一种快速检测NTRK基因融合试剂盒及其方法与流程

本发明涉及一种快速检测ntrk基因融合试剂盒及其方法，属于分子生物学检测领域。
背景技术：
：ntrk基因包含ntrk1、ntrk2和ntrk3，分别负责编码原肌凝蛋白受体激酶(trk)家庭蛋白trka、trkb和trkc的合成，这些蛋白在神经系统的发育中起着重要的作用。神经营养因子与trk蛋白质结合后可诱导受体二聚体化、磷酸化并激活下游pi3k、ras/mapk/erk和plc-γ的信号级联通路。trk信号通路的改变，包括基因融合、蛋白过度表达或单核苷酸改变，已经被发现是许多肿瘤的致病原因，特别是ntrk基因的融合，为目前最明确的致癌原因。ntrk基因融合出现在在多种成人和儿童实体瘤之中，包括乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌，甲状腺癌、成脂细胞瘤、结直肠癌、以及各种肉瘤，这一类肿瘤可以成为独立ntrk阳性的疾病实体。在常见的癌症中，如非小细胞肺癌，结直肠癌等，ntrk基因融合的发生率较低，大致为1％～3％；但在一些罕见的癌症中，如婴儿纤维肉瘤，类似乳腺分泌性癌，乳腺分泌型癌等，ntrk基因融合的发生率可达90％以上。目前有多个靶向ntrk融合基因的临床在研新药正在进行临床，它们都具有trk激酶抑制活性，大多通过与atp竞争结合位点实现抑制激酶催化活性。目前的临床试验药物可以覆盖ntrk+的泛癌种治疗。2018年2月，世界四大权威医学杂志之一《新英格兰医学杂志(nejm)》发表的一项关于抗癌药vitrakvi(又名larotrectinib)的3项安全性，和有效性临床研究结果显示：对于年龄为4个月至76岁的患者，针对17种不同癌症治疗的总体有效率为75％。2018年11月26日，美国食品和药物管理局批准vitrakvi(又名larotrectinib)，vitrakvi成为了第一个正式批准上市的口服trk抑制药物，同时也是第一个与肿瘤类型无关(tumor-agnostic)的“广谱”抗癌药。vitrakvi用于治疗携带ntrk基因融合((genefusion))的成人和儿童，局部晚期或转移性实体瘤患者，并且没有产生已知的抗性突变，是转移性的或手术切除可能导致严重发病率，没有有效替代治疗方案的。ntrk检测方法，例如，rna-seq、ihc、rt-pcr、ngs、whole-genomeseq、fish等。目前还没有明确的诊断技术被广泛认可。技术实现要素：本发明所解决的技术问题为提供一种ntrk基因融合快速检测方法和检测试剂，实现ntrk基因重排的准确判读；试剂盒通过组分优化，实现组织样本快速杂交检测，2小时内完成杂交检测；检测试剂的商品化能够更好的辅助现有方法进行肿瘤的准确分层、精准诊断、治疗。本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种快速检测ntrk基因融合试剂盒，其包括ntrk1基因探针、ntrk2基因探针、ntrk3基因探针和缓冲液。所述的基因探针制备方法包括购买bac克隆→标记、测试→确认探针克隆组，具体包括如下步骤：市场购买对应探针的bac克隆，使用phi29dna聚合酶标记，标记后将探针进行定量后包装待用。所述的phi29dna聚合酶标记过程包括：以bac克隆为基础模板，使用phi29dna聚合酶，利用短随机六聚体引物在30℃下扩增，标记时间为12小时。其中ntrk1基因探针为断裂探针，其包括gspntrk1-g和gspntrk1-r，其中gspntrk1-g包括ctd-2250p13chr1:156,729,698-156,838,455，ctd-2193l24chr1:156,623,234-156,793,355，ctd-2167d21chr1:156,521,218-156,623,187三个片段；gspntrk1-r包括ctd-2260d6chr1:156,899,249-157,030,882和ctd-3112e24chr1:157,028,427-157,158,598两个片段；ntrk2基因探针为断裂探针，其包括gspntrk2-r和gspntrk2-g，所述的gspntrk2-r包括ctd-2016d19chr9:84,588,703-84,695,686，ctd-2509d1chr9:84,401,922-84,612,318和ctd-2220b15chr9:84,264,299-84,394,202三个片段；gspntrk2-g包括ctd-2277n18chr9:84,949,219-85,052,294，ctd-2313b20chr9:85,052,301-85,167,191和ctd-3171g19chr9:85,159,856-85,308,599三个片段。ntrk3基因探针为断裂探针，其包括gspntrk3-r和gspntrk3-r，所述的gspntrk3-r包括ctd-3108m7chr15:87,788,057-87,900,751，ctd-2526n1chr15:87,651,627-87,863,843，ctd-2600m21chr15:87,443,620-87,633,446三个片段；gspntrk3-g包括ctd-2215j16chr15:88,135,580-88,287,232，ctd-2349o8chr15:88,254,463-88,390,482和ctd-2303n16chr15:88,456,004-88,567,698三个片段；其中r探针为红色探针，g探针为绿色探针。所述的试剂盒中缓冲液组分为甲酰胺添加量在15％～50％、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700μl、二甲基亚砜20～30μl。一种将上述所述的试剂盒用于ntrk基因检测的杂交方法，杂交过程中变性温度为85℃，杂交温度为45℃，杂交时间为2小时。所述的基因检测的杂交方法中红色探针用量0.6～0.8μl，绿色探针用量0.8～1.0μl。实验例一种用于ntrk基因检测方法1.探针设计试剂包含3条探针，其涉及基因组上3个区段，分别为ntrk1、ntrk2、ntrk3基因，设计过程包括：bac克隆选择→购买(商品化)→标记、测试→确认探针克隆组(可用于后续生产)。2.探针制备探针标记(使用phi29dna聚合酶标记)→定量(#探针的点样量、长度都会影响杂交效果)→包装/待用。3.杂交体系优化主要涉及杂交促进剂的使用减少杂交时间，实现快速杂交。(1)促进剂选择杂交过程中，通过增加变性剂能够影响碱基堆积力和氢键的形成，增加水的疏水性和降低双链和单链dna间的能量差异，降低tm值。目前常规的杂交缓冲液中包含甲酰胺，杂交温度在37℃。此外，包含的硫酸葡聚糖因其微粒表面可以吸附dna探针分子，使接触面积增大，有利杂交进行。有记录的核酸杂交促进剂种类较多，但在荧光原位杂交技术中主要使用的为硫酸葡聚糖和甲酰胺，也确实的完成了fish的基本要求，但受杂交时间较长的影响，限制了其临床应用。本发明通过筛选其他惰性多聚体或化学试剂，测试其对杂交的影响，筛选出有益于缩短杂交时间的杂交促进剂。(2)促进剂用量调整鉴于b1配方进行6小时和16小时杂交时，杂交背景有区域性升高。调整杂交缓冲液配方，通过优化其中配比，包括甲酰胺含量、硫酸葡聚糖用量、钠盐含量、dmso用量等，降低背景，改善信噪比。结果显示，当硫酸葡聚糖含量增加时，能够提高信号亮度，但随着杂交时间延长，可能会增加杂交背景；当甲酰胺用量降低时，伴随增加dmso的量，能够弥补杂交信号，满足预期要求，但低于15％时，会影响短时杂交效果。确定甲酰胺添加量在15％～50％、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700μl、二甲基亚砜20～30μl。4.样本杂交条件优化确认变性85℃，杂交45℃，杂交2小时。实现了2小时快速杂交。5.探针质控及阈值建立人外周血培养细胞用于灵敏度和特异性评估(常规方法)→建立阈值。骨髓样本用于使用效果评估(基质样本来源于临床)。6.检测试剂盒的制备7.临床应用评价选择20例左右样本进行该试剂的应用评估。使用建立的阈值进行结果判读。本发明与现有技术相比具有以下有益效果：所述的试剂盒为快速杂交体系，实现2小时快速杂交；并可实现ntrk基因重排的准确判读；试剂盒通过组分优化，实现组织样本快速杂交检测，即2小时内完成杂交检测；检测试剂的商品化能够更好的辅助现有方法进行肿瘤的准确分层、精准诊断、治疗。附图说明图1为ntrk1探针杂交效果图，其中左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号；虚线箭头示分离(1r1g)信号。图2为ntrk2探针杂交效果图，其中左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号；虚线箭头示分离(1r1g)信号。图3为ntrk3探针杂交效果图，左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号。未见分离信号出现。图4为ntrk1探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。图5为ntrk2探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。图6为ntrk3探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。具体实施方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。实施例一种ntrk基因融合快速检测试剂及其试剂盒1.探针设计试剂包含3条探针，涉及基因组上3个区段，分别为ntrk1、ntrk2和ntrk3基因，设计过程包括：bac克隆选择→购买(商品化)→标记、测试→确认探针克隆组(可用于后续生产)。bac克隆筛选方法参照《医学遗传学数据库资源利用实例教程》赵佳等p26-28。·bac克隆选择：2.探针制备探针标记(使用phi29dna聚合酶标记)→定量(#探针的点样量、长度都会影响杂交效果)→包装/待用。以bac克隆为基础模板，使用phi29dna聚合酶，利用随机六聚体引物，常温下扩增。基因探针的标记利用phi29dna聚合酶进行常温标记。phi29dna聚合酶是从噬菌体phi29中克隆出的嗜温dna聚合酶。具有3'→5'外切酶校读能力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性。目前在病毒检测、单细胞测序、mirna检测中都有应用。因其等温扩增的特点，操作上更加便利。但目前尚未见用于探针标记。标记后使用短的随机六聚体引物进行扩增，扩增温度30℃，标记时间12小时。3.杂交体系优化——实现快速杂交主要涉及杂交促进剂的使用减少杂交时间，实现快速杂交。优化各配方如下：(1)促进剂选择杂交过程中，通过增加变性剂能够影响碱基堆积力和氢键的形成，增加水的疏水性和降低双链和单链dna间的能量差异，降低tm值。目前常规的杂交缓冲液中包含甲酰胺，杂交温度在37℃。此外，包含的硫酸葡聚糖因其微粒表面可以吸附dna探针分子，使接触面积增大，有利杂交进行。有记录的核酸杂交促进剂种类较多，但在荧光原位杂交技术中主要使用的为硫酸葡聚糖和甲酰胺，也确实的完成了fish的基本要求，但受杂交时间较长的影响，限制了其临床应用。本发明通过筛选其他惰性多聚体或化学试剂，测试其对杂交的影响，筛选出有益于缩短杂交时间的杂交促进剂。测试探针统一选择为500bp以下核酸混合物。配制杂交液以a2～e2为杂交体系，人外周血培养细胞为样本，进行杂交。杂交时间设定3个时间点，分别为1小时、2小时、6小时和16小时。杂交完成后dapi复染，镜下评估杂交信号、背景情况。结果显示，a-z和b-z即碳酸亚乙酯和二甲基亚砜具有较好的杂交效果。考虑到碳酸亚乙酯已经有过临床应用，选择二甲基亚砜(dmso)作为后续研发测试的重点。(2)促进剂用量调整鉴于b1配方进行6小时和16小时杂交时，杂交背景有区域性升高。调整杂交缓冲液配方，通过优化其中配比，包括甲酰胺含量、硫酸葡聚糖用量、钠盐含量、dmso用量等，降低背景，改善信噪比。如上示例分别配制杂交液。以人外周血培养细胞为样本，进行杂交。杂交时间设定3个时间点，分别为1小时、2小时、6小时和16小时。杂交完成后dapi复染，镜下评估杂交信号、背景情况。结果显示，当硫酸葡聚糖含量增加时，能够提高信号亮度，但随着杂交时间延长，可能会增加杂交背景；当甲酰胺用量降低时，伴随增加dmso的量，能够弥补杂交信号，满足预期要求，但低于15％时，会影响短时杂交效果。确定甲酰胺添加量在15％～50％、硫酸葡聚糖0.2～0.25g/700μl、二甲基亚砜20～30μl。4.样本杂交条件优化确认变性85℃，杂交45℃，杂交2小时。实现了2小时快速杂交。5.探针用量调整设计探针用量梯度，以人外周血样本为检测对象，考查最佳信噪比。相同用量时，红色探针信号优于绿色探针，且随着探针用量增加，背景有增强的趋势。在三组探针中表现趋势一致(不单独列表说明)。过夜或快速杂交对背景影响不明显；过夜杂交会提高探针低浓度用量时的信号，即当信号表现一般时，通过延长杂交时间有助于改善信号亮度。cot-1dna用量具一定的改善背景效果，但持续增加对背景并无明显优化。本例中选择1.0μl添加量，能够较好抑制背景。综上，选择红色探针用量0.6～0.8μl，绿色探针用量0.8～1.0μl。6.探针质控及阈值建立人外周血培养细胞用于灵敏度和特异性评估(常规方法)→建立阈值。图1为ntrk1探针杂交效果图，其中左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号；虚线箭头示分离(1r1g)信号。图2为ntrk2探针杂交效果图，其中左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号；虚线箭头示分离(1r1g)信号。图3为ntrk3探针杂交效果图，左图人外周培养细胞杂交图(含中期染色体)右图组织样本检测图，其中实线箭头示融合(f)信号。未见分离信号出现。图4为ntrk1探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。图5为ntrk2探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。图6为ntrk3探针样本(肺腺癌-1)杂交图，图中未见分离信号出现。检测结果表明，探针特异性100％，灵敏度100％。能够满足预期。在骨髓样本的检测中，检测信号明亮。三个探针标记不同颜色。中期染色体骨髓样本ntrk12f2fntrk22f2fntrk32f2f*f示融合信号，即r红和g绿色信号接近或重合时表现为融合信号。7.检测试剂盒的制备包含杂交缓冲液和探针两个组分，及用于包装的试剂盒、说明书。(μl)ntrk1杂交液ntrk2杂交液ntrk3杂交液杂交缓冲液777ntrk-g0.80.80.8ntrk-r0.60.60.6cot-1dna111纯化水0.60.60.6总体积101010试剂盒组成(5人份/盒)8.临床应用评价虽然ntrk1/2/3在很多肿瘤中都可发生融合异常，但其总体阳性率低，小于1％。在进行试剂的临床应评价中，随机选择与ntrk相关的肿瘤样本(肺腺癌8例、结直肠癌5例、乳头状甲状腺癌2例、唾液腺乳腺样分泌性癌2例、胶质瘤3例)进行检测，评估探针的检测效果，使用建立的阈值进行结果判读。其样本检测结果如下所示：样本编号病理类型ntrk1fishntrk2fishntrk3fish1肺腺癌阴性阴性阴性2肺腺癌阴性阴性阴性3肺腺癌阴性阴性阴性4肺腺癌阴性阴性阴性5肺腺癌阴性阴性阴性6肺腺癌阴性阴性阴性7肺腺癌阴性阴性阴性8肺腺癌阴性阴性阴性9结直肠癌阴性阴性阴性10结直肠癌阴性阴性阴性11结直肠癌阴性阴性阴性12结直肠癌阴性阴性阴性13结直肠癌阴性阴性阴性14乳头状甲状腺癌阴性阴性阴性15乳头状甲状腺癌阴性阴性阴性16唾液腺乳腺样分泌性癌阴性阴性阴性17唾液腺乳腺样分泌性癌阴性阴性阴性18胶质瘤阴性阴性阴性19胶质瘤阴性阴性阴性20胶质瘤阴性阴性阴性当前第1页12