抗Tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用的制作方法

本发明属于抗体领域，特别涉及抗tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用。

背景技术：

tau蛋白是一种微管相关蛋白，其可被分为四个区域，即n末端突出区、富含脯氨酸区、微管结合区、和c末端，tau蛋白正常情况下与微管结合，但在被糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β，gsk-3β)催化发生磷酸化后可以从微管脱落，引起微管稳定性下降或解聚；tau蛋白磷酸化和去磷酸化之间的平衡是维持神经元微管稳定性、保证细胞完成线粒体等细胞器在轴浆中正常运输的前提。

创伤性脑损伤(traumaticbraininjury，tbi)是由于意外性或非意外性损伤所引起的持续性脑损伤。临床表现包括意识丧失、癫痫发作、特殊姿势、晕厥、偏瘫等。在创伤性脑损伤的研究中发现tau蛋白过度磷酸化可以引起微管解聚、线粒体分布异常和线粒体功能障碍，最终导致了神经元蜕变或凋亡；顺式磷酸化tau蛋白是脑损伤后神经退行性病变的一个早期驱动因子，其可促进tau蛋白病理化。

阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)多在老年时期起病，起病隐秘，病程缓慢时间长且不可逆，是一组目前病因并不明确的脑部原发性退行性变性疾病，其基本病理特点表现为aβ沉积形成的老年斑、磷酸化tau蛋白沉积形成的神经纤维缠结以及大量胆碱能神经元的丢失等。目前有研究表明可通过抗tau蛋白抗体来治疗或辅助治疗阿尔茨海默病，能够起到缓解疾病进展的作用。

基于上述认知，利用特定的抗tau蛋白抗体治疗tau蛋白异常相关的疾病被认为是一个可行的措施。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抗tau蛋白抗体，所述抗体能够特异性结合磷酸化tau蛋白，所述抗体的轻链氨基酸序列如seqidno：1所示，重链氨基酸序列如seqidno：2所示。

进一步地，本发明提供一种编码核苷酸，其能编码抗tau蛋白抗体。

更进一步地，本发明还提供一种重组表达载体，所述载体包含上述编码核苷酸。

更进一步地，本发明还提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞能够分泌抗tau蛋白抗体。

本发明还提供抗tau蛋白抗体在制备治疗过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

进一步地，所述抗tau蛋白抗体的轻链氨基酸序列如seqidno：1所示，重链氨基酸序列如seqidno：2所示。

更进一步地，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、创伤性脑损伤。

更进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

所述载体优选为赋形剂、稳定剂。

有益效果

本发明的抗tau蛋白抗体能够特异性结合磷酸化的tau蛋白，能够显著改善阿尔比海默病等过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的症状。

本发明为阿尔比海默病、创伤性脑损伤等过度磷酸化tau蛋白相关的神经退行性疾病的预防和或治疗提供了一种新的有效途径。

附图说明

图1：phf-tau蛋白免疫后小鼠血清滴度。

图2：抗tau抗体特异性westernblot检测结果，其中phf-tau为磷酸化tau蛋白，tau为非磷酸化tau蛋白。

图3：抗体e2与phf-tau蛋白的亲和力。

图4：单克隆抗体e2对阿尔茨海默病小鼠的治疗效果。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：抗tau蛋白抗体杂交瘤制备

为了获得能够特异性结合创伤性脑损伤、阿尔茨海默病等神经系统疾病中发生病变的tau蛋白的抗tau蛋白抗体，选择与疾病状态密切相关的phf-tau作为抗原制备抗tau蛋白抗体。

所述phf-tau蛋白通过已知的方法制备纯化，即选取阿尔茨海默病患者死后的皮质组织，使用组织匀浆器以1000rpm将5mg额皮质在8-10倍体积的冷缓冲液h(10nmtris、800mmnacl、immegta和10％蔗糖，ph7.4)中匀浆化，匀浆化的材料在高速离心机中以27000g离心20分钟。弃去团块并将上清液调整至1％(w/v)n-月桂酰肌氨酸和1％(v/v)2-巯基乙醇的最终浓度，并在37℃下温育2小时。随后将上清液以108000g在超高速离心机中在20℃下离心35分钟，将团块在pbs中小心洗涤并悬浮于pbs中，上清液如所述的离心第二次，并且将最终团块溶解而获得纯化的phf-tau蛋白，等分且在-80℃下冷冻。

小鼠免疫

取6-8周雌性balb/c小鼠6只，苦味酸染色标记，断尾取血制备基础血清。

首次免疫：

将phf-tau蛋白溶液(0.4mg/ml)与等体积弗氏完全佐剂混合，反复吹打混匀至完全乳化，按每只小鼠200μl的剂量，腹腔注射。

加强免疫：

初期免疫后每隔2周，将phf-tau蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂混合，反复吹打混匀至完全乳化，按每只小鼠100μl的剂量，腹腔注射。

冲击免疫：

累计免疫8次后，用脾内注射的方式，用phf-tau蛋白进行加强免疫，剂量为25μg/只。方法是：先将小鼠用乙醚麻醉，置于台面右侧卧，暴露左肋部即部分脊背部，用酒精消毒后，无菌操作剪开腹部皮肤暴露腹膜，透过腹膜找到脾脏，用1ml注射器将phf-tau蛋白溶液隔着腹膜延长轴进针缓缓注射入脾脏，注射完毕后封闭切口，三天后取脾脏细胞进行细胞融合。

杂交瘤细胞制备：

将骨髓瘤细胞(sp2/0)传代扩大培养，融合时，用滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于离心管中，1000rpm离心5-10min，弃去上清，加入30ml1640培养基，同法离心洗涤一次，然后将细胞重悬浮于10ml1640培养基，混匀，取骨髓瘤细胞悬液，细胞计数后备用。

取免疫完的balb/c小鼠，摘除眼球放血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，通过常规操作取小鼠脾脏并剥去周围结缔组织，将脾脏置于盛有不完全培养基的平皿中，在尼龙网上轻轻挤压脾脏获得脾细胞单细胞悬液。收获脾细胞悬液，1000rpm离心5-10min，用不完全1640培养基离心洗涤2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液作活细胞计数后备用。

在细胞融合前1天制备并培养饲养细胞。

将1×10⁸脾细胞与2×10⁷骨髓瘤细胞sp2/0混合于一支离心管中，补加1640培养基至30ml，充分混匀，1000rpm离心5-10min，将上清尽量吸净，轻击融合管底部使沉淀细胞松散均匀，置水浴中预热，用1ml吸管在1min内滴加预热至37℃的peg1ml，边加边轻轻晃动，静置1-2min，用1oml吸管在2-3min内缓慢滴加20-30ml预热至37℃的不完全1640培养基至终止反应。1000rpm离心5min，弃去上清，加入40ml2×hat培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，接种于前一天已经加入饲养细胞的96孔培养板中培养，每孔0.1ml，然后将培养板置于37℃，5％co2培养箱内培养，5天后用2×hat培养基换出1/2培养基，以后每3天用2×hat培养基换出1/2培养基，14天后用ht培养基换出hat培养基，21天后可用普通完全培养基。

阳性克隆筛选与亚克隆

观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/5以上时吸出培养上清通过直接elisa方法检测阳性克隆，即以phf-tau蛋白包被的96孔板和辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠igg筛选阳性克隆，将筛选得到的阳性克隆通过有限稀释法进行亚克隆。

单克隆抗体的制备与纯化

利用常规的单克隆抗体制备与纯化方法以balb/c小鼠尾实验动物制备获取单克隆抗体。

利用westernblot测定单克隆抗体的特异性。

以phf-tau蛋白竞争结合抗体测定亲和力常数：单克隆抗体首先与不同浓度的phf-tau蛋白孵育，反应系统中单克隆抗体的初始浓度为400ng/ml(2.6×10^-12mol/l)，phf-tau蛋白的初始浓度从100μg/ml往下倍比稀释，形成7个反应系统，孵育后将反应液加入到包被了phf-tau抗原的酶标板中，每孔100μl，孵育后洗板3次，每孔加入100μlhrp标记的兔抗鼠尔康溶液，37℃反应1h，洗板3次，加入tmb底物显色10min后加入终止液，测定od450值计算各个反应系统的抗原结合率推算亲和力常数。

结果显示：

将phf-tau蛋白腹腔注射免疫小鼠，在初次免疫后的血清抗体滴度能够达到1∶4000，三次免疫后抗体滴度能够达到1∶8000，九次免疫后igg抗体滴度能够达到1∶528000，表明利用phf-tau蛋白免疫小鼠获得了良好的免疫效果，结果见图1。

经过阳性克隆筛选后，共筛选得到5株可以稳定分泌抗phf-tau蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为a2、a4、b8、c6和e2，上述5株杂交瘤细胞株在连续传代培养2个月后均能够稳定分泌抗体，且培养上清效价均大于1∶1000。

westernblot检测显示上述5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体中，e2、b8和a2具有较好的phf-tau蛋白结合特异性，而c6和a4特异性结合phf-tau蛋白的能力较差，结果见图2。

对抗体e2、b8和a2进行了亲和常数测定，结果显示其亲和常数在2-8×10^-8mol/1之间，其中单抗e2的亲和力常数为7.89×10^-8mol/l(r2＝0.9938)，表明需要抗原过量才能对抗体形成竞争性抑制，结果见图3。

实施例2：阿尔茨海默病模型的构建

为了研究抗tau蛋白抗体对生理状态下过度磷酸化tau蛋白的作用，构建了阿尔茨海默病小鼠模型。

balb/c小鼠用2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据小鼠颅脑定位立体图谱，对基底核定位，用牙科钻钻开枯骨，用1μl微型进样器注射针5min内缓慢注入aβ25-35和鹅膏蕈氨酸(ibo)(均购置于sigma公司)的混合液1μl，予以留针10min，注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤，术后给予青霉素钠盐5万u肌肉注射，1次每天，连续注射3天。构建成功小鼠阿尔茨海默病模型。另外，空白组在定位下给予小鼠基底核一次性注射1μl灭菌生理盐水。

小鼠模型构建成功后，分别选取3只小鼠通过免疫组化对脑中总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的累积光密度和光密度进行测定和分析。

结果显示：模型组总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的累积光密度分别为0.385±0.015、0.339±0.018，空白组的总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的累积光密度分别为0.363±0.011、0.114±0.023，即模型组总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的累积光密度显著高于空白组，表明模型构建成功。

实施例3：抗tau抗体对阿尔茨海默病小鼠中磷酸化tau蛋白的作用

基于前述实施例的结果，选择单克隆抗体e2、b8和a2来研究其降低阿尔茨海默病小鼠中磷酸化tau蛋白的效果。

如实施例2构建阿尔茨海默病小鼠模型和空白组小鼠模型，选取40只阿尔比海默病模型小鼠作为实验组，随机分成4组，每组10只，分别通过尾部静脉注射给予生理盐水、单克隆抗体e2、b8和a2(500μg/小鼠)；选取10只正常小鼠和10只空白组模型小鼠分别通过尾部静脉注射给予生理盐水(500μg/小鼠)，实验小鼠自由取食和饮水。实验组、正常组和空白组第一次给药后分别隔天给药，给药5次后间隔5天给药，再给药6次，在实验开始后第50天处死小鼠，取脑并分离海马组织。

通过westernblot检测小鼠海马组织中tau蛋白异常磷酸化，即提取海马组织总蛋白后进行蛋白含量测定，将定量的蛋白进行sds-page凝胶电泳，电泳完成后转膜进行免疫反应，化学发光、显影及定影，利用凝胶图像分析软件分析目标条带的分子量和净光密度值并确定磷酸化tau蛋白的含量。

结果如表2所示：

与正常组比较，^∞p＜0.01；与模型组相比，^※p＜0.01

即，结果显示，相对于单克隆抗体b2和a2，出人意料地，单克隆抗体e2能够起到很好的降低阿尔茨海默病小鼠中过度磷酸化tau蛋白的效果，其可用于预防和或治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤等tau蛋白过度磷酸化相关的神经退行性疾病。

实施例4：抗tau抗体对于阿尔茨海默病小鼠模型行为学的影响

如实施例2构建阿尔茨海默病小鼠模型，选取20只模型小鼠分成2组，一组给予单克隆抗体e2(500μg/小鼠)，一组给予生理盐水(500μg/小鼠)，进行morris水迷宫实验。

水迷宫实验为：水迷宫为直径100cm，高50cm的圆形水池，水深30cm，水温保持在26±1℃，池壁上标有东南西北四个入水点，将水池分为四个象限，分别称为第一、二、三、四象限，在第一象限正中放置一个直径为9cm，高29cm的圆形透明平台，平台顶低于水面1cm，迷宫上方安置有与计算机相连的摄像机，同步记录小鼠运动轨迹，训练期间迷宫外参照物保持不变。

模型小鼠和正常小鼠参照实施例3给药，最后一次给药完成后第5天开始morris水迷宫实验。第一天第1次让小鼠自由游泳2min，第一天第2次开始正式训练，随后每天训练2次，共4天，训练时选择一个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间及游泳速度，如果小鼠在120s内未能找到平台，需将其引至平台，让其在平台上停留20秒，数据采集和处理由morris迷宫图像子东监视处理系统完成。

实验结果显示：单克隆抗体e2实验组发现平台的小鼠数量随着测试天数逐步增加，而生理盐水实验组发现平台的小鼠数量没有表现出随着测试天数而增加的趋势，结果见图4，上述结果表明单克隆抗体e2实验组小鼠的学习记忆能力较生理盐水实验组有改善，单克隆抗体e2能够用于预防和或治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤等tau蛋白过度磷酸化相关的神经退行性疾病。

实施例5：抗tau抗体对于阿尔茨海默病小鼠模型行为学的影响

将杂交瘤e2交由上海生工对单克隆抗体进行测序，测序结果表明单克隆抗体e2的轻链氨基酸序列如seqidno：1所示，重链氨基酸序列如seqidno：2所示。

可选地，可通过本领域常规的抗体人源化技术对单克隆抗体e2进行人源化处理，以使其能够更适合用于预防和或治疗人类的阿尔茨海默病、创伤性脑损伤等tau蛋白过度磷酸化相关的神经退行性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>温州医科大学

<120>抗tau抗体及其在治疗阿尔茨海默病、创伤性脑损伤中的应用

<141>2019-05-07

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>219

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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