生物标志物在诊断骨科疾病中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及生物标志物在诊断骨科疾病中的应用，具体涉及linc01127作为诊断男性骨质疏松症的分子标志物的应用。

背景技术：

骨质疏松症是中老年人的常见病，男性骨质疏松的发病率呈上升趋势，与女性相比，男性骨质疏松发生较早、速度更快。酗酒、性腺功能减退和吸烟是男性骨质疏松的主要危险因素。

骨质疏松引起的临床症状有躯干缩短、驼背、腰背疼痛；四肢骨容易发生骨折，且以股骨颈骨折最为常见。早期这些症状不是很明显，如果任其发展下去，所造成的不良后果是非常严重的，50％的人会终生残疾。

疼痛是原发性骨质疏松症最常见的症状，以腰背痛多见，但不少中年男人平时有腰腿不适的感觉时常常误以为是劳累造成的，还有人误认为是人老化的正常表现，容易忽略该病，所以骨质疏松症也被称为“寂静之病”。很多人发现自己腰背疼痛甚至骨折了才去诊治，往往已经错过了最佳治疗时机，因此步入中年的男人要引起高度注意。

男性骨质疏松诊断与pmop相同。低骨量(低于同性别正常人群的峰值骨量的1～2.5个标准差)、骨质疏松(低于峰值骨量的2.5个标准差以上)或严重pmop(骨质疏松伴一处或多处自发性骨折)。目前没有直接测定骨强度的临床方法，常常采用下列诊断指标：骨密度低下及(或)脆性骨折。对于继发性骨质疏松，还需要具有引起骨质疏松的明确病因。dxa的缺点是不能测得真实的骨密度，而且无法将皮质骨和小梁骨区别开来，用外周定量ct(peripheralquantitativecomputedtomography，pqct)测量桡骨超远端bmd，可得到总体骨密度、小梁骨骨密度、总体骨矿含量、小梁骨骨矿含量、皮质骨骨密度、皮质骨骨矿含量。当bmd测量与临床诊断不符时，为明确骨病变性质，应进一步做骨扫描、骨活检组织形态计量及qct、μct、qmr等检查。单光子、单能x线、定量计算机断层照相、定量超声检查等对诊断有一定的参考价值。分析结果时应更注重z值(z值即为与同年龄、同性别正常人相比较)。根据原发病表现和bmd测定及脆性骨折诊断继发性低骨量/骨质疏松。脆性骨折是骨强度下降的最终后果，故有过由明确疾病或药物引起的脆性骨折即可诊断继发性骨质疏松。骨矿盐密度测定详见原发性骨质疏松。x线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。但对于发现有无骨折，与骨肿瘤和关节病变相鉴别，有较大价值。目前尚无一项生化指标可作为骨质疏松的诊断标准，主要用于骨转换分型、判断骨丢失速率、监测病情、评价药物疗效。

近年来，随着生物技术的发展，遗传因素的研究成为骨质疏松诊治领域的热门课题，已有研究表明骨质疏松与体内基因的变化相关，如专利201610115194.9、201610116151.2、201510627060.0、201510628024.6、201711483595.0、201510628081.4等报道了基因的差异表达与骨质疏松的发生发展相关，可见，利用基因进行骨质疏松的早期诊断成为未来发展的趋势。

技术实现要素：

为了填补目前的技术空白，本发明的目的在于提供一种用于诊断骨质疏松症的长链非编码rna标志物。本发明利用芯片和qpcr实验证明linc01127在男性骨质疏松症患者血液中的表达水平明显高于健康男性血液中的水平，因此可以将linc01127作为诊断男性骨质疏松症的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码rna表达的试剂在制备骨质疏松症诊断产品的应用；所述长链非编码rna的编码基因geneid：100506328。

本发明的长链非编码rna在ncbi中的命名为linc01127。属于基因id：100506328编码产物的linc01127转录本为nr_103791.1，序列如seqidno.1所示。

进一步，所述试剂包括利用sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01127表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明提供了一种用于骨质疏松症诊断的产品，所述产品包括检测linc01127表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01127表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的rna表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的rna表达谱，容易分析出哪个rna的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知linc01127表达异常与骨质疏松症相关也属于linc01127的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测linc01127表达量的试剂，所述试剂包括与linc01127或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01127表达量时使用的pcr扩增引物。

所述芯片包括检测linc01127表达量的试剂，所述试剂包括与linc01127或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01127表达量的探针。

所述试纸包括检测linc01127表达量的试剂，所述试剂包括与linc01127或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01127表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物组合物包括linc01127的抑制剂。

进一步，所述抑制剂不受限制，只要是可以抑制linc01127表达水平或抑制linc01127功能活性即可。

所述抑制剂包括sirna、shrna、抑制型mirna、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的长链非编码rna在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中linc01127的表达水平；

(3)将测得的linc01127的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，linc01127的表达水平显著升高，则该受试者被判断患有骨质疏松症、或判断该受试者患有骨质疏松症的风险高。

本发明还提供了一种骨质疏松症的治疗方法，所述方法包括抑制linc01127表达量或者抑制linc01127的调节活性。

在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

如本文所用，术语“lncrna”、“长链非编码rna”、“longnon-codingrna”含义相同，互换使用，都是指一种由rna聚合酶ii转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的rna片段。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种诊断骨质疏松症的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨质疏松症发生的早期即可作为判断，提高了患者治愈率。

附图说明

图1显示利用qpcr检测linc01127的差异表达情况的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达非长链编码rna

1、病例收集

收集医院体检行dxa测定bmd的年龄50岁以上男性6人，排除继发性骨质疏松症和已接受抗骨质疏松治疗的患者。另收集5例体检健康男性作为对照。

bmd测量使用美国hologic公司asy-00409型dxa测量左侧股骨颈(不能测量者测量右侧股骨颈)和腰椎l1-4bmd。骨质疏松症使用《原发性骨质疏松诊治指南(2011年)》的诊断标准：bmd值低于同性别、同种族正常成人的骨峰值不足1个标准差(t值≥-1)属正常，降低1～2.5个标准差(-2.5＜t值＜-1)为骨量低下，降低程度等于和大于2.5个标准差(t值≤-2.5)为骨质疏松，腰椎以l1-4中的最低值计算。

2、血液总rna提取

使用promega公司的rna提取试剂盒提取总rna。具体步骤如下：

1)取1ml收集在肝素或edta处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；

2)3000rpm离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；

3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物，3000rpm离心5min；

4)重复步骤3两次；

5)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下bme已经加到rna裂解液中，然后加175μlrna裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；

6)加350μlrna稀释液，颠倒混合3-4次，室温下13000g离心10min，将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；

7)向澄清裂解液中加入200μl95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；

8)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，加600μlrna洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；

9)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的dnase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；

10)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μldna酶终止缓冲液，13000g离心1min；

11)加入600μlrna洗涤液，13000g，离心1min；

12)清空收集管，向离心柱内加入250μlrna洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；

13)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有rna的洗脱管，存于-70℃。

3、rna样品的质量分析

利用nanodrop2000对所提取的rna浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、使用quickamplabelingkit，one-color(agilentp/n5190-0442)合成、标记双链cdna。

5、标记的双链cdna纯化后杂交于arraystar公司的human8x60klncrnaexpressionarrayinformation芯片。

6、杂交漂洗之后由agilentmicroarrayscanner(agilentp/ng2565ba)扫描仪进行扫描分析。

7、原始数据分析由agilentfeatureextractionsoftware软件完成，差异基因的筛选使用配对随机方差模型的方法，差异基因的标准为变化表达2倍以上及p值≤0.05。

8、结果

测序结果显示：与健康男性相比，男性骨质疏松症患者血液中存在的差异表达lncrna为256个，其中上调的为175个，下调的为81个。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达lncrna

基于前期芯片测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择linc01127进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集骨质疏松症患者和男性健康对照各30例。

2、在rna水平上进行验证

试剂：反转录试剂盒(ddr037a)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(real-time)定量pcr(polymerasechainreaction)所用的sybrpremixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒为日本takara公司生产。

2.1提取血液总rna

步骤同实施例1。

2.2逆转录

以提取的总rna(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：buffer4μl，rtenzymemix1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，以无rna酶的ddh2o将反应体积补足为20μl。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cdna。该cdna可用于lncrnareal-timepcr检测。

2.3qpcr

按照日本takara公司的premixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒说明书进行操作。反应体系：sybrpremixextaq^tm(2×)25μl，roxreferencedye(50×)1μl，pcr上游引物(10μm)1μl，pcr下游引物(10μm)1μl，cdna4μl，灭菌ddh2o18μl。反应程序：95℃20s预变性，按95℃10s变性、54.6℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得ct值。

结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

引物设计：根据linc01127转录本序列，通过ncbi的引物设计工具(primerblast)设计引物，引物序列如下所示：上游引物：5’-gaatgagcatggaatgtatcta-3’(seqidno.2)；下游引物：5’-cactctgttagcctgaatc-3’(seqidno.3)。根据gapdh(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.4)；5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.5)。

3、结果

结果显示，与健康男性的平均水平相比，30例男性骨质疏松症患者中有27例患者血液中linc01127水平显著高于健康对照。统计结果如图1所示，与健康男性相比，男性骨质疏松症患者血液中linc01127水平明显升高，差异具有统计学意义(*p<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>昌乐县人民医院

<120>生物标志物在诊断骨科疾病中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>996

<212>dna

<213>人源(homosapiens)

<400>1

accttttcatccagtgaggacacagggagaagatggtcattagcgaccaggaagagggtc60

cccccaccagaaccccatgctggcacctgatctcgacttccggcctccagaaatctttga120

gaagcagataggcttgaatgagcatggaatgtatctatttaaaaagcagctggaagtctg180

tcaagtgcattctggaaatggattcaggctaacagagtgttctgaatagagacgcctaaa240

acaagagccaaagacatagcaatggagaacgtgggtggtacagccctccaccctggcgag300

cagcacattagaatcacgtaggagcttaaaaagtactgactggcctggtctttttcggtg360

tgaaggtgggatgcaggcttcctggggttatcctctcgtacagccagagttgagaaccat420

ctgagtagcgcttgtcacacttctggccacatcagaatcgtctgagggacttgttcactg480

caggttgctgggtcccatctctagcctctgatccagtagcctggggtggggcacaggatg540

tcctgctgctggggtctgggcagcgctatgagaactgctgacgttggagctcgatcaggc600

aattggaccacccaaatggcaaactaaaagcatagaagcggacaccagaggctcctggac660

ctgagatgtggccctggaagtgaccagatgtggtctcaagagatgggggcccagggctag720

gaatgccgccatccggggaggccctagagcagagcagagcagctgtgggctggtgccaag780

ctcactcctgcttctctctgcacgtctccctcattcttttctctctgaactgtgaccctt840

ttggcccctctgagtaccaggtgggacaaggtgacccctcagcacttgagtttacacctt900

agatgtgtaggtcctcacagaggccaacttatctccttctgggaccaaattccaaattcc960

taaagaaaaaacaaaccaaaaacggatatgataaac996

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaatgagcatggaatgtatcta22

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cactctgttagcctgaatc19

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggagcgagatccctccaaaat21

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggctgttgtcatacttctcatgg23