本发明涉及分子生物技术及医药卫生领域，具体而言，涉及一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂、试剂盒及应用与提取方法。
背景技术：
：目前，总dna提取试剂盒主要是针对组织、血液、以及动物分泌物中基因组dna、线粒体dna或是其中病毒dna的抽取，专门针对寄主细胞及病原细菌总dna提取的试剂盒非常少，且抽提效率低。在寄主和寄生菌互作研究中，有效获得细胞与寄生菌整体的dna或是rna显得尤为重要。经实验证实，目前研发的抽提寄主和寄生菌总核酸dna实验方法抽提细胞及其寄生菌的总dna含量较低(1.5×106果蝇s2细胞及其中的寄生菌提取量为200～500ng)，无法满足实验对提取效率和质量的需要。技术实现要素：本申请实施例提供了一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂、试剂盒及应用与提取方法，能较好的提高样本总dna的提取效率和质量，满足实验研究或是相关检测的需求。为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：本申请第一方面，提供了一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂，提取试剂包括蛋白酶k和溶菌酶。在实施例中，通过溶菌酶和蛋白酶k的共同作用，能同时消解细胞和寄生菌结构，提高总dna提取效率的目的，同时能有效降解细胞中的蛋白等，避免影响dna的提取质量。溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。蛋白酶k是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是dna提取的关键试剂。该酶在较广的ph范围(4-12.5)内及高温(50-70℃)下均有活性，可用于质粒或基因组dna、rna的分离。在dna提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使dna游离在溶液中，以便随后进一步抽提dna。在前述第一方面的一些实施例中，提取试剂还包括tris-cl饱和酚溶液、edta、氯仿、异戊醇以及te缓冲液。在实施例中，提取dna的过程中，需要保证dna不被酶降解，或者其他因素影响，选择缓冲液，能较好的起到保护dna的作用，同时试剂能使一些酶类变性导致其失活。本申请第二方面，提供了上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在提取细胞-寄生菌总dna中的应用。本申请第三方面，提供了上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在制备细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒中的应用。本申请第四方面，提供了一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒，提取试剂包括蛋白酶k和溶菌酶。在实施例中，该试剂盒通过溶菌酶和蛋白酶k的共同作用，能同时消解细胞和寄生菌结构，达到提高总dna含量的目的，同时能将细胞中的蛋白等降解，避免蛋白影响dna的提取。在前述第四方面的一些实施例中，提取试剂盒还包括提取细胞-寄生菌总dna的缓冲试剂，缓冲试剂由tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇以及te溶液中的至少一种制得。在实施例中，通过tris-cl饱和酚溶液、氯仿、edta、乙醇、异戊醇以及te溶液制备各种提取总dna的试剂，能够抑制并将细胞内的蛋白以及各种酶变性，起到保护dna的目的；同时也能避免外来污染，保证提取的dna的纯度。本申请第五方面，提供了上述细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒在提取细胞-寄生菌总dna中的应用。本申请第六方面，提供了一种细胞-寄生菌总dna的提取方法，包括以下步骤：将蛋白酶k、edta和溶菌酶与te缓冲液混合制备成裂解液；将tris-cl饱和酚溶液和乙醇制成缓冲液il；将tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇制备得到缓冲液gw1；将氯仿、乙醇和异戊醇制备得到缓冲液gw2；将细胞-寄生菌样本用裂解液水浴消化，加入缓冲液il后混匀，得到混合样；将混合样加入到带有收集管的离心柱里，离心并弃滤液；加入缓冲液gw1到离心柱上，离心并弃滤液，加入缓冲液gw2到离心柱，离心并弃滤液，加入75％的乙醇离心洗离心柱并离心去除残液，将缓冲液te滴加到离心柱并离心得到细胞-寄生菌样本总dna。在实施例中，将样本收集于离心管中，用溶菌酶和蛋白酶k制成的裂解液，将细胞和寄生菌一起进行裂解，将细胞内的dna释放出来；然后通过饱和酚、氯仿和异戊醇等溶液制备的缓冲液将蛋白变性，保护dna，然后通过dna和蛋白质在不同相中的溶解性，通过离心能很好的将蛋白质和dna分离。另外在单独用乙醇分离dna的时候，加入单价的阳离子如氯化钠、醋酸钠等，钠离子能与dna上的负电荷进行中和，易于聚集沉淀，方便后续离心提纯。在前述第六方面的一些实施例中，水浴消化的温度为35-39℃，时间为110-140min。在实施例中，通过110-140min的消化，能保证细胞中的dna完全释放，保证dna的数量，提高最终的提取量。在前述第六方面的一些实施例中，去除残液后，还包括静置3-5min。在实施例中，通过静置，让离心管的水分蒸发，进行干燥，同时乙醇蒸发也有利于后续dna的溶解。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的细胞-寄生菌总dna的提取试剂、试剂盒及应用与提取方法，通过融合溶菌酶和蛋白酶k，配制成提取缓冲液，并制备成试剂盒，能较好的提高细胞-寄生菌总dna提取的总量，并且能提高提取的纯度；具有较好的实际应用价值。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的使用范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂，提取试剂包括蛋白酶k和溶菌酶。溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。蛋白酶k是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是dna提取的关键试剂。可以将上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在提取细胞-寄生菌总dna中应用。可以将上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在制备细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒中应用。实施例2本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂，包括蛋白酶k和溶菌酶；提取试剂还包括tris-cl饱和酚溶液、氯仿、异戊醇以及te缓冲液。可以将上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在提取细胞-寄生菌总dna中应用。可以将上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂在制备细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒中应用。实施例3本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒，提取试剂包括蛋白酶k和溶菌酶。当然试剂盒还可以包括提取细胞-寄生菌总dna的缓冲试剂，缓冲试剂由tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇以及te溶液中的至少一种制得。可以将上述的细胞-寄生菌总dna的提取试剂盒在提取细胞-寄生菌总dna中应用。实施例4本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取方法，该提取方法包括以下步骤：1.1将溶菌酶干粉用te缓冲液配置成20mg/ml的溶菌酶液；1.2将edta溶液制备成缓冲液itl，并将230μl的itl缓冲液、180μl的溶菌酶液和20μl的蛋白酶k溶液混合后作为裂解液，将tris-cl饱和酚溶液和乙醇制成缓冲液il；将tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇制备得到缓冲液gw1；将氯仿、乙醇和异戊醇制备得到缓冲液gw2；1.3将含有细菌的果蝇s2细胞收集于1.5ml离心管中，加入裂解液，35℃水浴消化110min；1.4消化结束后，加入500μl的缓冲液il，到1.5ml离心管中，涡旋混匀30s；1.5将带滤膜的离心柱放置到新的2ml离心管中，将步骤1.4中的混合溶液，加入到离心柱10000g离心60s；1.6弃掉2ml离心管中的滤液，将离心柱放回2ml离心管，加入500μl的缓冲液gw1，10000g离心60s；1.7弃滤液，离心柱放回离心管，加入500μl的缓冲液gw2，10000g离心60s；1.8弃掉滤液，加入75％的乙醇至离心柱，10000g离心60s；1.9弃滤液，将离心柱放回离心管，13000g离心180s；1.10弃滤液，静置离心柱180s；1.1将离心柱放回新的离心管中，加入50μl预热至60℃的缓冲液te，静置180s，10000g离心60s，得到细胞-寄生菌总dna样品。实施例5本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取方法，该提取方法包括以下步骤：1.1将溶菌酶干粉用缓冲液te配置成25mg/ml的溶菌酶液；1.2将edta溶液制备成缓冲液itl，并将230μl的itl缓冲液、180μl的溶菌酶液和20μl的蛋白酶k溶液混合后作为裂解液，将tris-cl饱和酚溶液和乙醇制成缓冲液il；将tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇制备得到缓冲液gw1；将氯仿、乙醇和异戊醇制备得到缓冲液gw2；1.3将含有细菌的果蝇s2细胞收集于1.5ml离心管中，加入裂解液，37℃水浴消化120min；1.4消化结束后，加入500μl的缓冲液il，到1.5ml离心管中，涡旋混匀30s；1.5将带滤膜的离心柱放置到新的2ml离心管中，将步骤1.4中的混合溶液，加入到离心柱10000g离心60s；1.6弃掉2ml离心管中的滤液，将离心柱放回2ml离心管，加入500μl的缓冲液gw1，10000g离心60s；1.7弃滤液，离心柱放回离心管，加入550μl的缓冲液gw2，10000g离心60s；1.8弃掉滤液，加入75％的乙醇至离心柱，10000g离心60s；1.9弃滤液，将离心柱放回离心管，13000g离心200s；1.10弃滤液，静置离心柱300s；1.1将离心柱放回新的离心管中，加入50μl预热至60℃的te缓冲液，静置180s，10000g离心60s，得到细胞-寄生菌总dna样品。实施例6本实施例提供一种细胞-寄生菌总dna的提取方法，该提取方法包括以下步骤：1.1将溶菌酶干粉用缓冲液te配置成30mg/ml的溶菌酶液；1.2将edta溶液制备成缓冲液itl，并将缓冲液itl230μl、溶菌酶液180μl和蛋白酶k溶液20μl作为裂解液，将将tris-cl饱和酚溶液和乙醇制成缓冲液il；将tris-cl饱和酚溶液、氯仿、乙醇、异戊醇制备得到缓冲液gw1；将氯仿、乙醇和异戊醇制备得到缓冲液gw2；1.3将含有细菌的果蝇s2细胞收集于1.5ml离心管中，加入裂解液，39℃水浴消化140min；1.4消化结束后，加入550μl的缓冲液il，到1.5ml离心管中，涡旋混匀45s；1.5将带滤膜的离心柱放置到新的2ml离心管中，将步骤1.4中的混合溶液，加入到离心柱11000g离心70s；1.6弃掉2ml离心管中的滤液，将离心柱放回2ml离心管，加入550μl的缓冲液gw1，10000g离心60s；1.7弃滤液，离心柱放回离心管，加入550μl的缓冲液gw2，11000g离心60s；1.8弃掉滤液，加入75％的乙醇至离心柱，11000g离心60s；1.9弃滤液，将离心柱放回离心管，13000g离心180s；1.10弃滤液，静置离心柱240s；1.1将离心柱放回新的离心管中，加入50μl预热至60℃的缓冲液ae，静置180s，10000g离心60s，得到细胞-寄生菌总dna样品。实验例本实验例以实施例3提供的细胞-寄生菌总dna的试剂盒以及实施例6提供的细胞-寄生菌总dna的提取方法进行总dna的提取，并以美基生物hipureinsectdnakits试剂盒提供及提取方法提取总dna。以1.5×106个果蝇s2细胞及一定量的寄生菌为样本，进行提取，结果如表1所示。表1dna含量对比产品提取总dna含量本实施例试剂盒及提取方法300ng/μl-1000ng/μl对比例10ng/μl-50ng/μl从表1可以看出，本发明提供的试剂盒及提取方法，能较大的提高提取的总dna的含量，明显比对比例高出一个数量级，含量明显提高。综上所述，本发明实施例提供的一种细胞-寄生菌总dna的提取试剂、试剂盒及应用与提取方法能够提取高质量的细胞-寄生菌总dna。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12