检测CYP3A5基因的方法、试剂盒、引物对及探针与流程

本发明涉及一种检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对及探针。
背景技术：
：血液作为一种重要的生物样本，其内含有大量的dna聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂肪等。为了完成血液样本核酸的pcr扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。一般包括以下三个过程，一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸，即去除蛋白质等影响后续pcr反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致大量的核酸损失，同时繁琐的提取纯化步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续pcr扩增失败的可能。此外由于提取过程耗时长，成本高，有些提取方法还需借助苯酚等有害试剂，增加了操作人员感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行pcr扩增检测，成为血液样本扩增需要解决的难题。细胞色素p450酶系(cytochromep450enzymesystemcyps)是参与外源化合物解毒和内源化合物代谢的重要酶系，主要有cypl、cyp2、cyp3三大家族。cyp3a5是cyp3a亚家族最主要的肝外分布形式，cyp3a5位于人类7号染色体q21.l-22.1，基因全长3l.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸，其表达和活性存在极大的个体及种族差异，被认为是造成个体间cyp3a活性差异及造成cyp3a代谢药物疗效和个体间不良反应差异的最重要因素。在已发现的cyp3a5等位基因(cyp3a5*2、cyp3a5*3、cyp3a5*4、cyp3a5*5、cyp3a5*6)中，cyp3a5*3对应的6986a>g突变最为重要，导致cyp3a5酶活性降低或消失。经cyp3a5代谢的药物(如免疫抑制剂他克莫司，降脂药辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀，抗菌药西罗莫斯、抗乙肝病毒药物双环醇等)随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显的不同。通过检测患者cyp3a5基因6986位点基因型，判断患者对相关药物的代谢能力，为医生合理用药提供参考。在中国人群中，cyp3a5*3(6986g)基因发生频率约70％。根据基因型不同，药物剂量和治疗方案调整的案例日益增多。随着研究的深入，越来越多的药物与cyp3a5基因突变的相关性也被陆续报道。目前，关于cyp3a5基因分型的检测多采用荧光定量pcr，高分辨溶解曲线、基因测序等技术手段。基因测序的方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；并且测序获得结果信息量较大，很多信息对患者没有用处，测序结果判读也需要一些专业知识，费用也相对高。高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在一定的困难。关于荧光定量pcr法，cn104498592a公开了一种人cyp3a5基因检测方法，包括提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光量；所述核酸扩增体系至少分别包含cyp3a5基因cyp3a5*1和cyp3a5*3多态性的特异性正向引物和反向引物。使用这些方法进行cyp3a5基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，需抽提基因组dna、操作程序复杂等问题，不利于提高检测效率并实现临床推广普及。从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于cyp3a5基因分型检测有着重要的现实意义。此外，本领域公知，在基因分型时，引物设计要考虑包含snp位点的扩增产物的序列组成(gc含量)、片段大小、snp位点在产物的位置等等，这些都是影响pcr产物与探针杂交的杂交动力学的重要因素。杂交动力学较好的pcr产物片段大小一般为200～300bp，片段较大的(比如大于500bp)pcr产物其空间位阻会不利于与探针的杂交，杂交效率下降，片段较小的(比如小于100bp)pcr产物杂交效率会较高，但会增加野生、突变探针的特异性杂交难度。gc含量较高的pcr产物由于碱基间的氢键结合能力较强，杂交效率较高，而gc含量较低的pcr产物在相同的杂交条件下效率偏低。snp位点在pcr产物的位置也是影响杂交空间位阻的重要因素。这些因素导致可用于特定snp位点基因分型的引物对的设计就不是特别容易。同理，探针的设计也需要克服很多困难，比如确保野生型探针和突变型探针的杂交条件尽量一致。需要大量的试验验证才能设计出较好的引物对和探针。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中进行基因分型时，需要预先对全血等待测样品进行核酸提取纯化处理从而导致了核酸大量损失、扩增效率低、成本高、操作程序复杂费时、不易推广、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题，提供一种可以无需预处理、即可直接对样品进行pcr扩增、扩增效率高、成本低、操作简单、易于推广的检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用。本发明所述的方法、试剂盒、引物对及探针，可用于检测cyp3a5基因型，具有高度的准确性，能准确区分各类型的突变位点，可用于指导患者用药。本发明所述试剂盒中的基因芯片具有良好的信噪比，不易受全血、口腔黏膜脱落细胞等待测样品中其他干扰物的干扰，解决了含有多种干扰物的全血、口腔黏膜脱落细胞等待测样品扩增产物对芯片杂交的影响。其中的所述探针与所述引物对有良好的特异性。本发明所述方法和试剂盒的操作简单、成本低廉，不仅具有较高的灵敏度(在本发明某一较佳实施例中，检测限可低至1000个白细胞)，还大大缩短了检测时间，并且结果易读精准、在判断上也十分直观，更适合临床的检测和推广。本发明所述方法能够以待测样品直接为pcr模板，可以无需抽提基因组dna，所以不需要额外购买基因组dna抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。并且所需样本极少，最少只需1～2μl，且对4度冰箱保存7天内的全血等待测样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的全血等待测样本，无需病人专门采样，减轻病人痛苦。本发明将待测样品直接进行pcr后杂交，就可以实现对于cyp3a5基因的检测。本发明所述方法中杂交的步骤可以通过全自动化杂交过程实现，从而能够更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。通过本发明所述的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用检测患者的cyp3a5基因型，判断患者代谢速度类型，合理调整用药剂量，是提高经cyp3a5酶代谢药物的疗效，减少不良反应的有效途径，提供了一种简便易行的解决方案。现有用于基因分型的方法一般是采用荧光定量pcr，即使是使用了强耐受dna酶，待测样品也需要经过一定的预处理才能够用于pcr中，且对待检测样品的要求高、用量大。另外，本领域人员公知，在有干扰物存在的待测样品(如全血、口腔黏膜脱落细胞等)环境下，引物对、探针的设计及其配比，难度相对较高。在杂交反应中，序列组成、靶标dna分子和探针的长度、杂交温度、盐等均会影响杂交效率和强度。用于基因分型时的扩增产物不能太长，否则会影响杂交速度，而当扩增产物较短时，引物可选择的余地非常少，同时又需要保证足够的扩增效率，并且要考虑和引物相互的配合，设计难度非常大。此外，由于探针是固定在固相支持物例如载玻片上，而这类固相支持物本身具有一定的排斥力，因此设计探针时，需要考虑其空间结构，减少排斥力；同时又要保证设计出的探针能够与扩增产物进行杂交；并且需要考虑探针杂交的特异性问题，对纯合突变样本要保证野生型探针杂交时不产生信号，而突变型探针能够产生信号。本发明中的野生型和突变型探针只相差一个碱基，设计难度非常大。本发明人经过大量的尝试，意外发现即使是使用普通的非荧光定量pcr，加上和基因芯片、强耐受dna聚合酶的组合使用，配合本发明的引物对和探针，所得检测结果具有高度的准确性、灵敏度、特异性，检测方法简单、快速、成本低廉，且待检测的全血、口腔黏膜脱落细胞等样品可以是无需任何的预处理即可直接加入进行检测。为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种用于检测cyp3a5基因的试剂盒，其包括pcr反应体系和基因芯片，所述pcr反应体系包括强耐受dna聚合酶和引物对，所述基因芯片包括探针；其中，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.1(5’-tggagagtggcataggagatac-3’)和seqidno.2(5’-cgacacacagcaaccttagg-3’)所示；和/或，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3(5’-tttgtctttcaatatctcttccctg-3')和/或seqidno.4(5’-tttgtctttcagtatctcttccct-3')所示。本发明中，所述基因芯片可为本领域常规，一般包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异性寡核苷酸探针。较佳地，所述pcr反应体系中的引物的浓度均为0.024～0.8μm，优选0.08～0.4μm，更优选0.12～0.24μm。更佳地，所述pcr反应体系中的上游引物的浓度为0.024～0.24μm，优选0.12μm；和/或，所述pcr反应体系中的下游引物的浓度为0.08～0.8μm，优选0.4μm。较佳地，所述基因芯片中的探针的浓度为2.5～10μm，更佳地为5μm。较佳地，所述引物对为5’端有生物检测标记物修饰的引物对，所述生物检测标记物优选为生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，更优选生物素。通过采用不同的引物对的生物检测标记物修饰，后续杂交检测时相应的检测方法也会随之变化。这些检测方法均可为本领域人员已知的检测方法。在本发明某一较佳实施例中，所述引物对为5’端有生物素修饰的引物对，后续杂交检测时也相应的使用抗生物素的抗体液和显色液进行检测。具体为：首先与检测探针杂交的扩增产物上的生物素(biotin)先与链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(streptavidin-ap)反应，生成新的复合物：biotin-streptavidin-ap，后者发生如下的显色反应：biotin-stripavitin-ap+bci-p→bci-oh+pi(ph7.5)bci-oh+nbt→蓝紫色沉淀其中，bcip为5溴-4氯-3吲哚磷酸；nbt为硝基四氮唑蓝。通过使探针与上述被扩增区域杂交，从而检测cyp3a5基因型。较佳地，所述探针为5’端有和基因芯片的固相支持物的修饰物相结合的基团修饰的探针，优选有氨基修饰的探针，更优选有氨基和多个t修饰的探针，进一步更优选有氨基和16个t修饰的探针。采用氨基修饰后，所述探针可以更好的与醛基修饰的基因芯片的固相支持物(如载玻片或硅片)相连。较佳地，所述pcr反应体系还包括pcr反应缓冲液和/或脱氧核苷三磷酸(dntp)。本发明中，只要是强耐受性dna聚合酶均可以完成本发明。所述强耐受dna聚合酶、pcr反应缓冲液、脱氧核苷三磷酸3者可以通过商购获得，例如以商购2×pcrmix的形式存在。例如，所述强耐受性dna聚合酶(此处是与pcr反应缓冲液、脱氧核苷三磷酸共同混合的商购2×pcrmix)选自下述一种或多种中的强耐受性dna聚合酶：directpcrmix、transdirecttmpcrsupermix、phusionblooddirectpcrmastermix。比如，所述强耐受性dna聚合酶可以是选自2×directpcrmix中的hotstartdnapolymerase(强耐受性dna聚合酶)，2×transdirecttmpcrsupermix中的强耐受性dna聚合酶，和/或，phusionblooddirectpcrmastermix(2×)中的phusionbloodiidnaploymerase(hotstartdnapolymerase，强耐受性dna聚合酶)。这些所述试剂的商购来源可以是购自以下厂家：在本发明某一较佳实施例中，所述pcr反应体系的添加量如下：较佳地，用于所述试剂盒的待测样品为含基因组dna的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。本发明所述试剂盒可为检测全血中cyp3a5基因的试剂盒。本发明所述试剂盒可用于直接检测全血中的cyp3a5基因，全血样品无需任何预处理，可以直接使用该试剂盒中所述的pcr反应体系对全血进行pcr扩增，无需抽提基因组dna，所以不需要额外购买基因组dna抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。当待测样品为口腔黏膜脱落细胞时，一般是将口腔黏膜脱落细胞悬浮在溶剂中以应用于pcr反应当中。较佳地，所述试剂盒中还包括阴性探针，其核苷酸序列优选如seqidno.5(5’-tttgtctttatcgttctcttccct-3')所示。较佳地，所述试剂盒还包括杂交溶液，所述杂交溶液优选包括杂交缓冲液、预杂交液、杂交反应液、洗液，优选杂交显色试剂盒中的杂交溶液，更优选上海百傲科技股份有限公司出品的杂交显色试剂盒(货号为bst03021)。较佳地，所述试剂盒还包括能够与所述引物对的检测标记物发生反应的溶液和显色液例如四氮唑蓝(nbt)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(bcip)、或四甲基联苯胺(tmb)。在pcr产物与基因芯片杂交后，再和能够与所述引物对的生物检测标记物发生反应的溶液进行混合后，所述显色液能够与其发生反应从而显色，以检测杂交信号。本发明中，所述pcr可以为本领域常规的pcr技术，例如可以为非荧光定量pcr。为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测cyp3a5基因的引物对，所述的引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。较佳地，所述的检测为pcr检测。较佳地，所述检测的样品为含基因组dna的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测cyp3a5基因的探针，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3和/或seqidno.4所示。较佳地，所述探针以基因芯片的形式存在，所述探针固定在所述基因芯片的固相支持物上。所述固相支持物可为本领域常规，例如玻片或硅片。较佳地，所述的检测为pcr检测。较佳地，所述检测的样品为含基因组dna的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测cyp3a5基因的组合物，所述组合物包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，和/或，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3和/或seqidno.4所示。较佳地，所述探针以基因芯片的形式存在，所述探针固定在所述基因芯片的固相支持物上。较佳地，所述的检测为pcr检测。较佳地，所述检测的样品为含基因组dna的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。为解决上述技术问题，本发明旨在提供上述引物对、上述探针、或者上述组合物在检测cyp3a5基因中、在制备检测cyp3a5基因的试剂中或在制备检测cyp3a5基因的试剂盒中的应用。为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种非诊断目的的检测cyp3a5基因的方法，其包括以下步骤：将待测样品利用权利要求1～4任一项所述的pcr反应体系进行pcr反应，再将所得产物与权利要求1～4任一项中所述的基因芯片进行杂交，检测杂交信号。本发明中，通过芯片杂交法，所述寡核苷酸探针能够特异地与cyp3a5基因6986位不同基因型杂交。特异性引物对可扩增含有检测目的位点的目标区域。通过靶dna与探针的互补碱基之间形成氢键而恢复成原来的双螺旋结构原理进行的。较佳地，在与所述的基因芯片杂交之前，所述所得产物与杂交缓冲液混合。较佳地，在与所述的基因芯片杂交之前，先将所述基因芯片与预杂交液进行预杂交。本步骤有利于优化芯片杂交的背景。较佳地，所述检测的样品为含基因组dna的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。本发明中，所述检测杂交信号可以是根据标记信号(经pcr扩增所得片段上的生物检测标记物的信号)在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息，所述检测杂交信号的方法可以为基于与抗生物素抗体或亲和素或链霉亲和素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝(nbt)显色反应、辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(bcip)显色反应、辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺(tmb)显色反应和/或者荧光检测。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可参照用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪scanarray3000等)获取待测信息。较佳地，所述检测杂交信号的方法为碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应、辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应、辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺反应或者荧光检测。本发明中，所述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；derisi，jl等于1997年在《科学》278(5338)：680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(dersi,jl,iyervr,brownpo.exploringthemetablicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.science.1997；278(5338):680-686)及马立人等主编的生物芯片，化学工业出版社。本发明中，扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；j.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社。所述强耐受性dna聚合酶中的“强耐受性”是指该聚合酶对待测样品中所含有的dna聚合酶抑制物质具有强的耐受性，能够在一种或者两种以上常规dna聚合酶抑制物质的存在时，仍然能够以亲代dna为模板，催化底物dntp分子聚合形成子代dna，实现dna聚合酶应该有的功能；而本领域常规的dna聚合酶在这些所述的一种或者两种以上常规dna聚合酶抑制物质的存在时，无法实现dna聚合酶应该有的功能，必须先从待测样品中对核酸物质进行纯化处理才能够完成待测样品的pcr扩增。例如，当待测样品为全血或者口腔黏膜脱落细胞等时，所述强耐受性dna聚合酶不会受到全血或者口腔黏膜脱落细胞等中的dna聚合酶抑制物质(如血红素、杂蛋白、脂肪、总胆固醇、甘油三酯、胆红素或其他杂质)的影响，而直接发挥dna聚合酶的功能，即以亲代dna为模板，催化底物dntp分子聚合形成子代dna。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明所述的方法、试剂盒、引物对及探针，可用于检测cyp3a5基因型，具有高度的准确性，能准确区分各类型的突变位点，可用于指导患者用药。本发明所述试剂盒中的基因芯片具有良好的信噪比，不易受全血、口腔黏膜脱落细胞等待测样品中其他干扰物的干扰，解决了含有多种干扰物的全血、口腔黏膜脱落细胞等待测样品扩增产物对芯片杂交的影响，所述探针与所述引物对有良好的特异性。本发明所述方法和试剂盒的操作简单、成本低廉，不仅具有较高的灵敏度(在本发明某一较佳实施例中，检测限可低至1000个白细胞)，还大大缩短了检测时间，并且结果易读精准、在判断上也十分直观，更适合临床的检测和推广。本发明所述方法能够以待测样品直接为pcr模板，可以无需抽提基因组dna，所以不需要额外购买基因组dna抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。并且所需样本极少，最少只需1～2μl，且对4度冰箱保存7天内的全血等待测样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的全血等待测样本，无需病人专门采样，减轻病人痛苦。本发明将待测样品直接进行pcr后杂交，就可以实现对于cyp3a5基因的检测。本发明所述方法中杂交的步骤可以通过全自动化杂交过程实现，从而能够更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。通过本发明所述的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用检测患者的cyp3a5基因型，判断患者代谢速度类型，合理调整用药剂量，是提高经cyp3a5酶代谢药物的疗效，减少不良反应的有效途径，提供了一种简便易行的解决方案。附图说明图1为cyp3a5基因芯片模式图，其中，0为阳性质控探针；1为6986a探针；2为6986g探针；12为阴性质控探针；00为空白对照。图2为实施例4中的扫描结果图。图3为实施例4中的测序验证结果图。图4为实施例5中的灵敏度检测结果图。图5为实施例6中的杂交结果图。图6为实施例7中的检测结果图。图7为实施例8中的检测结果图。图8为对比例中的检测结果图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。所用基因序列的来源为ncbi(美国国立生物技术信息中心)：cyp3a5第6986位a/g(rs776746位点)实施例1基因芯片的制备醛基修饰的载玻片(产品编号：bsm03011，上海百傲科技股份有限公司)。人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)以下探针，用水溶解成浓度为100pmol/μl的溶液，然后用2×点样buffer(产品编号：bst02010，上海百傲科技股份有限公司)等比(体积比)混合。接着，用上海百傲科技股份有限公司的bd-1点样仪按说明书所述方法点制如图1左图的阵列(图1右边为每种数字对应的探针)。室温放置过夜。各特异性探针序列如下：检测位点6986a的特异性寡核苷酸探针的序列如seqidno.3(下划线部分)所示：nh2-tttttttttttttttttttgtctttcaatatctcttccctg；检测位点6986g的特异性寡核苷酸探针的序列如seqidno.4(下划线部分)所示：nh2-tttttttttttttttttttgtctttcagtatctcttccct；5'端还包含一段5'氨基(-nh2)修饰的16聚polydt(多聚脱氧胸苷酸)。cyp3a5基因6986位阴性对照探针的序列如seqidno.5(下划线部分)所示：nh2-tttttttttttttttttttgtctttatcgttctcttccct。如图1所示，在载玻片上点上阳性质控探针(购于上海百傲科技股份有限公司)、6986a探针(seqidno.3)、6986g探针(seqidno.4)、cyp3a5基因6986位阴性对照探针(seqidno.5)和空白对照。其中0为阳性质控探针，1为cyp3a5基因6986a探针，2为cyp3a5基因6986g探针，12为cyp3a5基因6986位阴性对照探针，00为空白对照。实施例2用本发明提供的引物通过pcr方法扩增cyp3a5基因片段委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，引物信息如下。上游引物序列seqidno.1：5’-tggagagtggcataggagatac-3’，下游引物序列seqidno.2：5’-cgacacacagcaaccttagg-3’，并且，引物的5’端用生物素进行修饰。然后用水溶解并稀释至浓度为10pmol/μl。按以下配方配制pcr扩增体系：试剂加入量(μl)血液模板(无需任何预处理)2上游引物(10μm)0.3-1下游引物(10μm)12×transdirecttmpcrsupermix12.5ddh2oupto25用pcr仪(tc-96/g/h(b)pcr扩增仪，购自杭州博日科技有限公司)按如下程序进行扩增：50℃5min，94℃5min，然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做35个循环，最后72℃延伸5min。序列表中seqidno.12为cyp3a5基因6986位点的snp序列，该序列来自ncbi的snp数据库信息，通过rs776746即可找到cyp3a5基因6986位点序列，是cyp3a5的部分序列，本发明扩增的目的产物包含于这个序列中。其中r代表的是简并碱基，即a/g。第6986对应的就是这个r(a/g)。实施例3将实施例1制得的基因芯片与实施例2制得的pcr产物杂交采用上海百傲科技股份有限公司出品的杂交显色试剂盒(bst03021)，在全自动杂交仪(上海百傲科技股份有限公司，bse03011)中，按以下方法进行杂交：杂交显色试剂盒为碱性磷酸酶显色反应。1)杂交反应液配制：吸取杂交显色试剂盒中的190μl杂交缓冲液，加入实施例2中的扩增产物各10μl，混匀。2)将实施例1制得的基因芯片放置在杂交仪上，盖紧。3)设置杂交程序：预杂交液，42℃，5min；杂交反应液，42℃，30min；洗液1，42℃，6min；洗液1，42℃，6min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；抗体液(链霉亲和素碱性磷酸酶复合物)，28℃，20min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；洗液3，28℃，3min；显色液(bcip和nbt溶液)，42℃，30min；预杂交液，28℃，2min；预杂交液，28℃，2min；具体操作见仪器使用说明书。运行程序，杂交显色反应自动进行。实施例4基因芯片杂交信号的检测将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于baiobe3.0生物芯片识读仪(上海百傲科技股份有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果，检测结果十分直观。结果表明受检者的cyp3a5基因型属于纯合突变型(即6986gg型)，检测结果经测序验证，测序结果如图3，结果完全符合。实施例5灵敏度检测结果1)样品制备取cyp3a5基因6986aa型血液，cyp3a5基因6986ag型血液，cyp3a5基因6986gg型血液(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)，将各种血液使用阴性对照进行稀释，稀释得到白细胞含量不同的样本如下表：2)检测按照实施例1～4的方法，对上述样品进行检测。3)结果杂交结果如图4所示：其中图a、b、c、d、e、f、g、h、i分别对应6986aa-1、6986aa-2、6986aa-3、6986ag-1、6986ag-2、6986ag-3、6986gg-1、6986gg-2、6986gg-3。综合以上检测结果可以看出，该检测方法检测灵敏度高，能够检测出0.5×109个/l白细胞浓度的血液，即灵敏度为1000个白细胞。实施例6干扰试验检测结果1)样品制备选择已知为cyp3a5基因6986aa基因型的edta抗凝全血样本(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)，按以下方法制备含有干扰物的样本：根据干扰物在血液基质中的溶解性，对易溶物采用将干扰物固体直接加入血液中，溶解、混匀的方法制备；对于难溶物，采用合适溶剂溶解后加入基质中，混匀制备；干扰物含量不同的样本如下表：干扰物名称浓度总胆固醇250mg/dl甘油三脂3000mg/dl胆红素20mg/dl2)检测按照实施例1～4的方法，基因芯片对上述样品进行检测。3)结果杂交结果如图5所示：其中图j、k、l分别对应总胆固醇、甘油三脂、胆红素。血液中250mg/dl总胆固醇；3000mg/dl甘油三酯；20mg/dl胆红素对本发明检测不会产生干扰。实施例7不同引物浓度条件下的检测结果取cyp3a5基因6986aa型血液，不同引物浓度配比的扩增液，按照实施例1～4的方法进行检测。检测结果如图6所示。引物配比1引物配比2引物配比3上游引物(μm)0.0240.120.24下游引物(μm)0.080.40.8综合以上结果上游引物和下游引物的浓度可知，引物浓度在0.024～0.8μm的范围内均可，较佳地为0.12μm和0.4μm。实施例8不同探针浓度条件下的检测结果取cyp3a5基因6986ag型血液，不同探针浓度配比的基因芯片，按照实施例1～4的方法进行检测。检测结果如图7所示。探针配比1探针配比2seqidno.3(μm)55seqidno.4(μm)510seqidno.5(μm)2.52.5seqidno.3为6986a探针，seqidno.4为6986g探针，seqidno.5为6986阴性探针。综合以上结果6986a探针、6986g探针和阴性探针的浓度，较佳地为5μm、10μm和2.5μm。对比例1)引物对1：seqidno.6：5’-tacccttcgatttgtgaagaca-3’seqidno.7：5’-acagaagtgtttagcttcccat-3’产物：425bp引物对2：seqidno.8：5’-acccagcttaacgaat-3’seqidno.9：5’-cacccaaggcttcat-3’产物：123bp2)探针：检测野生型(即检测位点6986a)设计失败探针seqidno.10(下划线部分)：nh2-ttttttttttttttttgctcttttgtctttcaatatctcttcctgttt检测突变型(即检测位点6986g)设计失败探针seqidno.11(下划线部分)：nh2-ttttttttttttttttaagagctcttttgtctttcagtatctcttcctg使用上述引物对1和引物对2，分别和上述探针配制扩增液和芯片，使用已知为cyp3a5基因6986aa基因型的全血(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)为样本，按照实施例1-4进行试验，检测图片分别如图8的左图和右图所示。从图中可知，无论是用引物对1还是引物对2，基因芯片的信号均较弱，无法正常判断基因型。sequencelisting<110>上海百傲科技股份有限公司<120>检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对及探针<130>p180116451c<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物序列<400>1tggagagtggcataggagatac22<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>下游引物序列<400>2cgacacacagcaaccttagg20<210>3<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测位点6986a的特异性寡核苷酸探针<400>3tttgtctttcaatatctcttccctg25<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测位点6986g的特异性寡核苷酸探针<400>4tttgtctttcagtatctcttccct24<210>5<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>cyp3a5基因6986位阴性对照探针<400>5tttgtctttatcgttctcttccct24<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物对1上游引物<400>6tacccttcgatttgtgaagaca22<210>7<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物对1下游引物<400>7acagaagtgtttagcttcccat22<210>8<211>16<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物对2上游引物<400>8acccagcttaacgaat16<210>9<211>15<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物对2下游引物<400>9cacccaaggcttcat15<210>10<211>32<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测野生型（即检测位点6986a）设计失败探针<400>10gctcttttgtctttcaatatctcttcctgttt32<210>11<211>33<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测突变型（即检测位点6986g）设计失败探针<400>11aagagctcttttgtctttcagtatctcttcctg33<210>12<211>1001<212>dna<213>artificialsequence<220><223>cyp3a5基因6986位点的snp序列<220><221>misc_feature<222>(501)<223>risaorg<400>12actgtgattttataaggtggtctcagccaattgcagcagctgttccctgtcagaggggct60agaggtttggtgagagcagtggatgaggtgcagtggtgtgtttgttcactagaagcaagt120gggagaaagctttgcctctttgtacttcttcatcttctcccctcaagtcctcagaatcca180cagcgctgactgtggagtgctgtggagctggcatggcccatacaggcaacatgacttagt240agacagatgacacagctctagatgtccatgggccccacaccaactgcccttgcagcattt300agtccttgtgagcacttgatgatttacctgccttcaatttttcactgacctaatattctt360tttgataatgaagtattttaaacatataaaacattatggagagtggcataggagataccc420acgtatgtaccacccagcttaacgaatgctctactgtcatttctaaccataatctcttta480aagagctcttttgtctttcartatctcttccctgtttggaccacattacccttcatcata540tgaagccttgggtggctcctgtgtgagactcttgctgtgtgtcacaccctaatgaactag600aacctaaggttgctgtgtgtcgtacaactaggggtatggattacataacataatgatcaa660agtctggcttcctgggtgtggctccagctgcagaatcgggctagtgaagtttaatcagct720ccgttgtccccacacagaacgtatgaaggtcaactccctgtgctggccatcacagatccc780gacgtgatcagaacagtgctagtgaaagaatgttattctgtcttcacaaatcgaagggta840agcatccattttttgaaatttaaataatgattgatccactgattaaatttttattttgaa900aaaaacatatattcacagaaggttacctaaaaaatgtacaggaaggttccatgtactctt960catcctgtcccgcccagtggtaacatcttgcaatcttgtat1001当前第1页12