一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用与流程

本发明属于重组基因、原生质体疫苗技术领域，涉及一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用。

背景技术：

结核病是由结分枝核杆菌(mycobacteriumtuberculosis)感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前结核病依然是全球感染性疾病的头号杀手。世界卫生组织发布的《2017全球结核病报告》公布的新数据显示：2017年世界范围内估计有1040万新发病例，其中男性590万(56％)，女性350万(34％)，儿童100万(34％)。印度、印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非这六个国家占了新发病例总数的60％。结核病疫情未能获得控制，究其根本原因是缺乏有效的疫苗预防结核病的发生。

控制结核病的有效措施依然在于对结核病的有效预防，目前唯一应用于临床预防结核病的疫苗仍是卡介苗(bacillecalmette-guerin，bcg)，它是将牛型结核分枝杆菌不断传递230代而得到的减毒活菌疫苗，自从1921年问世以来，全球有超过40亿人次接种使用卡介苗每年约有1亿名新生儿使用接种预防，成为世界上应用最广泛的疫苗。卡介苗培养简单，价格低廉，其安全性相对较好，但在长期的应用过程中人们逐渐发现它的缺点和不足：1.who认为卡介苗的接种对于儿童严重结核病如结核性脑膜炎及粟粒型肺结核有较好的预防效果，但对成人结核病并无保护作用，但成年人是结核病的主要传播来源，因此卡介苗接种也不能降低结核病传播。2.保护效力并不稳定，并有相对应用禁忌症及不良反应。研究证实卡介苗对结核病的预防效果在不同地域不同人群差异较大，保护率为0～80％不等，因此有关卡介苗是否有效的争议一直都存在。3.对于先天性免疫低下的儿童及后天获得性免疫力缺陷患者在接种卡介苗后有可能导致严重的并发症或播散性结核病；4.在长期的传代过程中丢失一些重要抗原基因，免疫保护效力降低，另外接种卡介苗后还会对结核病患者的诊断结果产生一定的影响。

传统的卡介苗已经不能满足人类预防结核病的需求，各国研究人员均在不断努力开发新型结核病疫苗。诸多新兴结核病疫苗均处于不同受试阶段，到目前为止仍没有一种疫苗可以成功的替代卡介苗而广泛应用于临床预防。

人型结核分枝杆菌国际标准无毒株h37ra菌株是由人型结核分枝杆菌强毒株h37rv多次传代培养减毒后获得，其成为结核病疫苗方面具有以下优势：

第一，抗原较bcg完整。

第二，h37ra在人类巨噬细胞中的繁殖速度低许多，但同时又具有h37rv菌株的免疫原性能充分活化免疫细胞，且能够长期在宿主体内定植生长，满足活菌疫苗的基本要求。

第三，人类结核病多由人型结核分枝杆菌引起，少数由牛型结核分支杆菌引起，有研究发现卡介苗免疫的动物抵抗牛型结核分枝杆菌的作用强于抵抗人型结核分枝杆菌。h37ra菌株作为结核病疫苗候选菌株也已经被广泛关注。虽然h37ra菌株在成为疫苗方面有较好的潜能，但有诸多研究表明其毒力较卡介苗强，单独作为结核病疫苗使用安全性尚欠缺考证。

原生质体融合(protoplastfusion)技术是于上世纪60年代发展起来的一项新型的微生物育种技术。采用物理或化学方法诱导两亲本(只有原生质膜包被着的原生质体)进行融合，经基因组间的交换重组，筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定的融合子从而达到基因层面的杂交目的,使其遗传物质发生重组后筛选出获得拥有双亲优良性状的稳定融合子，来促使新物种产生和优化其进化。克服了传统的菌种改良技术的劳动强度大，需多轮诱变及筛选，选育时间长等缺点，为改良细胞遗传特性提供了新方法，尤其是对定向育种有着重要的意义。

技术实现要素：

发明的目的在于提供一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用，针对目前预防结核病研制新疫苗的迫切性，考虑bcg和h37ra菌株单独作为疫苗使用都存在一定的缺陷但又各具优势，且两菌株在遗传性状及生物特征上具有一定的互补性，所以本发明以bcg和h37ra两菌株为亲本菌株利用原生质融合技术所成功构建的新型结核病疫苗融合菌株(b/r菌株)，同时具备卡介苗与h37ra菌株优良生物特性和遗传性状，并且进一步探究了此融合菌株的免疫保护效力和安全性，为进一步探讨和研究该融合菌株成为结核病候选疫苗的可能性奠定基础提供依据。

本发明的目的一提供一种制备bcg菌株原生质体和h37ra菌株原生质体的方法，并探索出其最佳制备条件，同时对bcg菌株原生质体和h37ra菌株原生质体的再生条件进行优化，培养出活性好、生长良好的再生菌株。制备bcg原生质体的最优条件：菌龄为18天、酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为5h时；制备h37ra菌株原生质体的最佳条件：菌龄为21天，酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为6h；

本发明的目的二是提供一种制备bcg菌株原生质体和h37ra菌株原生质体的融合子的方法，其利用电穿孔技术使两种原生质体融合，并探索出其最佳融合条件，同时对融合子进行再生培养，得到生长良好的再生菌株。融合菌株(b/r菌株)的最佳的融合条件：融合电压e＝2.2kv/cm，电击时间t＝0.8ms。

本发明的目的三是提供一种观察和鉴定融合菌株(b/r菌株)的方法，其利用荧光标记法，并使用激光共聚焦显微镜图片分析软件zeisslsmimageexaminer进行分析计算融合效率。

其技术方案如下：

一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、结核杆菌的培养及结核杆菌菌悬液的制备

bcg菌株及h37ra株分别接种于罗氏固体培养基中，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长。在生物安全柜内，取培养约2～3周罗氏固体培养基上生长状态良好的bcg菌落，置于已高压灭菌的磨菌器中，分别加少量含0.05％tween-80的生理盐水至菌株研磨器中，研磨均匀后，使用细菌浊度仪来检测细菌浓度，通过0.05％tween-80的生理盐水来调整细菌浓度为1×10⁷/ml。标记，-20℃冰箱中保存、备用。

步骤2、bcg菌株原生质体的制备

分别取对数生长期bcg菌液10ml，调整细菌浓度为3.5×10⁷个/ml，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的bcg菌液加入fda荧光素染色在荧光显微镜下进行观察原生质体的活性及形成情况。当bcg菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。

步骤3、h37ra菌株原生质体的制备

分别取对数生长期h37ra菌株的菌液10ml，调整细菌浓度为3.5×10⁷个/ml，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml预热的预处理剂至终浓度0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的h37ra菌液加入罗丹明b荧光素染色观察。当h37ra菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。

进一步，步骤2中，菌体的菌龄为18天、酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为5h。

进一步，步骤3中，菌体的菌龄为21天，酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为6h。

一种新型结核杆菌融合菌株的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1、融合菌株的制备及鉴定

将制备出具有活性的bcg和h37ra两亲本菌株原生质体等体积1:1混合均匀，置于电击杯中，在脉冲电压e＝2.2kv/c，脉冲时间t＝8ms时进行电击融合，采用激光共聚焦显微镜观察及鉴定融合子。由于使用fda荧光染色标记的bcg原生质体显示绿色荧光，罗丹明b荧光染色标记的h37ra原生质体显示红色荧光，经过电融合后形成的融合子同时带有两种荧光。因此，bcg原生质体与h37ra原生质体经电融合后，形成的融合子通过激光共聚焦显微镜观察显示黄色荧光；

步骤2、bcg和h37ra菌株原生质体电融合效率测定

为优化电融合条件，分别以1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4v/cm共六组融合电压进行试验。由激光共聚焦显微镜图片分析软件zeisslsmimageexaminer分析可得出，在电压v＝2.2v/cm时融合效率与其他各组比较较高。当电压过高或脉冲强度过强时，均会造成原生质体破损，从而造成融合率的下降，不利于融合子的再生。但若电场强度过小或脉冲强度不够，则双亲菌株的原生质体不能充分接触，不易形成融合子。

进一步，步骤2中，电融合电压v＝2.2v/cm。

本发明所述新型结核杆菌融合菌株在新型原生质体疫苗初步筛选过程中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以bcg和h37ra两菌株为亲本菌株利用原生质融合技术所成功构建的新型结核病疫苗融合菌株(b/r菌株)，同时具备卡介苗与h37ra菌株优良生物特性和遗传性状，并且进一步探究了此融合菌株的免疫保护效力和安全性，为进一步探讨和研究该融合菌株成为结核病候选疫苗的可能性奠定基础提供依据。

附图说明

图1：bcg原生质体的制备条件；

a：不同菌龄bcg菌株原生质体的形成量；b：不同溶菌酶浓度bcg原生质体的形成量；c：不同酶解时间bcg原生质体的形成量；

图2：h37ra原生质体的制备条件；

a：不同菌龄h37ra菌株原生质体的形成量；b：不同溶菌酶浓度h37ra原生质体的形成量；c：不同酶解时间h37ra原生质体的形成量；

图3：bcg原生质体fda染色(200×)；

a：bcg原生质体暗视野；b：bcg原生质体明视野；c：bcg原生质体明暗视野叠加；

图4：h37ra菌株原生质体罗丹明b染色(200×)；

a：h37ra菌株原生质体暗视野；b：h37ra菌株原生质体明视野；c：h37ra菌株原生质体明暗视野叠；

图5：bcg原生质体和h37ra菌株原生质体的融合子(200×)；

a：bcg原生质体暗视野；b：h37ra原生质体暗视野；c：bcg和h37ra菌株原生质体明视野；d：bcg和h37ra菌株原生质体融合菌株明暗视野叠加；

图6：融合电压对原生质体融合效率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1结核菌株原生质体的制备

1.材料与方法：

1.1主要试剂材料：

1.1.1主要材料：结核分枝杆菌国际标准强毒株h37ra株(简称h37ra株)和卡介苗菌株(简称bcg菌株)由中国药物生物制品检定所提供，本实验室保存；

β-巯基乙醇购自上海生工生物工程技术有限公司；tris碱(tris,base)及溶菌酶购自amresco公司；fda购自sigma公司；罗丹明b购自solarbio公司；谷氨酸钠购自上海源硕生物技术有限公司；电击杯购自德国eppendorf公司。

1.1.2主要仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室提供。

普通离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；离心管、培养皿、移液管购自沧州复康医药用品公司；10μl、20μl、100μl、200μl、1ml移液器购自德国eppendof公司；791型磁力搅拌器购自上海南汇电讯器械厂；倒置显微镜xd-101-2b及激光共聚焦显微镜购自日本olympus公司；电转仪购自德国eppendorf公司。

1.1.3实验动物：6周左右的成年、健康c57bl/6小鼠，雌雄各半，体重约为18±2g，由石河子大学动物中心提供。饲养于石河子大学医学院《西部地区高发人兽共患传染性疾病防治》协同创新中心实验室(bsl-3)。

1.2实验方法

1.2.1结核杆菌的培养及结核杆菌菌悬液的制备

bcg菌株及h37ra株分别接种于罗氏固体培养基中，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长。在生物安全柜内，取培养约2～3周罗氏固体培养基上生长状态良好的bcg菌落，置于已高压灭菌的磨菌器中，分别加少量含0.05％tween-80的生理盐水至菌株研磨器中，研磨均匀后，使用细菌浊度仪来检测细菌浓度，通过0.05％tween-80的生理盐水来调整细菌浓度为1×10⁷/ml。标记，-20℃冰箱中保存、备用。

1.2.2bcg菌株原生质体的制备

分别取对数生长期bcg菌液10ml(调整细菌浓度为3.5×10⁷个/ml)，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的bcg菌液加入fda荧光素染色在荧光显微镜下进行观察原生质体的活性及形成情况。当bcg菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。

结果：在菌龄为18天、酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为5h时的最佳条件下制备得bcg原生质体。如图1所示。

1.2.3h37ra菌株原生质体的制备

分别取对数生长期h37ra菌株的菌液10ml(调整细菌浓度为3.5×10⁷个/ml)，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml预热的预处理剂至终浓度0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的h37ra菌液加入罗丹明b荧光素染色观察。当h37ra菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。

结果：在菌龄为21天，酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为6h的最佳条件下制备得h37ra菌株原生质体。如图2所示。

1.2.4bcg原生质体fda荧光染色标记

取已经制备的bcg菌株的原生质体溶液1ml，加入25μlfda液，轻轻混匀后，避光，室温条件下染色约5～10min，在倒置荧光显微镜下使用蓝光激发光进行观察。

结果：bcg原生质体显绿色荧光。如图3所示。

1.2.5h37ra菌株原生质体罗丹明b荧光染色标记

取已经制备的h37ra菌株的原生质体溶液0.5ml，加入100μl罗丹明b液，室温条件下避光染色约5～10min，在倒置荧光显微镜下使用绿光激发光进行观察。

结果：h37ra菌株原生质体显红色荧光。如图4所示。

实施例2bcg和h37ra菌株原生质体电融合及融合菌株的鉴定

1.实验方法：

1.1融合菌株的制备及鉴定

将制备出具有活性的bcg和h37ra两亲本菌株原生质体等体积(1:1)混合均匀，置于电击杯中，在脉冲电压e＝2.2kv/c，脉冲时间t＝8ms时进行电击融合，采用激光共聚焦显微镜观察及鉴定融合子。由于使用fda荧光染色标记的bcg原生质体显示绿色荧光，罗丹明b荧光染色标记的h37ra原生质体显示红色荧光，经过电融合后形成的融合子同时带有两种荧光。因此，bcg原生质体与h37ra原生质体经电融合后，形成的融合子通过激光共聚焦显微镜观察显示黄色荧光。如图5所示。

1.2bcg和h37ra菌株原生质体电融合效率测定

为优化电融合条件，分别以1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4v/cm共六组融合电压进行试验。由激光共聚焦显微镜图片分析软件zeisslsmimageexaminer分析可得出，图6可看出在电压v＝2.2v/cm时融合效率与其他各组比较较高。当电压过高或脉冲强度过强时，均会造成原生质体破损，从而造成融合率的下降，不利于融合子的再生。但若电场强度过小或脉冲强度不够，则双亲菌株的原生质体不能充分接触，不易形成融合子。综上分析，电融合最适电压v＝2.2v/cm。

实施例3融合菌株(b/r菌株)的免疫保护效力和安全性的初步研究。

1.实验方法

对b/r菌株的免疫保护效力和安全性的研究分别从动物实验和细胞实验两部分进行。

1.1动物实验：将204只c57bl/6小鼠随机分为四组：生理盐水组(36只)、bcg组(56只)、b/r组(56只)、h37ra组(56只)，分别皮内接种无菌生理盐水0.1ml，bcg菌悬液0.1ml、b/r菌株菌悬液0.1ml、h37ra菌株菌悬液0.1ml(含活菌数为1×10⁶个)。a：观察接种后各组小鼠一般生存状况及生存率，记录接种后第3、6、9、12、15、18周小鼠体重数值。b:分别于接种后第2、3、6、9、12周时随机抓取bcg组、b/r组、h37ra组小鼠各4只脱颈处死后，摘取小鼠完整肺脏、脾脏；制成脏器组织匀浆并接种于改良罗氏培养基上，37℃细菌恒温培养箱内培养20天后计菌落数(cfu)。c:分别于免疫后第3、6、9、12、15、18周，随机抓取生理盐水组、bcg组、b/r组、h37ra组小鼠各6只脱颈处死后称重；其中第3、6、9周小鼠处死前摘眼球取外周血分离血浆，用elisa法测小鼠血浆中白细胞介素2(il-2)及γ干扰素(ifn-γ)的水平；将处死后的小鼠打开胸腔、腹腔取肺脏、肝脏及脾脏于组织固定液中固定48小时(脾脏取出后称重并记录)制作病理切片行he染色，观察各组小鼠肺脏、肝脏、脾脏在各时间点的病理变化情况。d:根据所记录的各组小鼠体重和脾脏重量计算各组小鼠各时间点的脾脏系数。

1.2细胞实验：a:复苏并培养巨噬细胞株raw264.7，选择状态良好的细胞，分别用bcg、b/r、h37ra菌株菌悬液感染细胞，利用annexinv-fitc/pi双染法分别检测感染后第6小时、12小时、24小时各组细胞的凋亡率。b:提取收集正常c57bl/6小鼠腹腔原代巨噬细胞体外培养，分别用bcg、b/r、h37ra菌株的菌悬液感染所培养的小鼠腹腔巨噬细胞，并在感染后第0、48、96小时用1％tritonx-100裂解液裂解巨噬细胞，将裂解得到的液体稀释1000倍后取适量接种于罗氏培养基上，37℃细菌恒温培养箱内培养20天后计菌落数。

1.3结果与结论：

1.3.1b/r菌株接种c57bl/6小鼠后不影响小鼠一般生长发育及生存时间。

1.3.2b/r菌株在c57bl/6小鼠体内至少定植3个月，其定植力较bcg增强，较h37ra菌株弱。

1.3.3b/r菌株在c57bl/6小鼠体内诱导细胞免疫应答水平较bcg显著增强，较h37ra菌株弱。

1.3.4细胞实验结果表明b/r菌株的毒力与bcg无显著差异，与h37ra菌株相比明显减弱。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。