一种DNA测序反应试剂及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种dna测序反应试剂及其制备方法。

背景技术：

目前dna测序主要有两种方法：maxam和gilbert的化学法以及sanger的双脱氧核苷酸终止法，其中sanger法通过使用链终止剂-类似于正常dntp的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸，将延伸的dna链特异性地终止，其反应在测序过程中会经常应用到一种经过修饰的t7噬菌体dna聚合酶，即测序酶(sequenase)。

天然聚合酶的许多特性不适合dna测序，测序酶应该具备的特性包括：(1)较高的持续合成能力：持续合成能力是指酶从引物-模板退火复合物上脱离之前链持续延伸的程度；(2)耐热性：在高温条件下抵抗失活或分解的能力是酶在现代高技术投入循环测序反应中的最重要的因素；(3)核苷酸类似物嵌入染色末端：嵌入类似物的能力对双脱氧链终止法起决定性因素；带每个标记染料末端的终止的效率必须与避免低质量的不均匀峰数据的效率相似。

自动测序的发展催生了对更好的测序酶的追求，但目前应用于测序反应的酶效率不高，需要提高聚合酶的效率，缺失型taq酶去除了5′-3’外切酶活性，续进性只有2个碱基左右，dna聚合酶的续进性(processivity)，即每次聚合酶结合引物-模板复合体后催化合成的寡核苷酸的数量，这一性能可通过增强酶-核酸复合体的稳定来实现增强，另外，测序酶过早地脱离模板会导致通过测序反应无法得到可靠的序列信息。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种dna测序反应试剂及其制备方法。

本发明需要解决的技术问题为：

目前应用于测序反应的酶效率不高，需要提高聚合酶的效率，导致在测序过程中容易出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种dna测序反应试剂，该试剂由bigdyev3.1、5xbuffer与辅酶制备而成；

其中所述bigdyev3.1、辅酶与5xbuffer的体积比为1～1.2∶1～1.1∶7～8.2，将bigdyev3.1、辅酶与5xbuffer按照配比混合均匀后，得到dna测序反应试剂；

所述bigdyev3.1为thermo公司生产产品；

所述辅酶选用0.5-1utaq(f667y)dna聚合酶；

所述辅酶的浓度大于等于95％；

所述辅酶的酶活性大于等于5u/ul；

所述辅酶的制备包括如下步骤：

s1、基因合成相应的目标序列及装载到相应的目的载体，将得到质粒转化到相应的表达菌株；

s2、挑取单克隆进行表达筛选；

s3、通过iptg诱导对筛选得到的菌株进行放大表达；

s4、通过ni亲和层析柱法对表达后得到的菌株蛋白进行蛋白纯化；

s5、目的蛋白过分子筛进行再次纯化；

s6、蛋白检测浓度纯度；

s7、蛋白活性检测。

步骤s5中目的蛋白过分子筛进行再次纯化的方法为：

向经过ni亲和层析柱法初步纯化后得到的表达蛋白中加入β-丙内酯对病原微生物进行灭活，之后进行分子筛层析，使用超纯水洗脱收集目的蛋白；

使用孔径为30k的膜包进行超滤浓缩，使目标蛋白的浓度不小于5mg/ml，最后使用0.2微米的滤膜过滤除菌得到再次纯化的目标蛋白。

所述分子筛由50-60重量份葡萄糖凝胶、5-8重量份纳米沸石、8-12重量份凹凸棒土与3-4重量份聚乙烯醇制备而成，其中葡萄糖凝胶为g-25与g-50中的一种，该分子筛的制备方法为：

将凹凸棒土在300℃温度下焙烧1-2h进行脱水，再通过硅烷偶联剂对凹凸棒土进行表面处理，处理后通过超纯水洗涤并干燥，得到改性凹凸棒土；

通过纳米沸石均匀修饰改性凹凸棒土，得到芯料；

将芯料与聚乙烯醇均匀混合后，向其中加入聚乙烯醇混合后加超纯水并进行水浴加热，水浴温度为95-98℃，搅拌至聚乙烯醇完全溶解后降温至35-50℃得到修饰液待用；

将葡萄糖凝胶浸入0.02mol/l的磷酸缓冲液中进行溶胀，其中磷酸缓冲液的ph为6.2-6.8，溶胀结束后采用超纯水冲洗，并将冲洗后的葡萄糖凝胶加入修饰液中，以转速60-90r/min搅拌15-25min后得到装柱凝胶；

将装柱凝胶在真空干燥器中脱气20-30min后，进行装柱，得到分子筛。

本发明所述分子筛通过提升对菌体的吸附能力，将部分菌体进行阻留，提升后续通过滤膜过滤除菌的效果，减少得到的目的蛋白中菌体的数量。

利用该测序反应试剂进行dna测序的步骤为：

ss1、使用pet载体抽提质粒g1904229109；

ss2、从储藏室中取出96孔板，解冻4-7秒，然后将96孔板以1500rpm离心2秒，将质粒模板放在96孔板中；

ss3、将测序反应剂稀释16倍，在96孔板的孔中添加稀释后的测序反应剂1ul；

ss4、对质粒样品进行测序的pcr反应：96℃预变性3分钟后冰水淬火；

以96℃处理10秒、50℃处理5秒、60℃处理150秒为一个循环，进行32个循环后在4℃温度下保存；

ss5、对pcr产物进行纯化并上机测序。

本发明的有益效果：

本发明通过在测序反应中添加的试剂中加入辅酶并调整添加的试剂配比来实现的，在sanger测序反应中通过这种优化方案，可应用于对常见的特殊dna结构，例如发夹结构、高gc含量序列或重复序列等的测序中，可有效避免在测序过程中出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题，从而能提供正对于复杂结构dna的可靠、精准的测序结果。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

图1为采用实施例1中测序反应试剂对质粒g1904229109测得的结果；

图2为采用对比例1中传统测序剂对质粒g1904229109测得的结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种dna测序反应试剂，由bigdyev3.1、5xbuffer与辅酶制备而成；

其中所述bigdyev3.1、辅酶与5xburr的体积比为1∶1∶7，将bigdyev3.1、辅酶与5xbuffer按照配比混合均匀后，得到dna测序反应试剂；

所述bigdyev3.1为thermo公司生产产品；

所述辅酶选用0.5-1utaq(f667y)dna聚合酶；

所述辅酶的浓度为96.3％；

所述辅酶的酶活性为5.1u/ul；

所述辅酶的制备包括如下步骤：

s1、基因合成相应的目标序列及装载到相应的目的载体，将得到质粒转化到相应的表达菌株；

s2、挑取单克隆进行表达筛选；

s3、通过iptg诱导对筛选得到的菌株进行放大表达；

s4、通过ni亲和层析柱法对菌株表达后得到的蛋白进行蛋白纯化；

s5、目的蛋白过分子筛进行再次纯化；

s6、蛋白检测浓度纯度；

s7、蛋白活性检测。

步骤s5中目的蛋白过分子筛进行再次纯化的方法为：

向经过ni亲和层析柱法初步纯化后得到的表达蛋白中加入β-丙内酯对病原微生物进行灭活，之后进行分子筛层析，使用超纯水洗脱收集目的蛋白；

使用孔径为30k的膜包进行超滤浓缩，使目标蛋白的浓度不小于5mg/ml，最后使用0.2微米的滤膜过滤除菌得到再次纯化的目标蛋白。

所述分子筛由60重量份葡萄糖凝胶、5重量份纳米沸石、10重量份凹凸棒土与3.5重量份聚乙烯醇制备而成，其中葡萄糖凝胶为g-50，该分子筛的制备方法为：

将凹凸棒土在300℃温度下焙烧2h后进行脱水，再通过乙烯基三甲氧基硅烷对凹凸棒土进行表面处理，处理后通过超纯水洗涤并干燥，得到改性凹凸棒土；

通过纳米沸石均匀修饰改性凹凸棒土，得到芯料；

将芯料与聚乙烯醇均匀混合后，向其中加入聚乙烯醇混合后加超纯水并进行水浴加热，水浴温度为95℃，搅拌至聚乙烯醇完全溶解后降温至40℃；

将葡萄糖凝胶浸入0.02mol/l的磷酸缓冲液中进行溶胀，其中磷酸缓冲液的ph为6.5，溶胀结束后采用超纯水冲洗，并将冲洗后的葡萄糖凝胶加入修饰液中，以转速90r/min搅拌20min后得到装柱凝胶；

将装柱凝胶在真空干燥器中脱气30min后，进行装柱，得到分子筛。

对比例1

采用传统测序剂进行dna测序，所述传统测序剂由bigdyev3.1与5xbuffer按照体积比1∶4配制而成；

所述bigdyev3.1为thermo公司生产产品。

试验与结果测定：

ss1、使用pet载体抽提质粒f44426；

ss2、从储藏室中取出96孔板，让它们解冻5秒钟，然后将96孔板以1500rpm离心2秒，将质粒模板分别放在同一反应板中的a01孔、a02孔；

ss3、在所述a01孔添加1ul稀释16倍的实施例1中的测序反应试剂；

ss4、在所述的a02孔添加1ul稀释8倍的对比例1中的传统测序剂；

ss5、对质粒样品进行测序的pcr反应：96℃预变性3分钟后冰水淬火；

以96℃处理10秒、50℃处理5秒、60℃处理150秒为一个循环，进行32个循环后在4℃温度下保存；

ss6、对pcr产物进行纯化并上机测序。

测序结果参见图1与图2；

其中图1是采用实施例1中测序反应试剂对质粒f44426测得的结果；

图2是采用对比例1中传统测序剂对质粒f44426测得的结果。

测序对比结果说明：从图1和图2的对比可以看出，从测序结果看两种测序剂都能满足测序要求，但添加了辅酶的测序结果，信号反而比1∶4测序剂的信号高50％，读长更好，750bp后的峰高更好，成本反而降低一半。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。