一种一对引物同时鉴别牛、羊源性成分的PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一对牛羊通用的特异性引物、试剂盒及其在牛羊源性成分鉴定中的应用。

背景技术：

食品、饲料和保健品等产品中动物源性成分，特别是牛、羊源性成分的检测是食品监管和市场管理部门的一项重要工作。为了防止疯牛病和羊痒病在我国的传播，在2017年修订并通过的《饲料和饲料添加剂管理条例》中规定，禁止在反刍动物饲料中添加除乳制品以外的动物源性成分。因此，为了打击食品掺假的违法行为和保障反刍动物饲料安全，开发一种有效的牛、羊源性成分检测技术是十分必要的。

目前，我国用于食品和饲料中牛羊源性成分检测的专利有《一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒-cn104789692a》、《检测饲料中牛羊成分的方法和试剂盒-cn1810988a》、《饲料中牛羊源成分检测方法及试剂盒-cn101775436a》和《一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法-cn105177150a》等。上述专利可以在一定程度上实现食品或饲料中牛和羊源性成分的鉴定，但仍存在一些不足：(1)均须采用多对引物或加入荧光探针才能进行牛和羊中部分物种源性成分的鉴定，而且检测和分析过程繁琐、成本较高；(2)所检测的牛往往只局限于普通牛，而无法实现广义上的牛(含普通牛、瘤牛、牦牛和水牛等)的同时、等效检测，由此可能造成假阴性结果；(3)在进行方法的特异性验证中仅针对少数几个特定物种(通常为牛、羊、猪、鸡、鸭、马)进行试验验证和鉴别，鼠、狐、貉等物种未在其中，所以在方法的特异性上也存在疑问。因此，对食品和饲料中牛和羊源性成分，建立一种能通过一次pcr反应检测涵盖所有常见的牛(普通牛、瘤牛、牦牛和水牛)和羊(绵羊、山羊)的源性成分，且在牛、羊中特异(在牛羊以外的物种不被扩增或与牛羊扩增产物不同)又能进行区分(牛和羊的片段不同)的方法，这样可以使检测方法具有简便、快速、准确、低廉的特点。这样的检测方法是饲料和食品监管部门所急需的，可为饲料与食品行业的真实性与信誉保驾护航。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一对可同时鉴定和区分牛和羊源性成分的特异性检测引物；

本发明的第二个目的在于提供用于牛羊源性制品检测和区分的检测试剂盒；

本发明的目的还在于提供牛羊源性成分鉴定和区分的方法。为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行特异dna序列的筛选，经过猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉的基因组dna以及牛(包括普通牛、瘤牛、牦牛和水牛等)和羊(包括绵羊和山羊)的不同品种dna中的检测，筛选在牛和羊中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的dna片段作为检测分子。此外，为了进一步简化检测过程和降低检测成本，所筛选序列在保证特异性的同时，应能有效区分牛和羊。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异dna序列，其核苷酸序列如序列表seqidno.1和seqidno.2所示。

基于此，本发明首先提供一对牛羊特异性引物，其能特异性扩增seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。该特异性引物能特异性扩增牛特异性序列seqidno.1和羊特异性序列seqidno.2，且扩增序列大小不同(牛为125bp扩增片段，羊为107bp扩增片段)，可通过扩增片段大小对牛和羊源性成分进行有效区分。

优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。

优选地，该引物序列如下：

上游引物：5′-atggcttaggacccagctct-3′下游

引物：5′-acarccagaacctggatcgga-3′；注：

在引物合成过程中，碱基r按照简并碱基a/g进行合成。

进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：taq酶、dntps、mgcl2、pcr缓冲液、阳性对照dna模板、空白对照。

所述阳性对照的模板为牛和羊的基因组dna，所述空白对照的模板为双蒸水；

进一步，本发明提供上述的牛羊特异性引物或检测试剂盒在牛和羊源性成分鉴定和区分中的应用。

本发明还提供牛羊特异性引物、试剂盒及其在牛羊源性成分鉴定中的pcr检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组dna；

2)用上述的引物进行pcr扩增，并以牛和羊dna模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对pcr扩增产物进行检测和结果判定。优选地，

其中步骤2)pcr扩增的反应体系如表1。

表1本发明pcr扩增的反应体系

pcr反应程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，共进行35次循环；72℃延伸3min；4℃保存。

结果判定方法：

牛和羊的阳性对照pcr反应中分别扩增出125bp和107bp的扩增片段，而空白对照中无扩增产物，表明pcr反应体系正常工作，否则重新检测；

若牛特异性序列seqidno.1得到扩增，且扩增片段大小与牛阳性对照的125bp片段大小一致，表明样品中检测出牛所述的特异性序列，表述为“样品中检测出牛源性成分”。若牛特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与牛阳性对照的125bp片段大小不一致，表明样品中未检测出牛所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出牛源性成分”；

若羊特异性序列seqidno.2得到扩增，且扩增片段大小与羊阳性对照的107bp片段大小一致，表明样品中检测出羊所述的特异性序列，表述为“样品中检测出羊源性成分”。若羊特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与羊阳性对照的107bp片段大小不一致，表明样品中未检测出羊所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出羊源性成分”；

若牛特异性序列seqidno.1和羊特异性序列seqidno.2均得到扩增，且扩增片段大小分别为125bp和107bp，分别与牛和羊阳性对照的扩增大小一致，表明样品中检测出牛所述的特异性序列和羊所述的特异性序列，表述为“样品中同时检测出牛源性成分和羊源性成分”。若牛特异性序列seqidno.1和羊特异性序列seqidno.2均未得到扩增，或扩增片段大小与牛和羊阳性对照的片段大小均不一致，表明样品中未检测出牛和羊所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出牛和羊源性成分”。

本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现；提取样品dna的方法可用苯酚-氯仿提取法。

本发明提供了有效的、精准的、可靠的牛和羊源性成分的分子鉴定方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品中是否含有牛和/或羊源性成分，并可根据扩增片段大小实现牛和羊源性成分的有效鉴别。本发明的方法可以在牛和羊源性成分检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1是seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸特异性序列在牛和羊中具有物种特异性的检测结果。以牛科牛亚科中的普通牛和水牛、牛科羊亚科中的绵羊和山羊，以及非牛科哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、水貂、貉)和非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组dna为模板，扩增seqidno.1(牛特异性序列)和seqidno.2(羊特异性序列)所示的特异片段，所有测试样品中仅在普通牛、水牛、绵羊和山羊中得到扩增产物，非牛科物种中均无扩增产物。结果表明所扩增片段在牛科的牛和羊中具有特异性。泳道中编号说明如下：m：为bm2000dnamarker；1-3：空白对照；4-6：普通牛；7-9：水牛；10-12：绵羊；13-15：山羊；16-18：小鼠；19-21：大鼠；22-24：仓鼠；25-27：豚鼠；28-30：猪；31-33：马；34-36：驴；37-39：鸡；40-42：鸭；43-45：鹅；46-48：兔；49-51：狐；52-54：狗；55-57：水貂；58-60：貉。

图2：是seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸特异序列分别在牛和羊不同dna模板浓度中的灵敏度检测结果。分别在20μl体系中加入20ng、10ng、2ng、1ng、0.2ng、0.1ng、0.02ng的牛基因组dna或羊基因组dna以及双蒸水，按照优化好的pcr扩增体系和条件扩增特异片段。每个浓度梯度各设置2个技术重复。a为牛特异性引物的扩增结果，b为羊特异性引物的扩增结果。结果显示，在反应体系中加入0.1ng的dna进行扩增即有明显的条带，表明该定性pcr方法具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下，m：bm2000dnamarker；1-2：20ng；3-4：10ng；5-6：2ng；7-8：1ng；9-10：0.2ng；11-12：0.1ng；13-14：0.02ng；15-16：双蒸水。

图3：是seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸特异序列分别在牛和羊不同品种中的种内保守性检测结果。以水牛、黄牛、奶牛和牦牛的dna，以及小尾寒羊、美利奴羊、湖羊、蒙古绵羊和蒙古绒山羊的dna为模板，按照优化好的pcr扩增体系和条件，利用特异性引物进行扩增。结果表明，在所有测试牛dna样品中都得到125bp的特异性扩增条带，且一致性良好；在所有测试羊dna样品中都得到107bp的特异性扩增条带，且一致性良好。表明所扩增的引物和dna序列在牛和羊的不同品种、个体中均具有良好的保守性。泳道中编号说明如下，m：为bm2000dnamarker；e：空白对照；n：阴性对照(除牛羊以外的其他物种dna，猪和鸡dna混合物)；1-4：水牛；5-6：黄牛；7-8：牦牛；9-10：奶牛；11-12：小尾寒羊；13-14：南非美利奴绵羊；15-16：湖羊；17-18：蒙古绵羊；19-20：蒙古绒山羊。

图4：是所组装的试剂盒在饲料样品中的检测结果。对5个饲料样品，按照上述已优化好的体系进行pcr检测。结果表明，3-6号饲料样品均扩增出目的条带，其中3号样品中检出牛和羊源性成分，4号样品中检出牛源性成分；5号和6号样品中检出羊源性成分。7号牛羊阴性的饲料样品(主要为鱼粉和植物性成分)中未扩增出目的条带，即，不含牛和羊源性成分。检测结果与预期结果一致。阴性对照和空白对照中无扩增产物。泳道中编号说明如下，m：为bm2000dnamarker；e：空白对照；n：阴性对照(除牛羊以外的其他物种dna，猪和鸡dna混合物)；1：牛dna阳性对照；2：羊dna阳性对照；3-7：饲料样品。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1牛、羊物种特异性pcr反应体系建立

1.试样的制备与保存

1.1取样

采集不少于0.2g样品，于-20℃下保存备用。

1.2dna模板制备

dna模板制备采用常用的苯酚-氯仿提取法(萨姆布鲁克j,弗里奇ef,曼尼阿蒂斯t.分子克隆实验指南[m].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)。

2.引物设计

本实施例的引物序列如序列表seqidno：3和4所示。牛预期扩增片段

大小为125bp，羊预期扩增片段大小为107bp，其核苷酸

序列分别如序列表seqidno.1和seqidno.2所示。

3.pcr检测

3.1试样pcr反应

3.1.1在pcr反应管中依次加入反应试剂(见表1)，混匀。

3.1.2将pcr管在离心机上500g～3000g离心10s，然后取出pcr管，放入pcr仪中。

3.1.3进行pcr反应。程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，共进行35次循环；72℃延伸3min；4℃降温2min。

3.1.4反应结束后取出pcr管，对pcr反应产物进行电泳检测。

3.2对照pcr反应

3.2.1在试样pcr反应的同时，设置空白对照、阴性对照及阳性对照。各对照pcr反应体系中，除模板外其余组分及pcr反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照dna模板浓度也应达到试样dna模板浓度要求。

3.2.2以非牛科哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、水貂、貉)和非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组dna作为pcr反应体系的阴性对照模板。

3.2.3分别以牛科牛亚科中的普通牛和水牛、牛科羊亚科中的绵羊和山羊的基因组dna作为pcr反应体系的阳性对照模板。

3.2.4以双蒸水作为pcr反应体系的空白对照模板。

4.pcr扩增产物的检测及结果判定

按25g/l的质量浓度称量琼脂糖，加入0.5×tbe缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100ml琼脂糖溶液中加入5μlgelred核酸染料溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入0.5×tbe缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μlpcr产物与2μl加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入dna分子量标准，接通电源在2v/cm～5v/cm条件下电泳检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据dna分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。

5结果分析与表述

如图1所示，空白对照中未扩增出任何目的条带。在普通牛和水牛的pcr反应中，牛seqidno.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小125bp一致；在绵羊和山羊的pcr反应中，羊seqidno.2所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小107bp一致。而所有阴性对照样品的pcr反应中均无扩增产物。表明所选择的牛羊特异性引物对的特异性较好。

实施例2灵敏度测试

分别在20μl体系中加入20ng、10ng、2ng、1ng、0.2ng、0.1ng、0.02ng的牛基因组dna或羊基因组dna以及双蒸水，按照优化好的pcr扩增体系和条件，或实施例1的条件进行pcr反应。每个浓度梯度各设置2个技术重复。结果如图2所示，在20μl反应体系中加入0.1ng的dna进行扩增即有明显的条带，表明该发明中建立的检测方法具有较好的灵敏性。

实施例3种内保守性测试

以水牛、黄牛、奶牛和牦牛的dna，以及小尾寒羊、美利奴羊、湖羊、蒙古绵羊和蒙古绒山羊的dna为模板，按照优化好的pcr扩增体系和条件，利用特异性引物进行扩增。结果如图3所示，在所有测试牛dna样品中都得到125bp的特异性扩增条带，且一致性良好；在所有测试羊dna样品中都得到107bp的特异性扩增条带，且一致性良好。表明所扩增的引物和dna序列在牛和羊的不同品种、个体中均具有良好的保守性。

实施例4试剂盒的组装

该试剂盒的组成包括：

表2牛、羊源性成分定性pcr检测试剂盒的组成

本试剂盒储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

1.依据需要，按照表1所述的pcr反应体系加样。

2.依据实施例1中3.1.3所述的pcr扩增条件上样。

3.反应结束后取5μlpcr扩增产物，2.5％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2v/cm～5v/cm，电泳30min～45min)，用gelred染色，凝胶成像系统检测结果。每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

实施例5饲料样品检测

对5个饲料样品，按照上述已优化好的体系进行pcr检测。结果如图4所示，3-6号样品均扩增出目的条带，其中3号样品中检出牛和羊源性成分，4号样品中检出牛源性成分；5号和6号样品中检出羊源性成分。7号牛羊阴性的饲料样品(主要为鱼粉和植物性成分)中未扩增出目的条带，即，不含牛和羊源性成分。检测结果与预期结果一致。阴性对照和空白对照中无扩增产物。

序列表说明：

seqidno.1是牛特异性扩增序列的核苷酸序列，序列长度为125bp；

seqidno.2是羊特异性扩增序列的核苷酸序列，序列长度为107bp；

seqidno.3是扩增上述核苷酸片段的正向引物序列；

seqidno.4是扩增上述核苷酸片段的反向引物序列。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种一对引物同时鉴别牛、羊源性成分的pcr检测试剂盒

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210><211><212><213>1125dnabovine

<400>1atggcttaggacccagctctgcagccatggttcggggccttgagcttcccaggtgtgcag60

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<210><211><212><213>320dna人工序列

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