一种筛选科宝肉鸡DNA条形码的方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种筛选科宝肉鸡dna条形码的方法及dna条形码的应用。

背景技术：

广西具有丰富的地方鸡种质资源，目前列入中国家禽品种资源志的广西地方鸡品种有6个，分别是广西三黄鸡、霞烟鸡、广西麻鸡(灵山香鸡和里当鸡)、南丹瑶鸡、广西乌鸡(东兰乌鸡和凌云乌鸡)、龙胜凤鸡。广西这些地方品种具有优良的肉品质和蛋品质，广西三黄属肉蛋兼用型品种，鸡饲养量居全国优质肉鸡首位，年产销量超过3.5亿只，肉质细嫩、气味香浓。南丹瑶鸡属肉蛋兼用型品种体型紧凑、肉质结实细嫩、肉味鲜美、皮薄、蛋品质好等优良特性。广西乌鸡包括东兰乌鸡和凌云乌鸡，体型中等，属肉蛋兼用型品种，肉质鲜美，营养丰富，同时具有较高的药用价值。霞烟鸡属肉用型鸡种具有肉质肥嫩，骨细而软，味道香甜的特点。龙胜凤鸡体躯较短，结构紧凑，外观清秀亮丽，肉质细嫩香醇，野性十足。

广西地方鸡品种是培育优质肉鸡的良好素材，利用广西地方鸡品种配套杂交生产的配套系，能保留肉质鲜美，在一定程度上提高生长速度，但是仍然不能满足一些地方对大体型优质鸡的需求，为了实现黄羽肉鸡的快速生长，有些企业直接将地方品种与快速生长鸡品种进行杂交，来提高生长速度。通过这种杂交的方法，虽然可以在短时间内提高肉鸡的生长速度，但也带来了，肉品质下降、脚肿等一系列问题，有些公司也遭到客户的投诉。由此可知，仅通过体型外貌特征，很难判断是否杂入快大鸡的血统。

微卫星分子标记和线粒体d-loop区序列可有效将不同血缘关系的品种检测出来，微卫星分子标记是以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复列，广泛存在于真核生物的基因组中，平均每50-150kb就存在一个微卫星位点，因此，利用微卫星分子标记可有效准确的检测群体的遗传结构特征，判断品种间的亲缘关系、保种效果以及种群近期是否经历瓶颈效应。线粒体d-loop区序列是线粒体基因组dna变异最大的区域，进化速率是其他序列的5-10倍，在进化的过程中会积累了较多的突变，如碱基替换、插入、缺失和一些串联重复序列。因此，根据线粒体d-loop区序列的变异信息来评估品种的亲缘关系和是否有其他品种的渗入，利用微卫星分子标记和线粒体d-loop区序列虽然可准确的判断品种是否杂入外来品种血统，但是这些方法操作复杂、耗时长、且成本高，不利于在生产中推广应用。

dna条形码技术的出现为家禽品种的鉴别提供了新的手段，通过dna条形码技术可实现快速、便宜和准确的对物种的鉴定，有利于生产的应用和推广。dna条形码标记技术与微卫星标记技术相比，不但准确而且经济，操作性强，动物中常用的基因有细胞色素氧化酶i(coi)、细胞色素b(cytb)、12srrna，16srrna，细胞色素氧化酶ii(coii)和nadh脱氢酶i(nd1)基因等。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明针对上述技术中遗传资源鉴定方法中体型外貌特征法快速、便宜，但准确率低；微卫星标记法准确率高，但慢而且贵的技术问题，发明一种筛选科宝肉鸡dna条形码的方法，并利用筛选到的科宝肉鸡dna条形码鉴别科宝肉鸡的具体应用，以寻求得到一种准确、快速、便宜，易于在生产中应用推的技术和方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种科宝肉鸡dna条形码“tctacgggc”在筛选科宝肉鸡中的应用。

其中，所述的科宝肉鸡dna条形码由下列方法筛选得到：

(1)选择不同公司提供的不同品种纯种鸡以及科宝肉鸡作为试验对象，每个品种选择50个个体采集血液，并进行基因组dna提取(参照《分子克隆实验指南iv》)；

(2)根据已有的dna条形码的研究，选择具有参考意义的线粒体基因(12srrna)用于dna条形码的筛选；

(3)设计候选线粒体基因pcr扩增的特异引物，对每个品种的dna混合池进行pcr扩增，并送给生物公司进行测序，以获得每个品种候选基因的详细序列信息；

(4)比对所有品种dna池的测序结果，记录不同品种的序列变异信息，寻找一些特异的snp位点；先针对各品种dna混合池进行全序列扩增，筛选snp位点，再重设目的片段，主要目的是为了解决由候选基因序列过长导致的测序成本升高的问题；

(5)将snp集中区域作为目的片段，设计引物并对所有个体的dna样品进行pcr扩增；

(6)基于选择的目的片段进行单倍型分析，筛选不同品种鸡所具有的单倍型序列；

(7)排除科宝肉鸡与其他品种共有的单倍型基因序列，筛选其独有的单倍型，作为科宝肉鸡独有的dna条形码，并以此作为鉴定科宝肉鸡的标准；

(8)比对获得其他品种鸡所特有的单倍型序列，分析每一种单倍型的比例和其作为品种专用dna条形码的可行性；

(9)由12srrna基因的+391,+397,+470,+692,+715,+720,+721,+725,+769位点组成的单倍型“tctacgggc”即为科宝肉鸡dna条形码。

其中，步骤(3)中所述的特意引物为12srrna-full-f：5’-tatccgcatcccagtgaa-3’,12srrna-full-r：5’-ctaagtgcaccttccggtac-3’；引物特异性低可能会导致假阳性的情况发生，应注意辨别pcr扩增电泳结果的片段大小；另外，该步骤的主要目的是为了检验各品种的snp突变情况，为步骤(4)、(5)做准备。

其中，步骤(4)中筛选到snp位点在12srrna基因的300～900bp范围内。

其中，步骤(5)中所述的设计引物为12srrna-target-f：5’-acatgttatctgcaccagct-3’，12srrna-target-r：5’-aaatcctccttctaagggcg-3’。

本发明采用pcr直接测序的方法，利用生物信息学分析软件，从线粒体基因筛选到12srrna上特有的snp位点和单倍型序列，再通过大群体验证获得了一条科宝肉鸡特异的dna条形码序列，该dna条形码突破了传统微卫星分子标记检测周期长、费用高等缺点，可用于快速简捷检测地方品种中是否杂入了科宝肉鸡的血统，以及科宝肉鸡纯种的验证分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)准确：本发明是基于分子水平的，可精准判段每个个体的基因型，从而确定是否含有科宝肉鸡血统；

(2)简便：整个检测过程只需一次pcr和测序，就可完成对个体的检测，而微卫星检测每个样品需检测30个位点，跑30次pcr；

(3)便宜：用该方法检测一个样本的成本约15元，而利用微卫星方法进行检测的话，一条微卫星荧光引物平均约400，检测位约30个位点，引物合成费为12000元，微卫星检测费800元/96孔。

附图说明

图1为实施例1中线粒体12srrna基因全序列梯度pcr琼脂糖凝胶电泳结果，其中1、2、3、4、5、6、7、8分别表示63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、50.9℃、50.0℃。

图2为实施例1中线粒体12srrna基因部分片段梯度pcr琼脂糖凝胶电泳结果，其中1、2、3、4、5、6、7、8分别表示63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、50.9℃、50.0℃。

图3为实施例2中的10个品种线粒体12srrna基因特异片段的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料和试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂，市购所得。

实施例1

为了筛选科宝肉鸡特异的dna条形码片段，本方法分别以霞烟鸡、凌云乌鸡、东兰乌鸡、广西麻鸡、灵山麻鸡、灵山香鸡、广西三黄鸡、龙胜凤鸡、南丹瑶鸡，北京油鸡，雪峰乌骨鸡、茶花鸡、艾维茵鸡、科宝肉鸡和白来航鸡等15个品种为研究对象，其中霞烟鸡取自容县周义养殖场，凌云乌鸡取自广西凌云县陈氏牧业有限公司保种场，东兰乌鸡取自东兰县东兰乌鸡原种繁育场，广西麻鸡取自广西南宁市富凤农牧有限公司保种场，灵山麻鸡取自广西灵山县园丰牧业有限公司保种场，灵山香鸡取自广西灵山县兴牧牧业有限公司保种场，广西三黄鸡取自广西春茂农牧集团有限公司保种场，龙胜凤鸡取自广西龙胜县宏盛禽业有限公司保种场，南丹瑶鸡取自广西贵港市港丰农牧有限公司保种场，雪峰乌骨鸡和艾维茵鸡取自广西金陵农牧有限公司保种场，茶花鸡取自云南云岭广大峪口禽业有限公司保种场，北京油鸡、科宝肉鸡和白来航鸡取自中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地，每个品种50个样本，对线粒体上的基因序列进行了分析。

根据genbank上公布的鸡线粒体全序列(登陆号：km886936)中12srrna基因序列，利用oligo7.0软件设计一对特异引物，引物序列为12srrna-full-f5’-acatgttatctgcaccagct-3’,12srrna-full-r5’-aaatcctccttctaagggcg-3’，利用梯度pcr检验引物特异性和最适温度，结果如图1所示，选择61℃作为最佳退火温度。.

各品种单独构建dna混合池，并对15个品种的dna池样本进行12srrna基因全序列的pcr扩增，根据梯度pcr电泳结果，确定最终pcr的扩增体系和扩增条件如下：2xtaqmastermix25μl，上下游引物(10μm)各2μl，基因组dna1μl,补水至50μl。pcr反应温度，95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃最后延伸5min(如表1所示)，获得pcr产物后送给生工生物公司进行测序。

利用chromas软件对测序结果的质量进行检验，去除无效结果，将测序结果利用dnastar软件进行序列比对，并根据测序结果的峰图挑选符合条件的snp位点，确定重新寻找的目的片段的范围。

根据snp突变情况选择12srrna基因300bp～900bp范围重新设计引物，引物序列为12srrna-target-f：5’-acatgttatctgcaccagct-3’，12srrna-target-r：5’-aaatcctccttctaagggcg-3’(梯度pcr检验引物特异性与最适温度，结果如图2所示)；pcr反应体系与上述相同，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃最后延伸5min(详见表1)。pcr扩增所有个体样本后送出测序。

表1

利用dnasp软件对所有个体目的片段的序列信息进行单倍型分析，寻找品种特有的单倍型序列作为品种专用的dna条形码。

结果发现(详情见表2)，在检测的15个品种中，目的片段在12srrna基因的+391,+397,+470,+692,+715,+720,+721,+725,+769位点共存在10种单倍型，除主要单倍型tctatgggc、tatatgggc、tctatgggt、tatatggac同时存在于多个品种外，还有部分单倍型是在极少数样品种发现的；仅科宝肉鸡由于该基因在+715位点的突变导致其独享一种单倍型(tctacgggc)，且频率较高，这条单倍型序列可作为科宝肉鸡dna条形码鉴定的片段。

表2

实施例2

科宝肉鸡特异序列大群体验证

将实例1获得的科宝肉鸡独有单倍型序列作为地方鸡是否混有科宝肉鸡血统的标准：

分别从容县周义养殖场，广西凌云县陈氏牧业有限公司保种场，东兰乌鸡原种繁育场，广西南宁市富凤农牧有限公司保种场，广西灵山县园丰牧业有限公司保种场，广西灵山县兴牧牧业有限公司保种场，广西春茂农牧集团有限公司保种场，广西龙胜县宏盛禽业有限公司保种场，广西贵港市港丰农牧有限公司保种场重新采集霞烟鸡、凌云乌鸡、东兰乌鸡、广西麻鸡、灵山麻鸡、灵山香鸡、广西三黄鸡、龙胜凤鸡和南丹瑶鸡血液样品；另外从中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地重新采集科宝肉鸡血液样品300份；对以上血液样品利用酚/仿法提取基因组dna，结果如图3所示，图3中1-12表示不同品种不同个体单倍型检测的pcr结果。

重复实例1的操作步骤，对目的基因的单倍型序列进行分析，结果如表3所示，所有地方鸡品种12srrna基因的+391,+397,+470,+692,+715,+720,+721,+725,+769突变位点均不包含“tctacgggc”这一单倍型，而科宝肉鸡都含有该单倍型序列，初步确定了地方鸡品种未混有科宝肉鸡的血统。

表3

本发明为了检验该科宝肉鸡鉴定方法的可靠性，通过在不同群体中检测该单倍型的情况来进行验证，共计选择了9个广西地方鸡品种与科宝肉鸡进行比较，每个品种选择了100个样本。经单倍型分析所有个体目的片段的序列后发现，广西地方鸡品种在12srrna基因的+391,+397,+470,+692,+715,+720,+721,+725,+769突变位点上均未出现“tctacgggc”这一单倍型，而科宝肉鸡中有一半以上的个体属于该单倍型序列，确定了地方鸡品种未混有科宝肉鸡的血统。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。