源化caga真核表达载体构建步骤。在上述技术方案中，发明人对幽门螺旋杆菌caga基因(ncbisequenceid:kr154737)进行密码子优化，优化后的序列称为人源化caga。人源化caga与幽门螺旋杆菌caga基因序列比对结果见图2，人源化caga核苷酸序列见seqidno:1。该技术方案的技术原理为：除甲硫氨酸和色氨酸，其他的氨基酸都对应2-6个密码子。其中编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子，在不同的生物或者细胞中，同义密码子被使用的频率也具有很大的差别，存在密码子偏好性。发明人对照人类密码子的偏好性，通过对幽门螺旋杆菌caga基因的密码子进行优化处理。根据密码子偏好对幽门螺旋杆菌caga基因的核苷酸序列进行改造后，发明人发现caga基因在真核细胞中任然不能稳定和大量的表达。发明人在根据密码子偏好性进行的优化处理的基础上，对幽门螺旋杆菌caga基因的模板链的3’端进行了改造，在3’端增加了一段核苷酸序列(5’-gactacaaggacgacgatgacaag-3’)，该增加的核苷酸序列对人源化caga基因在真核细胞中的表达起到了促进作用。发明人研究发现，629-817位氨基酸之间的区域和855-1048位氨基酸之间的区域为幽门螺旋杆菌caga基因编码的蛋白的功能区域(内毒素功能，即致病功能)，而该蛋白的末端区域对蛋白内毒素功能的实现不起作用，所以对幽门螺旋杆菌caga基因3’末端的改造虽然会在caga编码的蛋白上增加几个氨基酸，但不会影响蛋白功能，增加的寡聚核苷酸对基因表达起到了调节作用。本技术方案达到的有益效果为：人源化caga基因可在真核细胞中大量并稳定的表达，克服了幽门螺旋杆菌caga在真核细胞中表达量小(甚至不表达)和表达不稳定的缺陷，为幽门螺旋杆菌致病机制和caga引起胃癌分子机制的研究创造了条件。进一步，在所述人源化caga基因的模板链的5’端设有nheⅰ限制性内切酶识别序列，在所述人源化caga基因的模板链的3’端设有xbaⅰ限制性内切酶识别序列。采用上述技术方案，在人源化caga基因中加入限制性酶切位点，可以通过酶切和连接等操作将人源化caga基因连接到各类载体中。人源化caga基因开放阅读框中不含有nheⅰ限制性酶切位点和xbaⅰ限制性酶切位点，从而保证了酶切操作不会把人源化caga基因的开放阅读框切断，保证了人源化caga基因的完整性。进一步，在所述人源化caga基因的模板链的5’端设有kozak序列，所述kozak序列位于nheⅰ限制性内切酶识别序列和人源化caga基因的起始密码子atg之间。采用上述技术方案，技术原理如下：kozak序列(kozakconsensussequence)，是根据kozak规则设计的序列，kozak规则是基因起始密码子atg的侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。kozak序列应用于真核表达载体的构建中，当基因被转录为mrna，核糖体能够识别mrna上的这段序列，并把它作为翻译起始位点，从而增强基因在真核表达系统中的翻译效率，从而增加该基因编码的蛋白表达量。如果不设有kozak序列，核糖体可能会和mrna上错误的位点结合，从而出现翻译错误或翻译遗漏的情况。进一步，所述kozak序列为5’-gccacc-3’。采用上述技术方案，在限制性酶切位点之后和起始密码子atg之前加入序列5’-gccacc-3’，满足kozak规则的要求，可以提高蛋白质翻译的正确率，从而提高基因的表达量。进一步，在所述密码子优化步骤中，通过聚合酶链式反应合成所述人源化caga基因。采用上述技术方案，通过聚合酶链式反应(pcr)可实现人源化caga基因体外合成。进一步，所述caga真核表达载体构建步骤为：在pcdna3.1(+)的nheⅰ位点和xbaⅰ位点之间，插入所述人源化caga基因，得人源化caga真核表达载体pcdna3.1(+)-caga。采用上述技术方案，pcdna3.1(+)是常见的真核表达载体之一，可在dh5α等大肠杆菌中克隆复制，也可在哺乳细胞中表达蛋白。pcdna3.1(+)中含有cmv启动子，该启动子可启动真核基因表达，具有较高的启动活性。利用pcdna3.1(+)连接人源化caga基因的核苷酸序列，构建源化caga真核表达载体，可实现caga基因编码的蛋白在真核细胞中的大量表达。在本步骤中得到的人源化caga真核表达载体为pcdna3.1(+)-caga。进一步，在所述人源化caga真核表达载体构建步骤之后还有转染步骤，所述转染步骤为：用所述人源化caga真核表达载体pcdna3.1(+)-caga转染宿主细胞。采用上述技术方案，pcdna3.1(+)-caga成功转染宿主细胞后可以实现该真核表达载体的克隆复制或者目的基因的表达。进一步，所述宿主细胞为人胃癌细胞。采用上述技术方案，幽门螺旋杆菌的主要生存部位为人胃窦部，幽门螺旋杆菌caga基因所编码的蛋白的作用部位为人胃部细胞。将人源化caga真核表达载体pcdna3.1(+)-caga转染人胃癌细胞，可实现对caga基因所编码的蛋白的致病机制以及caga基因与胃癌之间关系的研究。进一步，所述人胃癌细胞来源于ags细胞株。采用上述技术方案，ags细胞属于低分化细胞，ags细胞分离自胃低分化腺癌细胞，胃低分化腺癌的恶性程度相对较高，治疗相对困难。所以将本法制备的人源化caga真核表达载体pcdna3.1(+)-caga转染ags细胞株，可实现对caga基因与恶性胃癌之间的关系的研究。进一步，在所述密码子优化步骤和所述人源化caga真核表达载体构建步骤之间还有核苷酸序列鉴定步骤。采用上述技术方案，对密码子优化步骤中合成得到的核苷酸序列进行核苷酸序列鉴定，再使用经过鉴定筛选的核苷酸序列进行人源化caga真核表达载体的构建，可避免由于合成错误或基因突变造成的核苷酸序列错误，进而避免错误的核苷酸序列对后续步骤的影响，保证了最后在宿主细胞中表达出正确的蛋白。常规的核苷酸序列鉴定方法为测序鉴定。附图说明图1为空载体pcdna3.1(+)的示意图。图2为幽门螺旋杆菌caga基因和人源化caga基因的核苷酸序列比对结果。图3为pcr扩增产物的电泳结果。图4为wb检测蛋白表达水平(pcdna3.1(+)-caga转染ags细胞后)。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细说明：人源化caga基因的获取及其真核表达载体的构建1.人源化caga基因核苷酸序列的获取根据幽门螺旋杆菌caga基因序列，对其密码子进行优化，获得人源化caga基因的核苷酸序列(见seqidno:1)。幽门螺旋杆菌caga基因(hpcaga；ncbisequenceid:kr154737)和人源化caga基因(含限制性内切酶识别序列和kozak序列)的核苷酸序列比对结果请见图2。2.人工全基因合成人源化caga基因以及鉴定(1)实验材料内切酶(fermentas)；引物oligo(invitrogen合成)；t4dnaligase(1u/μl)(ep0061,fermentas)；凝胶回收试剂盒(ap-gx_250,axygen)；generulerdnaladder(sm0332,fermentas)，感受态细胞e.colidh5α(诺百)等，质粒小抽试剂盒(ap-mn-p-250，ayxgen)，质粒中抽试剂盒(ap-md-p-25，ayxgen)，质粒大抽试剂盒(ap-mx-p-25，ayxgen)。(2)实验仪器台式冷冻离心机(neofuge13r,healforce)，生物安全柜(hfsafe-1800,healforce)，pcr仪(t100tm,bio-rad)，电泳成像系统(tanon1600,天能)，干式恒温仪(tu-100c，一恒科技)温控摇床(thz-98,太仓)等。(3)全基因合成及鉴定按照seqidno:1中的人源化caga基因的核苷酸序列，人工直接合成人源化caga基因(委托生物技术公司按照seqidno:1的核苷酸序列合成)，得人工合成的人源化caga基因，该人源化caga基因连接在t载体上(t-caga)。对连接于t-caga上的人源化caga基因进行测序以核实核苷酸序列为正确序列。(4)真核表达载体的构建将人工合成的人源化caga基因连接于真核表达载体pcdna3.1(+)(pcdna3.1(+)空载体结构见图1所示)上，得连接有基因的pcdna3.1(+)(待检测连上的基因是否为正确的目的基因)。具体载体连接过程为：对人工合成的人源化caga基因和真核表达载体pcdna3.1(+)分别进行双酶切(酶切体系和条件见表1、表2)，再将酶切后的人工合成的人源化caga基因连接到酶切后的pcdna3.1(+)上(连接体系和条件见表3)。本发明的人源化caga真核表达载体的构建选用的酶切位点为nheⅰ限制性酶切位点和xbaⅰ限制性酶切位点。表1：人工合成的人源化caga基因双酶切表2：真核表达载体pcdna3.1(+)双酶切表3：目的基因与载体连接使用表3中的连接产物转化感受态细菌e.colidh5α，涂板过夜培养，从平板上随机挑选完全落单的菌落(单克隆菌落)，用菌检pcr方法检测，挑取菌检pcr中得到的阳性克隆送测序公司进行测序验证，选取测序验证为正确序列的大肠杆菌阳性克隆进行扩菌培养，也就是说，测序验证为正确序列的大肠杆菌阳性克隆中含有连接上人源化caga基因的pcdna3.1(+)。将连接上人源化caga基因的pcdna3.1(+)命名为pcdna3.1(+)-caga，即人源化caga真核表达载体。将含pcdna3.1(+)-caga的e.colidh5α的菌液放大培养后，利用axygen质粒抽提试剂盒和方法抽提pcdna3.1(+)-caga，对抽提出的pcdna3.1(+)-caga中的人源化caga基因进行pcr检测，电泳结果如图3所示。由图3可知，人源化caga基因的长度在3700bp左右。对pcdna3.1(+)-caga进行pcr检测，pcr扩增产物电泳的上样情况如下：第1/2/3泳道上样为pcdna3.1(+)-caga的pcr扩增产物，第4泳道上样为dna分子量标记(dnamarker15000)。(4)用pcdna3.1(+)-caga转染胃癌细胞(4.1)胃癌细胞培养ags细胞株(购于atcc，crl-1739tm)，用rpmi-1640完全培养基(10％fbs)，置于37℃5％co2孵育箱进行常规培养，细胞培养方法如下：ags细胞的复苏：从-80℃超低温冰箱取出保存的细胞株以后，迅速放入37℃水浴，待完全溶解后，800rpm离心5min。弃去上清，用培养液吹打混匀后，加入细胞培养皿中，均匀摇晃，放入co2培养箱中。ags细胞传代及计数：生长有细胞的培养瓶中加入0.5ml胰酶，消化2～3min后加入1ml培养基，将培养液转入离心管中，800rpm离心5min，弃上清。加入2～3ml培养液，吹打混匀，转移到培养皿中。取消化的细胞75μl在细胞计数器上进行计数，并计算出1ml细胞数量。ags细胞的保存：将培养液离心，800rpm离心5min，弃上清。加入冻存液(胎牛血清：dmso＝9：1)，吹打混匀。分装入冻存管中并放入液氮室。(4.2)转染胃癌细胞将培养好的ags细胞铺于6孔板内，进行转染实验。实验分组如表4所示：表4：转染实验设计实验分组编号表达载体转染试剂空白对照组t0n/alipofectamine2000阴性对照组t1pcdna3.1(+)lipofectamine2000实验组t2pcdna3.1(+)-cagalipofectamine2000现有技术组t3pcdna3.1(+)-hpcaga*lipofectamine2000*注释：pcdna3.1(+)-hpcaga的制备方法为将未进行密码子优化的幽门螺旋杆菌caga基因(hpcaga，ncbi编号kr154737)直接连接上pcdna3.1(+)。在实验组中，将pcdna3.1(+)-caga与lipofectamine2000以3μg:5μl的比例混合，将上述混合液5μl加入铺有ags细胞的6孔板内进行细胞转染。在空白对照组中，加入5μllipofectamine2000到铺有ags细胞的6孔板内进行细胞转染。在阴性对照组中，将pcdna3.1(+)与lipofectamine2000以3μg:5μl的比例混合，将上述混合液5μl加入铺有ags细胞的6孔板内进行细胞转染。在现有技术组中，将pcdna3.1(+)-hpcaga与lipofectamine2000以3μg:5μl的比例混合，将上述混合液5μl加入铺有ags细胞的6孔板内进行细胞转染。在上述各组中，转染处理持续6h后停止并更换培养基，继续培养细胞48h后结束细胞培养并收细胞。(4.3)转染后提取蛋白以及wb检测使用bca蛋白定量试剂盒提取(4.2)中收获的转染后的ags细胞的总蛋白，采用wb法检测caga基因的蛋白表达量，实验结果如图4所示。各泳道分别为：t0为空白对照，t1为实验组，t2为阴性对照组，t3为现有技术组，最右边泳道为蛋白分子量标记(marker)。实验结果显示：人源化caga真核表达载体pcdna3.1(+)-caga上的人源化caga基因在胃癌细胞株ags中大量表达，人源化caga基因编码的蛋白分子量在135kd左右。幽门螺旋杆菌caga基因未进行过密码子优化处理，该基因在胃癌细胞株ags中无表达。以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。sequencelisting<110>贵州医科大学<120>人源化幽门螺旋杆菌caga真核表达载体构建方法<130>2019.3.21<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>3552<212>dna<213>人工序列<400>1atgacaaatgaaactatcaaccagacgactaccccagatcagactcccaatcagaccgac60ttcgtaccgcagaggtttattaacaatctgcaggttgcctttattaaggttgatagcgca120gtcgccagtttcgacccagaccaaaagcccattgtggataagaatgatagggacaaccgg180caggcctttgagaagatctcacagctgagggaggagtacgccaacaaggccatcaaaaat240cccgcgaaaaagaaccaatatttttccgacttcatcaacaagtcaaacgatctaattaat300aaggataacctgattgcagtcgactctagtgtggactcttttaagaaattcggcgaccag360cgctaccagatttttacaagttgggtctctcttcagaaggacccttcacaaataaacact420caaaagattcgggactttatggagaacatcatccagccacccatttcagacgataaggag480aaagctgaatttctgaggtccgcgaagcagagtttcgcaggcatcatcatcgggaatcag540atcagatctgatgagaagttcatgggtgtcttcgatgaatcactgaaggcccgacaggaa600gctgaaaagaacgcagagcccgccggcggagactggcttgatatttttctgagcttcgtt660ttcaacaagaagcagtcctctgaccttaaagaaactttgaaccaggaaccacgacctgac720tttgagcagaaccttgcgaccaccacaaccgatattcaggggctgccacccgaggcccgc780gacttgttggatgaacgcggcaacttctccaaattcacactgggcgacatggagatgctg840gatgtcgagggggtggctgacaaggacccaaattataagttcaatcaactcctgatccac900aataacgctctgtcatcagtgctgatgggaggacactccaacatcgaacccgaaaaggtc960agcctgttgtacggtgataacgggggcccagaagcaaggcacgactggaacgctactgtt1020gggtataaagaccagcaagggaacaacgtggctacactgatcaacgcgcacctgcacaat1080ggaagcggcttgatcatcgccggcaacgaaaacggaatcaagaatccttcattctacttg1140cacaaagaagaccagctaactggcttgaagcaagccctgagccaggaagagatccagaac1200aacgtggactttatggagttcttggctcagaataatgctaaattagataacctctcggaa1260aaggagaaagagaaattccagaccgagattgagaactttcagaaagataggaaagcatac1320ctggacgctctcggcaatgatcacatagccttcgtgagtaagaaggatccgaagcatctg1380gccttagtgacggaattcggcaatggggaagtgtcttatacgttgaaagattatggaaag1440aaacaggacaaagccttggatggtgagatcaaaacaacactacaggggtctctcaaatac1500gatggtgtcatgttcgttaattactcaaactttaaatatacaaatgcatccaagtcccca1560gacaaaggtgtggggacaacgaatggagtgtctcatcttgaggccaattttagtaaagtc1620gctgtcttcaatctgcctaacctcaacaatctcgcgatcaccagttatattagacgagac1680ctcgaggataagttatgggcaaaaggcttatccccccaggaggccaacaagttaatcaaa1740gattttctgaacagcaataaagagatggtggaaaaggtgagtaatttcaacaaggcagtc1800gccgaggctaagaataccgggaattacgacgaggtgaagaaggcccagaaggatctggag1860aaatccctccggaaaagagaacatctggagaaagaggttgctaagaagctggaaagtaga1920aacgataataagaaccgcatggaggccaaggcacaagcgaatagtcaaaaggataaaatc1980tttgctctgatcaaccaagaagcatccaaggaagccagagctgccgccttcgacccaaac2040gtaaagggtgtacgctccgaactgtctgacaaactcgagaacatcaataagaatctcaag2100gacttcgggaaatcgttcgacgagctaaaaaatggaaaaaacaaggactttagcaaggca2160gaagagaccttaaaggcccttaaggatagcgtgaaagatctggggataaaccccgagtgg2220ataagcaaaatagagaacctgaacgccgccctcaacgattttaaaaacgggaagaacaag2280gacttttccaaagtgacccaggcaaagagtgaccttgaaaactccattaaggatgttatc2340ataaatcagaagattaccgataaggtagataacctcaaccaggccgtgtctgagacaaag2400ctcactggggacttttctaaggtggaacaggccctcgctgagctgaagaacctctctcta2460gacctcggtaaaaacagcgatctgcagtcggtgaaaaattctgtaaatggaacccttgtc2520gggaatggactttcgaaaactgaggccaccacacttacaaagaacttctccgatatacgg2580aaagagttgaacgagaaacttttcggaaattctaataacaataacaatggcctggagaac2640aataccgagcctatctacgctaaagttaacaagaagaagacgggacaggtcgcatctcct2700gaggagccaatctacgcccaagtggcaaagaaagtaagcgctaaaattgatcaactgaac2760gaggcgacgtcagccataaatcgcaagattgatcgcattaacaaaatcgcgtccgccggg2820aaaggcgtgggcgcgtttagcggtgctcgtcagtcagcctcccccgaacctatctatgcc288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