柠檬籽酶解多肽液的制备方法及其产品和应用与流程

本发明属于农业副产物再加工技术领域，涉及一种柠檬籽酶解多肽液的制备方法及其产品，更涉及到产品的应用。

背景技术：

柠檬(citruslemon)为芸香科柑橘属植物，常绿小乔木，广泛分布于亚热带地区，原产中国喜马拉雅山麓。果实中富含维生素、糖类、柠檬酸、橙皮苷等元素，多作为上等调味料，应用于饮料、菜肴、化妆品及药品等。具药典记载，柠檬具有抗菌消炎、生津解暑、开胃、清热化痰以及提高人体免疫力等功效。目前柠檬在地中海沿岸、东南亚和美洲等地都有分布，我国四川、台湾、福建、云南、广西等地也有栽培。其中四川安岳种植面积较大，占全国柠檬种植面积80％以上，种植面积约为23万亩，其总产值多达上亿元。柠檬经粗加工之后，产生大量的废弃物，其中有柠檬皮渣、柠檬籽等。一般处理方法是丢弃、加工成饲料或填埋，会破坏自然和社会环境。因此，加大对柠檬水果废料的加工、再回收、再利用对保护环境具有重要的意义。

柠檬籽是柠檬工业加工的主要副产物，其中含有大量的油脂，含油量高达30％左右。柠檬籽中还有含有多种具有特殊生理功效的活性成分，如具有抗肿瘤功效的柠檬苦素类似物，具有抗氧化活性等功效的黄酮类物质等，以及丰富的蛋白质类。目前柠檬籽的回收利用都是以研发柠檬籽油为主，如温志英“柑橘加工废料综合利用现状及发展前景”，和崔秋兵的“溶剂法提取柠檬籽油的研究”，而里面更多的营养物质却被白白废弃掉。

柠檬籽粕是柠檬籽经过提取柠檬籽油的产物，如直接随意丢弃会造成严重的资源浪费和环境污染。秉承着变废为宝和资源合理利用的理念，着重对柠檬籽粕的后续开发新的用途及产品研究做了深入的研究，以期为柠檬籽的综合利用提供理论指导和参考依据。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种柠檬籽酶解多肽液的制备方法及其产品，更提供柠檬籽酶解多肽液在制备饮料或保健品中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.柠檬籽酶解多肽液的制备方法，所述制备方法的步骤为：

a.将去油后的柠檬籽粉碎后过20-50目筛为柠檬籽粕，称取需要量的柠檬籽粕，加入水，100℃下10-15min热变性处理；

b.再按柠檬籽粕的质量计算加入果胶酶，搅拌均匀，置于80℃水浴中加热5min，然后用nahco3溶液将ph快速调至7-9；

c.再按柠檬籽粕的质量计算加入木瓜蛋白酶，缓慢搅拌混匀后，于恒温50℃进行酶解即得柠檬籽酶解多肽液。

进一步地，所述制备方法还包括将酶解液在高温下灭酶活。

进一步地，所述柠檬籽粕、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为1：0.04-0.05：0.02-0.05。

进一步地，所述柠檬籽粕、果胶酶和木瓜蛋白酶的质量比为1：0.05：0.04。

进一步地，步骤a中柠檬籽粕和水的质量体积比为1g：10-30ml。

进一步地，步骤a中柠檬籽粕和水的质量体积比为1g：10ml。

进一步地，步骤b中ph8.5。

进一步地，步骤c中酶解时间3-4小时。

2.以上任一项所述制备方法得到的柠檬籽酶解多肽液。

3.柠檬籽酶解多肽液的制备方法得到的柠檬籽酶解多肽液在制备饮料或保健品中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过大量实验提供了一种柠檬籽酶解多肽液的制备方法，首先通过大量实验建立柠檬籽粕通过酶解后得到多肽液的基本制备方法，再进一步研究方法中各参数的影响，最终筛选得出一个富含多肽物质的柠檬籽酶解液的最佳制备方法。并进一步以此为基础，开发出口深受大家喜欢的感酸甜柠檬籽肽饮料，本发明利用柠檬籽粕生产的低分子多肽，更容易被人体消化、吸收，从而促进、增强、调节人体免疫的生理功能。也为后续开发新方向的多功能饮料奠定基础。同时提高了农业副产物再加工利用的深度，减少资源的浪费。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1.酶解时间对柠檬籽水解度影响；

图2.ph对柠檬籽水解度影响；

图3.料液比对柠檬籽水解度影响；

图4.加酶量对柠檬籽水解度影响；

图5.a和b对水解度的影响响应面；

图6.a和b对水解度的影响等高线图；

图7.a和c对水解度的影响响应面；

图8.a和c对水解度的影响等高线图；

图9.a和d对水解度的影响响应面；

图10.a和d对水解度的影响等高线图；

图11.b和c对水解度的影响响应面；

图12.b和c对水解度的影响等高线图；

图13.b和d对水解度的影响响应面；

图14.b和d对水解度的影响等高线图；

图15.c和d对水解度的影响响应面；

图16.c和d对水解度的影响等高线图；

图17.为不同实验条件下得到的柠檬籽酶解液；

图18.为本发明实施例8制备的柠檬籽酶解液；

图19.为柠檬籽酶解液经冷冻干燥的成品；

图20.温度对脱苦影响；

图21.时间对脱苦影响；

图22.β-环状糊精量对脱苦的影响；

图23.柠檬香精添加量对柠檬籽肽饮料品质的影响；

图24.蔗糖添加量对柠檬籽肽饮料品质的影响；

图25.木糖醇添加量对柠檬籽肽饮料品质的影响；

图26.柠檬酸添加量对柠檬籽肽饮料品质的影响。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所提及的物质添加量百分数均为质量体积百分数。

1.实验试剂、材料及器材如表1所示：

表1主要实验试剂、材料及器材一览表

实施例1

柠檬籽酶解多肽液的制备方法：

a.将去油后的柠檬籽粉碎后过20-50目筛，称取制备的柠檬籽粕，按一定的料液比加入蒸馏水，100℃下10-15min热变性处理；

b.再按柠檬籽粕的质量计算加入果胶酶，搅拌均匀，置于80℃水浴中加热5min，然后用0.5mol/lnahco3溶液将ph快速调至7-9；果胶酶用于先释放出柠檬籽粕中的糖蛋白及其他物质，有利于后期多肽饮料制备的澄清；

c.再按柠檬籽粕的质量计算加入木瓜蛋白酶，缓慢搅拌混匀后，于恒温水浴锅中50℃进行酶解即得柠檬籽酶解多肽液；

d.酶解完毕后100℃下，10-15min灭酶活。

本发明先通过大量的测试摸索出柠檬籽酶解多肽液制备的基本步骤。再大范围测定个步骤中每一个参数可实施的具体范围，最后再比较优选的条件，每组实验均为6组平行，结果取其均值。因篇幅有限，具体实施方式只给出柠檬籽酶解多肽液的制备方法及可实施的具体范围，进一步给出优选条件的实施方式及实验结果。

实施例2

水解度测定

通过滴加0.5mol/lhcl溶液使柠檬籽酶解多肽液ph保持不变，并记录每隔半小时的酸液消耗量，来计算柠檬籽粕蛋白的水解度。计算公式如下所示：

式中，c——hcl溶液浓度(mol/l)；

v——hcl溶液消耗体积(ml)；

m——样品蛋白质质量(g)；

h——每克原料柠檬籽粕蛋白中肽键的毫摩尔数(h＝7.84mmol/g)；

t——实验温度(k)。

实施例3

在实施例1已经确定的制备方法基础上再分别考察酶解时间对柠檬籽酶解多肽液水解度的影响。将固定料液比为柠檬籽粕1g：水10ml，ph8，加入0.05g木瓜蛋白酶，温度50℃的情况下，分别设定酶解时间为1h、2h、3h、4h、5h的条件，测定不同酶解时间下柠檬籽酶解多肽液的水解度。

测试结果如图1所示，在保持其他条件不变，ph为8，液料比为1:10，加酶量0.0500g，的条件下，随着酶解时间的增加，水解度也逐渐增加，但是3小时后水解度增加的幅度不大，较优选的酶解时间为2-4小时，最优选酶解时间为3h。

实施例4

在实施例1已经确定的制备方法基础上再分别考察ph对柠檬籽酶解多肽液水解度的影响。

将固定料液比为柠檬籽粕1g：水10ml，加入0.05g木瓜蛋白酶，酶解时间3h的情况下，分别设定ph为7、7.5、8、8.5、9的条件，测定不同ph条件下得到柠檬籽酶解多肽液的水解度。

其测试结果如图2所示，保持其他条件不变，加木瓜蛋白酶量0.05g，液料比为1:10，酶解时间3h的情况下，改变ph，水解度随着ph至有所波动，由图可知，在ph8.5为优选，ph9时对蛋白影响较大，水解度反而大幅度降低。

实施例5

在实施例1已经确定的制备方法基础上再分别考察料液比对柠檬籽酶解多肽液水解度的影响。

将不同料液比，柠檬籽粕(g)：水(ml)为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的条件下，加入0.0500g木瓜蛋白酶，ph8，，酶解时间3h的情况下，测定不同料液比条件下得到柠檬籽酶解多肽液的水解度。

其实验结果如图3所示，水解度随着料液比的加大会逐渐降低。优选的料液比为1:10。而水解度低于1:10时，后续制备的多肽饮料苦味较重。

实施例6

在实施例1已经确定的制备方法基础上再分别考察加酶量对柠檬籽酶解多肽液水解度的影响。

将固定料液比为柠檬籽粕1g：水10ml，ph8，酶解时间3h的条件下，分别设定木瓜蛋白酶量为0.0100g、0.0200g、0.0300g、0.0400g、0.0500g的条件，测定不同加酶量条件下得到柠檬籽酶解多肽液的水解度。

其实验结果如图4所示，在保持固液比1:10，ph8，温度50℃，酶解时间3h的条件下，在加酶量为0.01-0.05g的范围内，随着加酶量的增多，柠檬籽水解度有所波动，以加酶量为0.03g最优。

实施例7

进一步利用响应面分析法对柠檬籽酶解多肽液工艺的优化

1.响应面分析因素水平的选取

根据box-behnken中心组合实验设计的基本原则，把a(料液比)，b(时间)，c(ph)，d(木瓜蛋白酶量)为自变量，柠檬籽酶解多肽液水解度为因变量，设计响应面分析试验的因素和水平的数值，见表2。

表2响应面分析因素与水平

2.响应面模型的建立及结果

响应面分析的试验结果见表3。

表3响应面分析方案及其试验结果

把实验数据导入design-expert8.0.6软件程序进行回归分析，得出柠檬籽酶解多肽液水解度的回归方差如下：

水解度＝9.09-3.09*a+5.87*b-13.46*c+9.62*d+5.27*a*b-10.89*a*c+0.88*a*d-6.58*b*c+9.08*b*d-1.32*c*d-7.86*a²-18.75*b²+1.24*c²+7.04*d²

回归方差做显著性检验与方差分析结果见表4

表4二次响应面回归模型方差分析

注：*代表5％显著水平，**代表1％显著水平

由表4结果分析可知，影响柠檬籽酶解多肽液的主要因素为d>a>b>c,最优配方为a2b3c2d1,即料液比1:10，时间3h，ph8.5，加木瓜蛋白酶0.04g为提取柠檬籽粕酶解液最优条件。

根据回归方差，生成响应面和等高线图，观察分析响应面。四个因素两两结合，试验结果如图5-图16所示。响应面的曲面陡峭说明响应值因变量的变化情况。等高线的轮廓可以看出两两相互作用的结果，两因素相互作用的影响若不明显则显示为圆形，反之则为椭圆形。比较图5-16可知，对柠檬籽粕酶解液的水解度影响最为显著是d(加酶量)>a(料液比)>b(时间)>c(ph)。

其中，图5为a和b对水解度的影响响应面；

图6为a和b对水解度的影响等高线图；

图7为a和c对水解度的影响响应面；

图8为.a和c对水解度的影响等高线图；

图9为a和d对水解度的影响响应面；

图10为a和d对水解度的影响等高线图；

图11为b和c对水解度的影响响应面；

图12为b和c对水解度的影响等高线图；

图13为b和d对水解度的影响响应面；

图14为b和d对水解度的影响等高线图；

图15为c和d对水解度的影响响应面；

图16为c和d对水解度的影响等高线图；

实施例8

a.将去油后的柠檬籽粉碎后过20-50目筛，称取制备的柠檬籽粕50g，按1:10的料液比加入蒸馏水，100℃下10-15min热变性处理；

b.再加入2.5g果胶酶，搅拌均匀，置于80℃水浴中加热5min，然后用0.5mol/lnahco3溶液将ph调至8.5；

c.再加入2g木瓜蛋白酶，缓慢搅拌混匀后，于恒温水浴锅中50℃进行酶解即得柠檬籽酶解多肽液；

d.酶解完毕后100℃下，10min灭酶活。

图17为不同实验条件下得到的柠檬籽酶解多肽液，图18为本发明实施例8制备的柠檬籽酶解多肽液，图19为柠檬籽酶解多肽液经冷冻干燥的成品，方便保存，以备做其他饮料的添加物。

实施例9

柠檬籽肽饮料

a.将去油后的柠檬籽粉碎后过20-50目筛，称取制备的柠檬籽粕，按一定的料液比加入蒸馏水，100℃下10-15min热变性处理；

b.再按柠檬籽粕的质量计算加入果胶酶，搅拌均匀，置于80℃水浴中加热5min，然后用0.5mol/lnahco3溶液将ph快速调至7-9；果胶酶用于先释放出柠檬籽粕中的糖蛋白及其他物质，有利于后期多肽饮料制备的澄清；

c.再按柠檬籽粕的质量计算加入木瓜蛋白酶，缓慢搅拌混匀后，于恒温水浴锅中50℃进行酶解即得柠檬籽酶解多肽液；酶解完毕后100℃下，10-15min灭酶活；

d.灭活后柠檬籽酶解多肽液先加水9份稀释10倍，再加入β-环状糊精在30-70℃温度下进行脱苦，后抽滤，抽滤液中加入蔗糖、木糖醇、柠檬酸、柠檬香精、柠檬酸钠和黄原胶；用胶体磨以增加饮料的乳化性，同时可以达到均质的效果；以上物质添加量均按质量体积百分比计，即1％为100ml体积加入1g物质；

e.最后加入明胶，搅拌均匀，过滤即可得柠檬籽肽饮料。

f.进一步产业化生产，还包括常规的灌装、密封、杀菌、冷却、成品、指标检测等步骤。

酶解后的柠檬籽多肽液还含有一定的柠檬苦素，味觉上还有苦味，若直接制备为饮料，口感较差，本发明先对比了大量的脱苦方法，最后一致定为添加β-环状糊精为最优的脱去苦味方法。并进一步对脱苦的因素分析，找出最优化的脱苦参数。脱苦后再确认添加柠檬香精，蔗糖，木糖醇，柠檬酸为等调味剂对饮料进行调配，达到一个良好的口感且富含多肽的饮料。

实施例10

在固定其中2个单因素(温度为50℃，脱苦时间为30min，β-环状糊精添加量为0.6％)的情况下，再分别对变量温度(30℃，40℃，50℃，60℃，70℃)，脱苦时间(10min，20min，30min，40min，50min)，β-环状糊精添加量(0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％)进行单因素实验。

实验使用感官评价法对脱苦工艺进行苦味的评价。实验设计为：将配置好未脱苦的酶解液给予20位味觉正常的评价员进行品尝，同时与脱苦后的酶解进行对比，并给予评分，评分标准为1-无苦味，2-较苦，3-苦味一般，4-苦，5-苦味重，处理工艺的苦味程度取其平均值。评价前确保每位评价员进行漱口且未食用任何影响感官的东西。

以评价苦味均值为纵坐标，以各变量为横坐标，测试结果如图20-图22所示。

图20为温度对脱苦影响；如图20所示随着温度的升高脱苦效果逐渐变好，当温度达到50℃时苦味值为1.95，在可接受范围之内，并且随着温度的升高苦味值的降低也不是很明显，同时高温也可能会对酶解液的品质造成影响。所以，单因素最优温度是50℃。

图21为时间对脱苦影响；如图21所示随着脱苦时间的增加脱苦效果逐渐变好，当脱苦时间达到30分钟时苦味值为2.03，在可接受范围之内，并且当时间超过30分钟之后苦味值的下降不明显。因此，脱苦的最优时间是30-40分钟。

图22为β-环状糊精量对脱苦的影响；如图21所示随着β-环状糊精的添加量的增加，苦味值变化程逐渐下降的趋势，当添加量为0.6％时苦味值为1.98，在可接受范围之内，且随着添加量的增加苦味降低不明显，同时随着添加量的增加酶解液的粘稠度会上升，影响品质，故添加量不宜过多。

实施例11

再进一步对温度，脱苦时间，β-环状糊精添加量进行正交实验，设计表如表5所示：

表5正交实验设计表

实验测试结果如表6所示：

表6脱苦正交实验结果分析

由表6可知，温度，添加量，时间对β-环状糊精的脱苦效果影响大小为：a>b>c，由表4-4可知，正交实验分析结果显示最优组合为a1b1c3，即温度为40℃，添加量为0.4％，时间为40min。后期测试温度在40-50℃，时间30-40min，再添加同等调味剂后效果都可以。

实施例12

首先经过大量实验确定柠檬籽肽饮料中所加入调味剂的种类为柠檬香精，蔗糖，木糖醇，柠檬酸，并确立各组分大致的添加量。进一步在可实施的添加量基础上，先分别讨论单因素的影响，再以柠檬香精，蔗糖，木糖醇和柠檬酸调味剂进行四因素三水平正交实验设计，以感官评价为指标，讨论各添加量的影响及最优化的组合，柠檬籽肽饮料感官评价标准如表7所示，柠檬籽肽饮料感官评价方法：选择身体状况良好，味觉正常的20位评价员对柠檬籽肽饮料进行感官评价，并根据表7柠檬籽肽饮料感官评价标准进行评分。对每位评价员的评分进行统计，将统计结果进行统计分析。为保证评分的准确性，评价前确保每位评价员进行漱口且未食用任何影响感官的东西。

表7柠檬籽肽饮料感官评价标准

(1)柠檬香精添加量对产品品质的影响

将柠檬籽酶解多肽液加水稀释10倍体积后，按质量体积百分比加入蔗糖3.5％、木糖醇1.0％、柠檬酸0.14％，柠檬香精加入量分别为0、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％。以评价员对每种柠檬籽肽饮料的评分平均值为纵坐标，以各变量为纵坐标，测试结果如图23所示，在蔗糖为3.5％、木糖醇为1.0％、柠檬酸为0.14％，柠檬香精加入量依次为0、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％随着柠檬香精添加量的逐渐增大，柠檬籽肽饮料呈上升趋势，但到一定程度过后，就会因为柠檬香精的味过重而影响产品的品质，因此单因素考虑，柠檬香精最佳添加量为0.1％。

(2)蔗糖添加量对产品品质的影响

将柠檬籽酶解多肽液加水稀释10倍体积后，按质量体积百分比加入木糖醇1.0％、柠檬酸0.14％、柠檬香精0.05％，蔗糖加入量依次为1％、2％、3％、4％、5％。测试结果如图24所示，在添加量木糖醇为1.0％、柠檬酸为0.14％、柠檬香精为0.05％，蔗糖加入量依次为1％、2％、3％、4％、5％，随着蔗糖的添加量的增加评分增加的较快，即蔗糖能快速提升口感，当添加量达到一定程度过后就会过甜，因此单因素考虑，蔗糖的最优添加量为3％。

(3)木糖醇添加量对产品品质的影响

将柠檬籽酶解多肽液加水稀释10倍体积后，按质量体积百分比加入蔗糖3.5％、柠檬酸0.14％、柠檬香精0.05％，木糖醇加入量分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％。测试结果如图25所示，在添加量蔗糖为3.5％、柠檬酸为0.14％、柠檬香精为0.05％，木糖醇加入量分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％，随着木糖醇的添加量的增加，评分变化不是很大，即木糖醇的添加量对品质的影响不大，考虑到木糖醇食用过量会导致腹泻，因此单因素考虑，木糖醇的最优添加量为1％。

(4)柠檬酸添加量对产品品质的影响

将柠檬籽酶解多肽液加水稀释10倍体积后，按质量体积百分比加入在蔗糖3.5％、木糖醇1.0％、柠檬香精0.05％，柠檬酸加入量分别为0.06％、0.08％、0.10％、0.12％、0.14％。测试结果如图26所示，在添加量蔗糖为3.5％、木糖醇为1.0％、柠檬香精为0.05％，柠檬酸加入量分别为0.06％、0.08％、0.10％、0.12％、0.14％，随着柠檬酸的加入量的增加，酸味也越来越重，且比较爽口，但到一定程度后就会过酸，影响口感且会出现絮凝。因此单因素考虑，柠檬酸的最优添加量为0.1％。

实施例13

再进一步以柠檬a柠檬香精(％)、b蔗糖(％)、c木糖醇(％)d、柠檬酸(％)为因素做正交实验，实验设计表如表8所示。

表8正交实验设计表

柠檬籽肽饮料调配正交实验结果如表9所示。

表9柠檬籽肽饮料调配正交实验结果

由表9结果分析可知，影响柠檬籽肽饮料感官的主要因素为a>b>c>d,最优配方为a2b3c3d2,即柠檬香精为0.1％，蔗糖添加量为4％，木糖醇添加量为2％，柠檬酸添加量为0.1％。

对于澄清剂，大量物质筛选出壳聚糖和明胶，但是在柠檬酸最适添加量下，壳聚糖的澄清作用比较缓慢且过滤速度也比很慢，而明胶的澄清效果较明显且过滤速度较快。通过大量实验最后得到在添加剂最佳配方量时，各物质添加量为柠檬酸钠0.035％，黄原胶0.025％，明胶1％。篇幅有限，不再赘述。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。