一种提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法及其突变株与流程

本发明涉及一种利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法及其突变株。属于生物工程技术领域。

背景技术：

木质纤维素资源种类繁多、年产量巨大，其综合利用既可带来经济效益，又能够减少因焚烧等不当处理引起的环境污染。木糖组分在木质纤维素原料中含量高达30％左右，仅次于葡萄糖组分，对其进行综合利用可以显著提高原料利用率。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛用于食品和工业生产的微生物，其具有鲁棒性强、代谢旺盛以及食品级安全等特性。通过基因工程手段，将合适的代谢途径关键酶引入酿酒酵母，可以获得能够将木糖转化为各种目标产品的细胞工厂。例如，表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶/表达木糖异构酶，过表达木酮糖激酶，过表达磷酸戊糖途径非氧化还原阶段的酶等等。再经过适应性进化技术，提高菌株的木糖利用能力。目前，主要直接的目标产品包括燃料乙醇、木糖醇、木糖酸等(以酿酒酵母为细胞工厂的木质纤维素原料对木糖组分利用的研究进展。沈煜，侯进，肖林，夏蕊蕊，鲍晓明。生物产业技术，2014，05，76-81)。但是现有重组酿酒酵母菌株的木糖利用能力还有待进一步提高。

Tec1p是一个转录因子，是TEA/ATTS DNA结合域家族成员。目前认为，Tec1p调节丝状生长相关基因和转座子Ty1的表达[Dual role of the Saccharomyces cerevisiae TEA/ATTS family transcription factor Tec1pp in regulation of gene expression and cellular development. T,Wesche S,Taheri N,Braus GH,HU.Eukaryot Cell.2002Oct；1(5):673-86.]。Tec1p正向调节酿酒酵母细胞的时序寿命[Genomewide mechanisms of chronological longevity by dietary restriction in budding yeast.Campos SE,Avelar-Rivas JA,Garay E,Juárez-Reyes A,DeLuna A.Aging Cell.2018Jun；17(3):e12749.]。有工作比较了通过适应性进化，木糖利用能力提高的菌株和进化前菌株的组学差异。其中转录水平发生变化的转录因子基因中包含TEC1，其TEC1基因转录水平相对于进化前菌株有所变化：在葡萄糖发酵时比进化前菌株低，在葡萄糖木糖共发酵时比进化前菌株低，在木糖发酵时比进化前菌株高[Molecular analysis of a Saccharomyces cerevisiae mutant with improved ability to utilize xylose shows enhanced expression of proteins involved in transport,initial xylose metabolism,and the pentose phosphate pathway.Wahlbom CF,Cordero Otero RR,van Zyl WH, B, LJ.Appl Environ Microbiol.2003Feb；69(2):740-6.]。同样是比较适应性进化后木糖利用能力提高的菌株和其进化前菌株的转录组，利用转录水平显著上调的基因分析出可能相关的9个转录因子，利用转录水平显著下调的基因分析出可能相关的11个转录因子。这些被推测可能相关的转录因子中包括Tec1p[Transcriptome changes in adaptive evolution of xylose-fermenting industrial Saccharomyces cerevisiae strains withδ-integration of different xylA genes.Li YC,Zeng WY,Gou M,Sun ZY,Xia ZY,Tang YQ.Appl Microbiol Biotechnol.2017Oct；101(20):7741-7753.]。但是，至今为止，没有工作证明Tec1p和碳代谢直接相关，也没有工作显示调节Tec1p能够影响酿酒酵母对木糖的利用。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法及其突变株。

本发明的技术方案是通过在可利用木糖的重组酿酒酵母中的转录因子蛋白Tec1p中引入点突变T273M实现该基因工程酿酒酵母木糖利用能力大幅度提高，进而也促进了其在生物乙醇生产中的应用和乙醇得率的提高。

本发明所述利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法，其特征在于：所述方法是在具备木糖利用能力的重组酿酒酵母中表达转录因子Tec1p突变体以提高菌株木糖利用能力；其中所述的转录因子Tec1p突变体命名为Tec1p^T273M，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型转录因子Tec1p的第273位的苏氨酸突变为蛋氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中：所述具备木糖利用能力的重组酿酒酵母优选重组酿酒酵母菌株BSGX001，该菌株已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

本发明所述利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株利用含木糖原料生产乙醇的方法，其特征在于：所述方法是在具备木糖利用能力的重组酿酒酵母中表达转录因子Tec1p突变体以提高菌株木糖利用能力进而提升乙醇的生产速率和得率；其中所述的转录因子Tec1p突变体命名为Tec1p^T273M，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型转录因子Tec1p的第273位的苏氨酸突变为蛋氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中：所述具备木糖利用能力的重组酿酒酵母优选重组酿酒酵母菌株BSGX001，该菌株已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

本发明所述利用表达TEC1基因突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法，其特征在于：所述方法是在具备木糖利用能力的重组酿酒酵母中表达TEC1基因突变体以提高菌株木糖利用能力；其中所述的TEC1基因突变体命名为TEC1^T273M，是Genebank中Gene ID:852377的突变体，其核酸序列中第817-819位核苷酸由ACG突变为AUG，核酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者是所述TEC1基因突变体的核酸序列是由于遗传密码子的简并性区别于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的核苷酸序列。

上述利用表达TEC1基因突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法中：所述TEC1基因突变体的核酸序列优选是如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

其中：所述具备木糖利用能力的重组酿酒酵母优选重组酿酒酵母菌株BSGX001，该菌株已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

本发明所述利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法中用于表达转录因子Tec1p突变体的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌BSWT-273，是重组酿酒酵母菌株BSGX001染色体上TEC1基因原位突变为TEC1^T273M突变基因的酿酒酵母突变株，其中所述的重组酿酒酵母菌株BSGX001已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

本发明所述利用转录因子Tec1p突变体提高重组酿酒酵母菌株利用含木糖原料生产乙醇的方法中用于表达转录因子Tec1p突变体的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌BSWT-273，是重组酿酒酵母菌株BSGX001染色体上TEC1基因原位突变为TEC1^T273M突变基因的酿酒酵母突变株，其中所述的重组酿酒酵母菌株BSGX001已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

本发明的有益效果是：在利用同时含有葡萄糖和木糖的原料，例如木质纤维素水解液，进行发酵时，显著提高了葡萄糖耗尽后，菌株对木糖的利用，因而能够显著缩短发酵时间。

实验证实，表达突变基因TEC1^T273M突变基因的重组菌株BSWT-273，其在葡萄糖木糖共发酵中，菌株的生长显著优于出发菌株BSGX001，木糖的利用和乙醇的生产速率均显著高于对照菌株。其中，其中，BSWT-273比出发菌株BSGX001木糖利用速率提高125％，从0.183g/L/h，提高到0.413g/L/h；乙醇得率提高了50％。

附图说明

本发明涉及的重组酿酒酵母菌株BSGX001已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。

图1：质粒pJPPP3构建流程1。

图2：质粒pJPPP3构建流程2。

图3：质粒pJPPP3构建流程3。

图4：用于在染色体上原位突变TEC1基因的流程图。

其中：TEC1p代表TEC1启动子；TEC1-ORF代表TEC1基因开放阅读框架；TEC1t代表TEC1终止子；KanMX4表达框指两端带有同向LoxP序列的能够表达蛋白使菌株具有G418抗性特征的一整段DNA序列。片段1是TEC1-ORF的一部分，其3’端含有利用引物引入的T273M突变。片段1的具体序列如SEQ ID NO:4所示。片段2含有TEC1-ORF的3’端部分，其5’端含有利用引物引入的T273M突变，此外，片段2的3’端还含有一小部分KanMX4表达框序列。片段2的具体序列如SEQ ID NO:5所示。片段3的5’端含有一小部分TEC1-ORF，中间是KanMX4表达框，3’端是一小部分TEC1t。片段3的具体序列如SEQ ID NO:6所示。片段4的5’端含有一小部分KanMX4表达框序列，3’端是一部分TEC1t。片段4的具体序列如SEQ ID NO:7所示。这些片段间彼此交叠的部分用于融合PCR过程中的互补退火。融合PCR获得重组用DNA片段5，其和基因组上TEC1基因座位(TEC1loci)发生同源重组。片段5的具体序列如SEQ ID NO:8所示。

图5：表达TEC1^T273M突变基因对菌株木糖发酵的影响。

其中：发酵培养基以20g/L木糖和20g/L葡萄糖为碳源，—○—代表出发菌株BSGX001；—★—代表表达Tec1p^T273M的重组菌株BSWT-273。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例如Methods in yeast genetics and genomics:a Cold Spring Harbor Laboratory course manual 2015edition(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2005)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明保护内容不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

实施例1：酿酒酵母菌株BSGX001的构建和获得

构建主要过程如下：

(1)过表达菌株CEN.PK113-5D的木酮糖激酶基因XKS1。

以质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)为模板，用引物XKKans和Kana扩增出两端带有LoxP位点的G418抗性基因KanMX4片段LoxP-KanMX4-LoxP。

以酿酒酵母基因组为模板，用引物XKTEF1ps和XKTEF1pa扩增含有启动子TEFp的片段。再通过融合PCR进行启动子与DNA片段LoxP-KanMX4-LoxP的融合扩增，得到LoxP-KanMX4-LoxP-TEF1p整合片段。

整合片段使用醋酸锂转化法转化酿酒酵母CEN.PK113-5D(MATa SUC2MAL2-8c ura3-52)，详见文献[25Yeast Genetic Strain and Plasmid Collections,Karl-Dieter Entian and Peter Methods in Microbiology,2007(36):629-666]。

具体的，在含有200μg/mL G418的YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)平板筛选到的转化子，并转入质粒pSH47，于SC-URA培养基(6.7g/L酵母基础氮源，0.77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，pH 6.0)平板上筛选到的转化子转接至YPG(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％半乳糖)培养基中诱导重组酶Cre表达，以去除染色体上的KanMX4标记基因。去除KanMX4标记的菌株经YPD培养过夜后在5-FOA培养基(2倍SC-URA培养基中添加50mg/L尿嘧啶，1g/L 5-氟乳清酸，pH 6.0，0.2μm孔径滤膜过滤除菌，使用时加入等体积3％的无菌水琼脂，混合均匀后铺倒平板)平板上筛选消除质粒pSH47的菌株。获得菌株命名为BSPC002。

上述实验中涉及的引物序列和具体操作方法细节已在申请人发表的文章(《不同启动子控制下木酮糖激酶的差异表达及其对酿酒酵母木糖代谢的影响》，彭炳银，陈晓，沈煜，鲍晓明，《微生物学报》2011年07期。)中有很详细的描述。

(2)过表达菌株BSPC002中磷酸戊糖途径非氧化还原部分的四个酶基因RKI1，TAL1，TKL1和RPE1，同时敲除非特异性糖醇还原酶基因GRE3。

首先按照图1-图3所示流程步骤构建质粒pJPPP3，具体步骤如下：

以CEN.PK113-5D菌株的染色体为模板，利用引物RAGRE31s(SEQ ID NO:9)和RAGRE31a(SEQ ID NO:10)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到GRE3重组臂1(Recsit1),利用引物RAGRE32s(SEQ ID NO:11)和RAGRE32a(SEQ ID NO:12)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到GRE3重组臂2(Recsit2)，并利用融合PCR将两者融合为GRE3重组臂1-重组臂2。用限制性内切酶EcoRI和SphI处理质粒pUC19(常规质粒，各种生物公司均可购得)，用限制性内切酶MunI和SphI处理片段GRE3重组臂1-重组臂2，并将处理后的两者连接，获得大小为3098bp的重组质粒。

以CEN.PK113-5D菌株的染色体为模板，利用引物XPTPI1ps(SEQ ID NO:13)和XPTPI1pa(SEQ ID NO:14)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到TPI1p启动子，利用引物XPRKI1s(SEQ ID NO:15)和XPRKI1a(SEQ ID NO:16)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到RKI1基因，并利用融合PCR将两者融合为DNA片段TPI1p-RKI1。用限制性内切酶BamHI和Sse8387I处理上一步得到的大小为3098bp的重组质粒，用限制性内切酶BglII和Sse8387I处理片段TPI1p-RKI1，并将处理后的两者连接，获得大小为4759bp的重组质粒。

以CEN.PK113-5D菌株的染色体为模板，利用引物XPPGK1ps(SEQ ID NO:17)和XPPGK1pa(SEQ ID NO:18)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到PGK1p启动子，利用引物XPTAL1s(SEQ ID NO:19)和XPTAL1a(SEQ ID NO:20)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到TAL1基因，并利用融合PCR将两者融合为DNA片段PGK1p-TAL1。用限制性内切酶BamHI和Sse8387I处理上一步得到的大小为4759bp的重组质粒，用限制性内切酶FbaI和Sse8387I处理片段PGK1p-TAL1，并将处理后的两者连接，获得大小为6642bp的重组质粒。

以CEN.PK113-5D菌株的染色体为模板，利用引物XPFBA1ps(SEQ ID NO:21)和XPFBA1pa(SEQ ID NO:22)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到FBA1p启动子，利用引物XPTKL1s(SEQ ID NO:23)和XPTKL1a(SEQ ID NO:24)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到TKL1基因，并利用融合PCR将两者融合为DNA片段FBA1p-TKL1。用限制性内切酶KpnI和Sse8387I处理上一步得到的大小为6642bp的重组质粒，用限制性内切酶KpnI和Sse8387I处理片段FBA1p-TKL1，并将处理后的两者连接，获得大小为9553bp的重组质粒。

以CEN.PK113-5D菌株的染色体为模板，利用引物XPADH1ps(SEQ ID NO:25)和XPADH1pa(SEQ ID NO:26)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到ADH1p启动子，利用引物XPRPE1s(SEQ ID NO:27)和XPRPE1a(SEQ ID NO:28)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到RPE1基因，并利用融合PCR将两者融合为DNA片段ADH1p-RPE1。用限制性内切酶BamHI和Sse8387I处理上一步得到的大小为9553bp的重组质粒，用限制性内切酶BglII和Sse8387I处理片段ADH1p-RPE1，并将处理后的两者连接，获得大小为11667bp的重组质粒。

以质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)为模板，用引物XPKans(SEQ ID NO:29)和XPKana(SEQ ID NO:30)扩增出两端带有LoxP位点的G418抗性基因KanMX4片段LoxP-KanMX4-LoxP。用限制性内切酶BamHI和Sse8387I处理片段LoxP-KanMX4-LoxP和上一步得到的大小为11667bp的重组质粒，并将处理后的两者连接，获得大小为13276bp的重组质粒，命名为质粒pJPPP3。

用限制性内切酶SmiI酶切质粒pJPPP3，回收10.5kb的DNA大片段，转化酿酒酵母BSPC002，在含有200μg/mL G418的YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)平板筛选到的转化子，并转入质粒pSH47，于SC-URA培养基(6.7g/L酵母基础氮源，0.77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，pH 6.0)平板上筛选到的转化子转接至YPG(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％半乳糖)培养基中诱导重组酶Cre表达，以去除染色体上的KanMX4标记基因。去除KanMX4标记的菌株经YPD培养过夜后在5-FOA培养基(2倍SC-URA培养基中添加50mg/L尿嘧啶，1g/L 5-氟乳清酸，pH 6.0，0.2μm孔径滤膜过滤除菌，使用时加入等体积3％的无菌水琼脂，混合均匀后铺倒平板)平板上筛选消除质粒pSH47的菌株。获得菌株命名为BSPC0039。

(3)敲除菌株BSPC0039中的COX4基因，阻断菌株的呼吸。

以质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)为模板，用引物以引物dCOX4s(SEQ ID NO:31)和dCOX4a(SEQ ID NO:32)扩增带有COX4同源重组臂的KanMX4表达框DNA片段，用该片段转化菌株BSPC0039，在含有200μg/mL G418的YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)平板筛选到的转化子，并转入质粒pSH47，于SC-URA培养基(6.7g/L酵母基础氮源，0.77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物，20g/L葡萄糖，pH 6.0)平板上筛选到的转化子转接至YPG(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％半乳糖)培养基中诱导重组酶Cre表达，以去除染色体上的KanMX4标记基因。去除KanMX4标记的菌株经YPD培养过夜后在5-FOA培养基(2倍SC-URA培养基中添加50mg/L尿嘧啶，1g/L 5-氟乳清酸，pH 6.0，0.2μm孔径滤膜过滤除菌，使用时加入等体积3％的无菌水琼脂，混合均匀后铺倒平板)平板上筛选消除质粒pSH47的菌株。获得菌株命名为BSPC0042。

(4)在菌株BSPC042中表达木糖异构酶基因Ru-xylA并在木糖为唯一碳源的培养基中驯化重组菌株

利用引物TEF1ps(SEQ ID NO:34)和TEF1pa(SEQ ID NO:35)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到TEF1p启动子片段，用限制性内切酶KpnI和BamHI分别处理该片段和质粒YEplac195(GenBank:X75459.1)，并将两者连接。获得的重组质粒用限制性内切酶PstI和HindIII处理后，和同样限制性内切酶处理的，利用引物PGK1ts(SEQ ID NO:36)和PGK1ta(SEQ ID NO:37)从CEN.PK113-5D的基因组中扩增得到PGK1t终止子片段连接。得到表达载体pJFE3。人工合成木糖异构酶基因Ru-xylA(SEQ ID NO:38，WO 2012/113120A1)并将其克隆到pJFE3上的BamHI和PstI位点之间，得到质粒pJX7。

驯化培养在以木糖为唯一碳源的SC-URA培养基(缺尿嘧啶的完全合成培养基)中进行，培养基中含有6.7g/L酵母基础氮源(YNB)，0.77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物，20g/L木糖，pH 6.0。在500ml三角瓶中装100-150ml的20g L^-1培养基，在30℃、200rpm的摇床进行培养，待生长到菌体量不再增加后将10ml培养液转接至新鲜培养基中开始下一批次的培养。待转接时间明显缩短，菌株木糖利用能力显著提高后，结束驯化。获得的菌株命名为酿酒酵母菌株BSGX001。该菌株(BSGX001)已于2019年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17264。

实施例2：酿酒酵母Cre-LoxP遗传操作体系工具质粒YEp-CH的获得

当细胞环境中有Cre酶表达时，Cre酶识别特异的DNA序列LoxP，并催化位点特异性重组，这一重组过程会使两个同向LoxP位点序列之间的序列从所在DNA被删除。YEp-CH是在酿酒酵母中使用的带有Cre-LoxP遗传操作体系工具质粒，其Cre酶基因在半乳糖诱导条件下表达。YEp-CH质粒的构建方法按本领域公知的克隆构建，DNA序列合成等方式获得。

具体的，YEp-CH具体各个序列来源为：骨架为YEp24(GenBank:L09156.1)，Cre表达框克隆自质粒pSH47(GenBank:AF298782.1)的2066至4256bp处，长度为2019bp，插入到YEp24的NcoI限制性内切酶位点(2704bp)处，表达框方向与YEp24上TetR表达框同向，获得中间状态的质粒YEp24-Cre。TEFp-hygB-TEFt表达框为融合PCR获得，其中TEFp和TEFt部分克隆自质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)。TEFp在pUG6上141至484bp处，长度为344bp，TEFt在pUG6上1300至1497bp处，长度为198bp。hygB基因ORF克隆自质粒pUCATPH，上2456至1431bp处，长度为1026bp。通过融合PCR，TEFp，hygB基因ORF和TEFt按顺序组装为TEFp-hygB-TEFt表达框，同时在整个表达框两端加上KpnI酶切位点序列，插入到上述中间状态的质粒YEp24-Cre的KpnI限制性内切酶位点(4886bp)处，整个表达框的方向与TetR表达框同向，获得质粒YEp-CH。所述YEp-CH核苷酸序列如SEQID NO:33所示。

上述质粒YEp24，pSH47，pUG6，pUCATPH均可从BioVector NTCC Inc.购买获得。

实施例3：在酿酒酵母染色体上原位突变TEC1基因

用于在染色体上原位突变TEC1基因的DNA片段通过融合PCR技术获得，扩增条件中退火温度均为52℃，操作参照图4所示，具体步骤如下：

以酿酒酵母BSGX001的染色体DNA为模板，用引物tec1-1(SEQ ID NO:39)和引物tec1-2(SEQ ID NO:40)扩增获得DNA片段1：TEC1-T273M-1(839bp)；用引物tec1-3(SEQ IDNO:41)和tec1-4(SEQ ID NO:42)为引物，获得DNA片段2:TEC1-T273M-2(687bp)，片段2分别和片段1的下游及KanMX4的上游有同源部分。

以质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)为模板，用引物tec1-5(SEQ ID NO:43)和引物tec1-6(SEQ ID NO:44)扩增获得DNA片段3:KanMX4(1642bp)，该片段含有G418抗性基因表达框TEFp-KanMX4-TEFt，两端还分别和DNA片段2、TEC1t有同源的部分。

以酿酒酵母BSGX001的染色体DNA为模板，用引物tec1-7(SEQ ID NO:45)和引物tec1-8(SEQ ID NO:46)扩增获得DNA片段4:TEC1t(350bp)，该片段KanMX4基因下游序列同源。

以DNA片段1、片段2、片段3和片段4混合物为模板，用tec1-1(SEQ ID NO:39)和tec1-8(SEQ ID NO:46)为引物，扩增获得包含筛选标记基因的TEC1原位突变基因的DNA片段5。该片段被连接到平末端载体pEASY-blunt simple vector(北京全式金生物技术有限公司，中国)测序验证正确后转化酿酒酵母BSGX001。

在以20g/L葡萄糖作为碳源，并添加800mg/L G418作为筛选压力的SC-URA固体培养基中筛选转化子。其中SC-URA培养基含有1.7g/L酵母基础氮源(YNB,Sangon,China)，5g/L硫酸铵(Sangon,China)，0.77g/L混合氨基酸CSM-URA(MP Biomedicals,Solon,OH)。固体培养基添加20g/L琼脂糖，pH 6.5-7.0。以转化子染色体为模板，用引物tec1-1和引物tec1-8PCR扩增，获得的条带为3382bp的为正确的转化子菌株。将YEp-CH质粒转入该菌株，在含有400mg/L潮霉素B的培养基中筛选转化子。筛选到的转化子在以20g/L半乳糖为碳源的SC-URA培养基上诱导Cre酶表达，然后在含有和不含有800mg/L G418的SC-URA固体培养基(20g/L葡萄糖作为碳源)平板上对应点种转化子，筛选在有G418条件下不生长，但在不含G418条件下生长的菌株，即为KanMX4基因丢失的菌株。再将这个菌株在20g/L葡萄糖作为碳源的SC-URA中培养，每到稳定期转接一次，共转接三次。然后在含有和不含有400mg/L潮霉素B的SC-URA固体培养基(20g/L葡萄糖作为碳源)平板上对应点种转化子，筛选在有潮霉素条件下不生长，但在不含潮霉素条件下生长的菌株即为最终得到的TEC1基因原位突变为TEC1^T273M突变基因的酿酒酵母突变株，该菌株命名为BSWT-273。

实施例4：突变体菌株的葡萄糖木糖共发酵

将出发菌株BSGX001、重组菌株BSWT-273分别在葡萄糖木糖共发酵，比较木糖的利用，以及乙醇的生产速率和得率。

操作过程如下：分别将菌株接种到含20g/L葡萄糖的SC-URA培养基，30℃培养12-16h，转接菌株到装有50mL SC-URA培养基的300mL三角瓶中，碳源为20g/L葡萄糖，初始OD600为1.0，200rpm培养12h。5500rpm离心3分钟，用无菌水洗1-2次，重新悬浮在1mL发酵培养基中，初始OD600＝2.5,200rpm,发酵培养时间为48h。发酵培养基用酵母基础氮源1.7g/L YNB，5g/L(NH4)2SO4,20g/L葡萄糖和20g/L木糖为碳源进行葡萄糖木糖共糖发酵。

葡萄糖、木糖、乙醇的浓度的HPLC分析使用Bio-Rad公司LC-20A系统，层析柱使用 HPX-87H(Bio-Rad)，用Bio-Rad公司的RID-10A示差检测器检测。流动相为5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min，柱温箱温度保持45℃。菌体干重的测定通过离心收集菌体，烘干后称重测定。

结果显示(见图5)，表达突变基因TEC1^T273M突变基因的重组菌株BSWT-273，其在葡萄糖木糖共发酵中，菌株的生长显著优于对照菌株，木糖的利用，以及乙醇的生产速率均显著高于对照菌株。其中，其中，BSWT-273比出发菌株BSGX001木糖利用速率提高125％，从0.183g/L/h，提高到0.413g/L/h；乙醇得率提高了50％。表明表达Tec1p^T273M突变体提高了菌株木糖利用能力。

序 列 表

<110>山东大学

<120>一种提高重组酿酒酵母菌株木糖利用能力的方法及其突变株

<141> 2019-4-9

<160> 46

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> Tec1p

<400> 1

MSLKEDDFGK DNSRNIESYT GRIFDVYIQK DSYSQSALDD MFPEAVVSTA ACVKNEAEDN 60

INLIDTHPQF ELVNTGLGAK SDDLKSPSAK ATFTDKQRKN EVPNISVSNY FPGQSSETSS 120

TTESWTIGCD KWSEKVEEAF LEALRLIMKN GTTKIKIRNA NFGRNELISL YIKHKTNEFR 180

TKKQISSHIQ VWKKTIQNKI KDSLTLSSKE KELLHLIEHG AEQTTENSNL FYDIFEEIID 240

SLPSVSDSGS LTPKNLYVSN NSSGLSVHSK LLTPITASNE KKIENFIKTN AASQAKTPLI 300

YAKHIYENID GYKCVPSKRP LEQLSPTELH QGDRPNKASF SNKKAILESA KKIEIEQRKI 360

INKYQRISRI QEHESNPEFS SNSNSGSEYE SEEEVVPRSA TVTQLQSRPV PYYKNNGMPY 420

SLSKVRGRPM YPRPAEDAYN ANYIQGLPQY QTSYFSQLLL SSPQHYEHSP HQRNFTPSNQ 480

SHGNFY 486

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> Tec1pT273M

<400> 2

MSLKEDDFGK DNSRNIESYT GRIFDVYIQK DSYSQSALDD MFPEAVVSTA ACVKNEAEDN 60

INLIDTHPQF ELVNTGLGAK SDDLKSPSAK ATFTDKQRKN EVPNISVSNY FPGQSSETSS 120

TTESWTIGCD KWSEKVEEAF LEALRLIMKN GTTKIKIRNA NFGRNELISL YIKHKTNEFR 180

TKKQISSHIQ VWKKTIQNKI KDSLTLSSKE KELLHLIEHG AEQTTENSNL FYDIFEEIID 240

SLPSVSDSGS LTPKNLYVSN NSSGLSVHSK LLMPITASNE KKIENFIKTN AASQAKTPLI 300

YAKHIYENID GYKCVPSKRP LEQLSPTELH QGDRPNKASF SNKKAILESA KKIEIEQRKI 360

INKYQRISRI QEHESNPEFS SNSNSGSEYE SEEEVVPRSA TVTQLQSRPV PYYKNNGMPY 420

SLSKVRGRPM YPRPAEDAYN ANYIQGLPQY QTSYFSQLLL SSPQHYEHSP HQRNFTPSNQ 480

SHGNFY 486

<210> 3

<211>1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> TEC1T273M

<400> 3

atgagtctta aagaagacga ctttggcaag gataattcta gaaatataga atcatatact 60

ggtagaattt ttgacgtata tatacaaaaa gattcgtatt cacagtcggc cttggatgat 120

atgtttccag aagccgtagt ttcaaccgcc gcttgtgtga aaaatgaagc ggaggataac 180

atcaatctca tagacacgca tcctcaattc gaactggtaa atactggact gggtgctaaa 240

tcggacgatt tgaaatctcc atcagcaaag gctacgttca ctgacaagca gaggaagaat 300

gaagtaccaa atatatctgt gagcaactac tttcccggac aaagtagcga aacgtcgtca 360

acaacggaat cttggactat cggttgtgat aagtggtcag aaaaggtaga agaggcattc 420

cttgaggcac ttagactgat aatgaaaaat gggaccacaa aaataaaaat aagaaatgcc 480

aattttggaa gaaacgagct gatttcatta tatatcaagc acaaaaccaa cgagttcaga 540

accaaaaagc aaatttcttc ccatattcaa gtctggaaga agaccataca aaacaaaatc 600

aaggactcgc tgaccctatc atcaaaggag aaggagcttc tacaccttat cgaacatggc 660

gctgaacaaa ctactgaaaa ctcaaacctg ttttatgaca tatttgaaga aattatcgac 720

tctctacctt cagtcagtga ttctggaagt ttaaccccta aaaacctcta tgtaagtaat 780

aatagcagtg gattgtcagt acattcaaaa ctgcttaugc caatcactgc ttccaacgag 840

aaaaaaattg aaaatttcat aaaaactaat gctgcatctc aagccaaaac ccccctcatt 900

tacgctaagc acatttatga aaacatagac ggctacaagt gcgttccgtc aaagaggcct 960

cttgaacaac tttcccccac ggaactccac cagggagatc gccccaataa ggctagcttt 1020

tccaacaaga aggcaatcct ggagagtgca aaaaaaatcg aaatagagca gagaaagata 1080

atcaacaaat accaaagaat ttcccgcata caagaacatg aaagtaatcc tgagttcagt 1140

tccaattcca attccggttc agagtacgaa tcggaggaag aagtagtccc aagatcagcc 1200

acagtcacac aactccaaag cagaccagtg ccatactaca agaataatgg aatgccctac 1260

tcactctcca aagtacgagg aaggcccatg tatccaagac ctgctgaaga tgcttacaat 1320

gccaattata ttcaaggtct gccccagtac caaacatctt atttttcgca gctgttatta 1380

tcatcacccc agcattacga acattctcca catcaaagga actttacgcc atccaaccaa 1440

tcgcatggga acttttatta a 1461

<210> 4

<211> 839

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 图2中片段1的核苷酸片段

<400> 4

atgagtctta aagaagacga ctttggcaag gataattcta gaaatataga atcatatact 60

ggtagaattt ttgacgtata tatacaaaaa gattcgtatt cacagtcggc cttggatgat 120

atgtttccag aagccgtagt ttcaaccgcc gcttgtgtga aaaatgaagc ggaggataac 180

atcaatctca tagacacgca tcctcaattc gaactggtaa atactggact gggtgctaaa 240

tcggacgatt tgaaatctcc atcagcaaag gctacgttca ctgacaagca gaggaagaat 300

gaagtaccaa atatatctgt gagcaactac tttcccggac aaagtagcga aacgtcgtca 360

acaacggaat cttggactat cggttgtgat aagtggtcag aaaaggtaga agaggcattc 420

cttgaggcac ttagactgat aatgaaaaat gggaccacaa aaataaaaat aagaaatgcc 480

aattttggaa gaaacgagct gatttcatta tatatcaagc acaaaaccaa cgagttcaga 540

accaaaaagc aaatttcttc ccatattcaa gtctggaaga agaccataca aaacaaaatc 600

aaggactcgc tgaccctatc atcaaaggag aaggagcttc tacaccttat cgaacatggc 660

gctgaacaaa ctactgaaaa ctcaaacctg ttttatgaca tatttgaaga aattatcgac 720

tctctacctt cagtcagtga ttctggaagt ttaaccccta aaaacctcta tgtaagtaat 780

aatagcagtg gattgtcagt acattcaaaa ctgcttatgc caatcactgc ttccaacga 839

<210>5

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 图2中片段2的核苷酸片段

<400> 5

gtacattcaa aactgcttat gccaatcact gcttccaacg agaaaaaaat tgaaaatttc 60

ataaaaacta atgctgcatc tcaagccaaa acccccctca tttacgctaa gcacatttat 120

gaaaacatag acggctacaa gtgcgttccg tcaaagaggc ctcttgaaca actttccccc 180

acggaactcc accagggaga tcgccccaat aaggctagct tttccaacaa gaaggcaatc 240

ctggagagtg caaaaaaaat cgaaatagag cagagaaaga taatcaacaa ataccaaaga 300

atttcccgca tacaagaaca tgaaagtaat cctgagttca gttccaattc caattccggt 360

tcagagtacg aatcggagga agaagtagtc ccaagatcag ccacagtcac acaactccaa 420

agcagaccag tgccatacta caagaataat ggaatgccct actcactctc caaagtacga 480

ggaaggccca tgtatccaag acctgctgaa gatgcttaca atgccaatta tattcaaggt 540

ctgccccagt accaaacatc ttatttttcg cagctgttat tatcatcacc ccagcattac 600

gaacattctc cacatcaaag gaactttacg ccatccaacc aatcgcatgg gaacttttat 660

taacgctgca ggtcgacaac ccttaat 687

<210>6

<211> 1642

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 图2中片段3的核苷酸片段

<400> 6

caatcgcatg ggaactttta ttaacgctgc aggtcgacaa cccttaatat aacttcgtat 60

aatgtatgct atacgaagtt attaggtcta gagatctgtt tagcttgcct cgtccccgcc 120

gggtcacccg gccagcgaca tggaggccca gaataccctc cttgacagtc ttgacgtgcg 180

cagctcaggg gcatgatgtg actgtcgccc gtacatttag cccatacatc cccatgtata 240

atcatttgca tccatacatt ttgatggccg cacggcgcga agcaaaaatt acggctcctc 300

gctgcagacc tgcgagcagg gaaacgctcc cctcacagac gcgttgaatt gtccccacgc 360

cgcgcccctg tagagaaata taaaaggtta ggatttgcca ctgaggttct tctttcatat 420

acttcctttt aaaatcttgc taggatacag ttctcacatc acatccgaac ataaacaacc 480

atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 540

ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 600

ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 660

aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 720

accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 780

ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 840

gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 900

agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 960

gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 1020

cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 1080

aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 1140

gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 1200

ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 1260

tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tcagtactga caataaaaag attcttgttt 1320

tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt atattgtagt tgttctattt taatcaaatg 1380

ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg 1440

cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga 1500

ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga aaacgagctc tcgagaaccc ttaatataac 1560

ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt aggtgatatc agatccacta gtggggccca 1620

tgtctacata catacataca tc 1642

<210>7

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 图2中片段4的核苷酸片段

<400>7

atatcagatc cactagtggg gcccatgtct acatacatac atacatctcg tacataaata 60

cgcatacgta tcttcgtagt aagaaccgtc acagatatga ttgagcacgg tacaattatg 120

tattagtcaa acattaccag ttctcgaaca aaaccaaagc tactcctgca acactcttct 180

atcgcacatg tatggttctt attgtttccc gagttctttt ttactgacgc gccagaacga 240

gtaagaaagt tctctagcgc catgctgaaa tttttttcac ttcaacggac agcgattttt 300

tttctttttc ctccgaaata atgttgcagc ggttctcgat gcctcaagaa 350

<210>8

<211> 3382

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 图2中片段5的核苷酸片段

<400>8

atgagtctta aagaagacga ctttggcaag gataattcta gaaatataga atcatatact 60

ggtagaattt ttgacgtata tatacaaaaa gattcgtatt cacagtcggc cttggatgat 120

atgtttccag aagccgtagt ttcaaccgcc gcttgtgtga aaaatgaagc ggaggataac 180

atcaatctca tagacacgca tcctcaattc gaactggtaa atactggact gggtgctaaa 240

tcggacgatt tgaaatctcc atcagcaaag gctacgttca ctgacaagca gaggaagaat 300

gaagtaccaa atatatctgt gagcaactac tttcccggac aaagtagcga aacgtcgtca 360

acaacggaat cttggactat cggttgtgat aagtggtcag aaaaggtaga agaggcattc 420

cttgaggcac ttagactgat aatgaaaaat gggaccacaa aaataaaaat aagaaatgcc 480

aattttggaa gaaacgagct gatttcatta tatatcaagc acaaaaccaa cgagttcaga 540

accaaaaagc aaatttcttc ccatattcaa gtctggaaga agaccataca aaacaaaatc 600

aaggactcgc tgaccctatc atcaaaggag aaggagcttc tacaccttat cgaacatggc 660

gctgaacaaa ctactgaaaa ctcaaacctg ttttatgaca tatttgaaga aattatcgac 720

tctctacctt cagtcagtga ttctggaagt ttaaccccta aaaacctcta tgtaagtaat 780

aatagcagtg gattgtcagt acattcaaaa ctgcttatgc caatcactgc ttccaacgag 840

aaaaaaattg aaaatttcat aaaaactaat gctgcatctc aagccaaaac ccccctcatt 900

tacgctaagc acatttatga aaacatagac ggctacaagt gcgttccgtc aaagaggcct 960

cttgaacaac tttcccccac ggaactccac cagggagatc gccccaataa ggctagcttt 1020

tccaacaaga aggcaatcct ggagagtgca aaaaaaatcg aaatagagca gagaaagata 1080

atcaacaaat accaaagaat ttcccgcata caagaacatg aaagtaatcc tgagttcagt 1140

tccaattcca attccggttc agagtacgaa tcggaggaag aagtagtccc aagatcagcc 1200

acagtcacac aactccaaag cagaccagtg ccatactaca agaataatgg aatgccctac 1260

tcactctcca aagtacgagg aaggcccatg tatccaagac ctgctgaaga tgcttacaat 1320

gccaattata ttcaaggtct gccccagtac caaacatctt atttttcgca gctgttatta 1380

tcatcacccc agcattacga acattctcca catcaaagga actttacgcc atccaaccaa 1440

tcgcatggga acttttatta acgctgcagg tcgacaaccc ttaatataac ttcgtataat 1500

gtatgctata cgaagttatt aggtctagag atctgtttag cttgcctcgt ccccgccggg 1560

tcacccggcc agcgacatgg aggcccagaa taccctcctt gacagtcttg acgtgcgcag 1620

ctcaggggca tgatgtgact gtcgcccgta catttagccc atacatcccc atgtataatc 1680

atttgcatcc atacattttg atggccgcac ggcgcgaagc aaaaattacg gctcctcgct 1740

gcagacctgc gagcagggaa acgctcccct cacagacgcg ttgaattgtc cccacgccgc 1800

gcccctgtag agaaatataa aaggttagga tttgccactg aggttcttct ttcatatact 1860

tccttttaaa atcttgctag gatacagttc tcacatcaca tccgaacata aacaaccatg 1920

ggtaaggaaa agactcacgt ttcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 1980

tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 2040

tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 2100

gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 2160

atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggc 2220

aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 2280

ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 2340

gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 2400

agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 2460

aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 2520

cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 2580

gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 2640

cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 2700

catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gtactgacaa taaaaagatt cttgttttca 2760

agaacttgtc atttgtatag tttttttata ttgtagttgt tctattttaa tcaaatgtta 2820

gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag ttaagtgcgc 2880

agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg ctgtcgattc 2940

gatactaacg ccgccatcca gtgtcgaaaa cgagctctcg agaaccctta atataacttc 3000

gtataatgta tgctatacga agttattagg tgatatcaga tccactagtg gggcccatgt 3060

ctacatacat acatacatct cgtacataaa tacgcatacg tatcttcgta gtaagaaccg 3120

tcacagatat gattgagcac ggtacaatta tgtattagtc aaacattacc agttctcgaa 3180

caaaaccaaa gctactcctg caacactctt ctatcgcaca tgtatggttc ttattgtttc 3240

ccgagttctt ttttactgac gcgccagaac gagtaagaaa gttctctagc gccatgctga 3300

aatttttttc acttcaacgg acagcgattt tttttctttt tcctccgaaa taatgttgca 3360

gcggttctcg atgcctcaag aa 3382

<210>9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物RAGRE31s

<400>9

cttgcatgca tttaaatggg cgcattacta caag 34

<210>10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物RAGRE31a

<400>10

gcaggttagg atccggaaac aagtatagaa tctagag 37

<210>11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物RAGRE32s

<400>11

atcctaacct gcaggaatcg ccttcaaata tgttcca 37

<210>12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物RAGRE32a

<400>12

ccgcaattga tttaaatctt gaatcaagct tccct 35

<210>13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTPI1ps

<400>13

cgaagatctg actgattgtg agggagacct aact 34

<210>14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTPI1pa

<400>14

ggcagccatt tttagtttat gtatgtgttt tttgtag 37

<210>15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPRKI1s

<400>15

ctaaaaatgg ctgccggtgt cccaaaaatt gatgc 35

<210>16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPRKI1a

<400>16

atacctgcag gttaggatcc agggtcttgt tgaaggatta tc 42

<210>17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPPGK1ps

<400>17

tcctgatcat tttggcttca ccctcatact 30

<210>18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPPGK1pa

<400>18

gacattgttt tatatttgtt gtaaaaagta gataattact 40

<210>19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTAL1s

<400>19

tataaaacaa tgtctgaacc agctcaaaag aaacaa 36

<210>20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTAL1a

<400>20

tatcctgcag gattggtacc gattgtgatg gccggtattg cta 43

<210>21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPFBA1ps

<400>21

ataggtacca taacaatact gacagtacta aataat 36

<210>22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPFBA1pa

<400>22

cattttgaat atgtattact tggttatggt ta 32

<210>23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTKL1s

<400>23

gtaatacata ttcaaaatga ctcaattcac tgacattgat 40

<210>24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPTKL1a

<400>24

attcctgcag gttaggatcc atgtgctggt acaaggaaaa ag 42

<210>25

<211>34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPADH1ps

<400>25

attagatctt tgcgatgatg acgaccacga caac 34

<210>26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPADH1pa

<400>26

attggtttga ccattgtata tgagatagtt gattgta 37

<210>27

<211>37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPRPE1s

<400>27

actatctcat atacaatggt caaaccaatt atagctc 37

<210>28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPRPE1a

<400>28

attcctgcag gttaggatcc gaagccttat ggagtgtcat tg 42

<210>29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPKans

<400>29

taaggatccc agctgaagct tcgtacgct 29

<210>30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物XPKana

<400>30

tatcctgcag gcataggcca ctagtggatc tg 32

<210>31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物dCOX4s

<400>31

cagccacaag aactttgtgt agctctagat atctgcttca gctgaagctt cgtacgctg 59

<210>32

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物dCOX4a

<400>32

caacagggtt tagtttgtaa acagaaccac attcccagca taggccacta gtggatctg 59

<210>33

<211> 11527

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> YEp-CH

<400>33

gaattctgaa ccagtcctaa aacgagtaaa taggaccggc aattcttcaa gcaataaaca 60

ggaataccaa ttattaaaag ataacttagt cagatcgtac aataaagctt tgaagaaaaa 120

tgcgccttat tcaatctttg ctataaaaaa tggcccaaaa tctcacattg gaagacattt 180

gatgacctca tttctttcaa tgaagggcct aacggagttg actaatgttg tgggaaattg 240

gagcgataag cgtgcttctg ccgtggccag gacaacgtat actcatcaga taacagcaat 300

acctgatcac tacttcgcac tagtttctcg gtactatgca tatgatccaa tatcaaagga 360

aatgatagca ttgaaggatg agactaatcc aattgaggag tggcagcata tagaacagct 420

aaagggtagt gctgaaggaa gcatacgata ccccgcatgg aatgggataa tatcacagga 480

ggtactagac tacctttcat cctacataaa tagacgcata taagtacgca tttaagcata 540

aacacgcact atgccgttct tctcatgtat atatatatac aggcaacacg cagatatagg 600

tgcgacgtga acagtgagct gtatgtgcgc agctcgcgtt gcattttcgg aagcgctcgt 660

tttcggaaac gctttgaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 720

ttcagagcgc ttttgaaaac caaaagcgct ctgaagacgc actttcaaaa aaccaaaaac 780

gcaccggact gtaacgagct actaaaatat tgcgaatacc gcttccacaa acattgctca 840

aaagtatctc tttgctatat atctctgtgc tatatcccta tataacctac ccatccacct 900

ttcgctcctt gaacttgcat ctaaactcga cctctacatt ttttatgttt atctctagta 960

ttactcttta gacaaaaaaa ttgtagtaag aactattcat agagtgaatc gaaaacaata 1020

cgaaaatgta aacatttcct atacgtagta tatagagaca aaatagaaga aaccgttcat 1080

aattttctga ccaatgaaga atcatcaacg ctatcacttt ctgttcacaa agtatgcgca 1140

atccacatcg gtatagaata taatcgggga tgcctttatc ttgaaaaaat gcacccgcag 1200

cttcgctagt aatcagtaaa cgcgggaagt ggagtcaggc tttttttatg gaagagaaaa 1260

tagacaccaa agtagccttc ttctaacctt aacggaccta cagtgcaaaa agttatcaag 1320

agactgcatt atagagcgca caaaggagaa aaaaagtaat ctaagatgct ttgttagaaa 1380

aatagcgctc tcgggatgca tttttgtaga acaaaaaaga agtatagatt ctttgttggt 1440

aaaatagcgc tctcgcgttg catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga ttctttgttt 1500

gaaaaattag cgctctcgcg ttgcattttt gttttacaaa aatgaagcac agattcttcg 1560

ttggtaaaat agcgctttcg cgttgcattt ctgttctgta aaaatgcagc tcagattctt 1620

tgtttgaaaa attagcgctc tcgcgttgca tttttgttct acaaaatgaa gcacagatgc 1680

ttcgttaaca aagatatgct attgaagtgc aagatggaaa cgcagaaaat gaaccgggga 1740

tgcgacgtgc aagattacct atgcaataga tgcaatagtt tctccaggaa ccgaaataca 1800

tacattgtct tccgtaaagc gctagactat atattattat acaggttcaa atatactatc 1860

tgtttcaggg aaaactccca ggttcggatg ttcaaaattc aatgatgggt aacaagtacg 1920

atcgtaaatc tgtaaaacag tttgtcggat attaggctgt atctcctcaa agcgtattcg 1980

aatatcattg agaagctgca gcgtcacatc ggataataat gatggcagcc attgtagaag 2040

tgccttttgc atttctagtc tctttctcgg tctagctagt tttactacat cgcgaagata 2100

gaatcttaga tcacactgcc tttgctgagc tggatcaata gagtaacaaa agagtggtaa 2160

ggcctcgtta aaggacaagg acctgagcgg aagtgtatcg tacagtagac ggagtatact 2220

agtatagtct atagtccgtg gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagcttttc 2280

aattcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt tgaaattttt 2340

ttgattcggt aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg 2400

tatatatacg catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac 2460

tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg 2520

aacgtgctgc tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc atgcacgaaa 2580

agcaaacaaa cttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta ctggagttag 2640

ttgaagcatt aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc ttgactgatt 2700

tttccatggc ggattagaag ccgccgagcg ggtgacagcc ctccgaagga agactctcct 2760

ccgtgcgtcc tcgtcttcac cggtcgcgtt cctgaaacgc agatgtgcct cgcgccgcac 2820

tgctccgaac aataaagatt ctacaatact agcttttatg gttatgaaga ggaaaaattg 2880

gcagtaacct ggccccacaa accttcaaat gaacgaatca aattaacaac cataggatga 2940

taatgcgatt agttttttag ccttatttct ggggtaatta atcagcgaag cgatgatttt 3000

tgatctatta acagatatat aaatgcaaaa actgcataac cactttaact aatactttca 3060

acattttcgg tttgtattac ttcttattca aatgtaataa aagtatcaac aaaaaattgt 3120

taatatacct ctatacttta acgtcaagga gaaaaaaccc cggattctag aactagtgga 3180

tcccccgggc tgcaggaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgaggg gcagagccga 3240

tcctgtacac tttacttaaa accattatct gagtgttaaa tgtccaattt actgaccgta 3300

caccaaaatt tgcctgcatt accggtcgat gcaacgagtg atgaggttcg caagaacctg 3360

atggacatgt tcagggatcg ccaggcgttt tctgagcata cctggaaaat gcttctgtcc 3420

gtttgccggt cgtgggcggc atggtgcaag ttgaataacc ggaaatggtt tcccgcagaa 3480

cctgaagatg ttcgcgatta tcttctatat cttcaggcgc gcggtctggc agtaaaaact 3540

atccagcaac atttgggcca gctaaacatg cttcatcgtc ggtccgggct gccacgacca 3600

agtgacagca atgctgtttc actggttatg cggcggatcc gaaaagaaaa cgttgatgcc 3660

ggtgaacgtg caaaacaggc tctagcgttc gaacgcactg atttcgacca ggttcgttca 3720

ctcatggaaa atagcgatcg ctgccaggat atacgtaatc tggcatttct ggggattgct 3780

tataacaccc tgttacgtat agccgaaatt gccaggatca gggttaaaga tatctcacgt 3840

actgacggtg ggagaatgtt aatccatatt ggcagaacga aaacgctggt tagcaccgca 3900

ggtgtagaga aggcacttag cctgggggta actaaactgg tcgagcgatg gatttccgtc 3960

tctggtgtag ctgatgatcc gaataactac ctgttttgcc gggtcagaaa aaatggtgtt 4020

gccgcgccat ctgccaccag ccagctatca actcgcgccc tggaagggat ttttgaagca 4080

actcatcgat tgatttacgg cgctaaggat gactctggtc agagatacct ggcctggtct 4140

ggacacagtg cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc gcgctggagt ttcaataccg 4200

gagatcatgc aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg tcatgaacta tatccgtacc 4260

ctggatagtg aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag atggcgatta gccattaacg 4320

cgtaaatgat tgctataatt atttgatatt tatggtgaca tatgagaaag gatttcaaca 4380

tcgacggaaa atatgtagtg ctgtctgtaa gcactaatat tcagtcgcca gccgtcattg 4440

tcactgtaaa gctgagcgat agaatgcctg atattgactc aatatccgtt gcgtttcctg 4500

tcaaaagtat gcgtagtgct gaacatttcg tgatgaatgc caccgaggaa gaagcacggc 4560

gcggttttgc ntaaagtgat gtctgagttt ggcgaactct tgggtaaggt tggaattgtc 4620

gacctcgagt catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg 4680

ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 4740

tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 4800

gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 4860

cgaaggcttt aatttgcggc cggtaccgac atggaggccc agaataccct ccttgacagt 4920

cttgacgtgc gcagctcagg ggcatgatgt gactgtcgcc cgtacattta gcccatacat 4980

ccccatgtat aatcatttgc atccatacat tttgatggcc gcacggcgcg aagcaaaaat 5040

tacggctcct cgctgcagac ctgcgagcag ggaaacgctc ccctcacaga cgcgttgaat 5100

tgtccccacg ccgcgcccct gtagagaaat ataaaaggtt aggatttgcc actgaggttc 5160

ttctttcata tacttccttt taaaatcttg ctaggataca gttctcacat cacatccgaa 5220

cataaacaac cctattcctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg 5280

gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta 5340

cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct 5400

gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc 5460

atatacgccc ggagccgcgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc 5520

gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat 5580

tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc 5640

gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc 5700

tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc 5760

atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat 5820

gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga 5880

tcggccgcag cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct gcagaacagc gggcagttcg 5940

gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg 6000

ctctcgctga attccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag 6060

tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca 6120

tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc 6180

atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg 6240

agttcaggct ttttcatact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac ttgtcatttg 6300

tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg atttatattt 6360

tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa gtaatatcat 6420

gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgggtac cccatggagg gcacagttaa 6480

gccgctaaag gcattatccg ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc 6540

tgacattggt aatacagtca aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg 6600

ggcagacatt acgaatgcac acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca 6660

ggcggcagaa gaagtaacaa aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg 6720

caagggctcc ctatctactg gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga 6780

caaagatttt gttatcggct ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta 6840

cgattggttg attatgacac ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca 6900

acagtataga accgtggatg atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag 6960

aggactattt gcaaagggaa gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg 7020

ctgggaagca tatttgagaa gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa 7080

tgcatgtata ctaaactcac aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccgg 7140

gaatctcggt cgtaatgatt tttataatga cgaaaaaaaa aaaattggaa agaaaaagct 7200

ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc 7260

taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt 7320

ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag 7380

tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct 7440

cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc 7500

cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac acccgtcctg tggatcctct acgccggacg 7560

catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 7620

caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 7680

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 7740

ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 7800

gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt 7860

ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca 7920

actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg 7980

gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca 8040

agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg 8100

catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc 8160

cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat 8220

gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct 8280

taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc 8340

gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc 8400

cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag ccggcggcac 8460

ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg 8520

aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc cagcagccgc 8580

acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg 8640

tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg 8700

atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca 8760

tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc 8820

accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca 8880

tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc 8940

cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta 9000

acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat 9060

tcccccttac acggaggcat caagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 9120

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 9180

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 9240

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 9300

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 9360

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 9420

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 9480

accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 9540

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 9600

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 9660

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 9720

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 9780

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 9840

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 9900

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 9960

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 10020

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 10080

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 10140

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 10200

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 10260

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 10320

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 10380

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 10440

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 10500

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 10560

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 10620

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 10680

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 10740

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc 10800

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 10860

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 10920

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 10980

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 11040

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca 11100

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 11160

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 11220

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 11280

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 11340

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 11400

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 11460

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 11520

tcttcaa 11527

<210>34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物TEF1ps

<400>34

tatggtacca caatgcatac tttgtacgtt caaaat 36

<210>35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物TEF1pa

<400>35

tgtggatcct ttgtaattaa aacttagatt agattg 36

<210>36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物PGK1ts

<400>36

atcctgcagg attgaattga attgaaatcg ataga 35

<210>37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物PGK1ta

<400>37

ctcgaaagct ttaacgaacg cagaattttc gagt 34

<210>38

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Ru-xylA

<400>38

atggcaaaag aatattttcc gtttactggt aaaattcctt tcgagggaaa ggatagtaaa 60

aatgtaatgg ctttccatta ttacgagccc gagaaagtcg tgatgggaaa gaagatgaag 120

gactggctga agttcgcaat ggcctggtgg cacacactgg gaggcgcttc tgcagaccag 180

ttcggtggtc aaactcgcag ctatgagtgg gacaaggctg aatgccccgt acagcgtgca 240

aaggataaga tggacgctgg tttcgagatc atggataagc tgggtatcga gtacttctgc 300

ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360

aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420

tggggtaccg caaacgtatt cggcaacaag cgttatgcca atggcgcttc taccaacccc 480

gatttcgatg tggttgctcg tgcgattgtt cagatcaaga actctatcga cgctaccatc 540

aagcttggtg gtaccaacta tgtgttctgg ggtggtcgtg agggctacat gagcctgttg 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggctacga tgctgggtat ggctcgtgac 660

tatgctcgcg ctaagggatt caagggtacg ttcctgattg agccgaagcc gatggagcct 720

tcaaagcacc agtatgatgt ggacacagag accgtgattg gcttcctgaa ggcacatggt 780

ctggataagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ctacattggc tggtcacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg tgctgttgac gctggtatgc tgggttctat cgacgctaac 900

cgcggtgatg cccagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa ctttgagctg 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaac ggtggtctgg gcaatggcgg taccaatttc 1020

gacgccaaga tccgtcgtaa ttctaccgac ctcgaggatc tcttcatcgc tcatatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgccctgatg aatgcagccg atattcttga gaactctgaa 1140

ctgcccgcaa tgaagaaggc tcgctacgca agcttcgaca gcggtatcgg taaggacttc 1200

gaggatggca agctgacctt cgagcaggtt tacgagtatg gtaagaaggt tgaagagccg 1260

aagcagacct ctggcaagca ggagaagtac gagacaatcg tcgccctcca ctgcaaataa 1320

<210>39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-1

<400>39

atgagtctta aagaagacga ctttg 25

<210>40

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-2

<400>40

tcgttggaag cagtgattgg cataagcagt tttgaatgta ctgacaatcc ac 52

<210>41

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-3

<400>41

gtacattcaa aactgcttat gccaatcact gcttccaacg agaaaaaaat tg 52

<210>42

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-4

<400>42

attaagggtt gtcgacctgc agcgttaata aaagttccca tgcgattg 48

<210>43

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-5

<400>43

caatcgcatg ggaactttta ttaacgctgc aggtcgacaa ccc 43

<210>44

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-6

<400>44

gatgtatgta tgtatgtaga catgggcccc actagtggat ctg 43

<210>45

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-7

<400>45

atatcagatc cactagtggg gcccatgtct acatacatac atacatc 47

<210>46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物tec1-8

<400>46

ttcttgaggc atcgagaacc 20