一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种食源性致病菌检测试剂盒，尤其是涉及一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒。

背景技术：

食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病菌主要有痢疾杆菌，致病性大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌。传统的微生物检验方法是培养分离法，依靠培养基进行培养、分离及生化鉴定。试剂盒法：在检测装置的样品孔中加入一部分富集培养物，样品沿检测装置流动，出现易于区分的可见结果。如果只在对照区形成一个条带，则样品为阴性；在对照区和检测区同时出现条带，则可初步鉴定样品为阳性。测试片法：将选择性培养基中加入专一性的酶显色剂，并将其加载中纸片上，通过培养，如果样品中含有金黄色葡萄球菌，即可在纸片上呈现紫红色的菌落。微生物专有酶法：产生β-半乳糖苷酶可以分解液体培养基中的酶底物——4-甲基伞形酮-β-d-半乳糖苷，使4-甲基伞形酮游离，因而在366nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。试纸片法：试纸片为预先制备好的培养基系统，它含有标准培养基、冷水可溶性凝胶和指示剂，便于菌落计数。细菌总数测试片检样后37℃培养（48±3）h，阳性菌落在测试片上为红色或粉红色，与测试片底色有较大反差，容易判别计数。但这些方法只能半定性或者细菌总数。因此，亟需一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，实现快速定量检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，包括9种食源性致病菌的lamp检测引物组，其基因序列如下表1所示：

表1

。

所述的检测试剂盒的lamp反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板dna1μl，2.5μl10×反应缓冲液，1.5μl浓度为100mm的mgso4，3.5μl浓度为10mm的dntp，1μl浓度为8u/μlbstdna聚合酶，1μlfip/bip引物组溶液，1μlf3/b3引物组溶液和4μl甜菜碱，然后用双蒸水补足25μl；其中所述的fip/bip引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的fip/bip引物组溶液，各引物终浓度均为40μm，所述的f3/b3引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的f3/b3引物组溶液，各引物终浓度均为5μm。

所述的检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者sybr-greeni，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μm，氯化锰浓度为500μm；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μm，所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μl/孔，所述的sybr-greeni显色剂的添加量为5μl/孔。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒设计的引物特异强，可进行快速扩增，通过荧光染料根据双链dna的多少来确定病原模板的量，从而达到定量检测，时间在2-3h就完成了整个检测，具有特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的优点。

附图说明

图1为9种食源性致病菌lamp特异性检测结果，其中左侧为电泳图，右侧为可视化检测图，a：单增李斯特菌检测结果；b：副溶血弧菌检测结果；c：霍乱弧菌检测结果；d：金黄色葡萄球菌检测结果；e：蜡样芽孢杆菌检测结果；f：奇异变形杆菌检测结果；g：沙门氏菌属检测结果；h：志贺氏菌属检测结果；i：致病性大肠杆菌检测结果；0：dnamarker；1：单增李斯特菌；2：副溶血弧菌；3：霍乱弧菌；4：金黄色葡萄球菌；5：蜡样芽孢杆菌；6：奇异变形杆菌；7：沙门氏菌属；8：志贺氏菌属；9：致病性大肠杆菌；10：阴性对照；

图2为9种食源性致病菌lamp灵敏度检测结果图；其中左侧为电泳图，右侧为可视化检测图，a：单增李斯特菌检测结果；b：副溶血弧菌检测结果；c：霍乱弧菌检测结果；d：金黄色葡萄球菌检测结果；e：蜡样芽孢杆菌检测结果；f：奇异变形杆菌检测结果；g：沙门氏菌属检测结果；h：志贺氏菌属检测结果；i：致病性大肠杆菌检测结果；0：dnamarker；1：阴性对照；8-2：分别为10倍浓度梯度稀释的质粒模板；

图3为样品检测实例图，其中a为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果，b为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果；1：单增李斯特菌；2：副溶血弧菌；3：霍乱弧菌；4：金黄色葡萄球菌；5：蜡样芽孢杆菌；6：奇异变形杆菌；7：沙门氏菌属；8：志贺氏菌属；9：致病性大肠杆菌；10：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，包括9种食源性致病菌的lamp检测引物组，其基因序列如下表1所示：

表1

。

上述基因靶位点设计：选种间特异、种内保守的基因设计引物，是因为外部引物f3同样有机会与模板上的f3c结合并延伸，置换出完整的fip连接的互补单链。此时，fip上的f1c就能实现与此单链上fl的互补，通过自我碱基配对形成环状结构。同样的，下游引物bip和b3存在类似于引物fip和f3的合成，这就为形成哑铃状的单链结构提供了可能。此时，3’端的fl区段在具有链置换能力的dna聚合酶作用下，就会以自身为模板，进行dna合成，形成茎环状结构。

依据上述选择9种食源性致病菌的特异性基因片段为靶目标，应用primerexplorerv5软件设计引物，引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。将引物与靶目标比对，进行大量筛选试验和分析，得到特异、敏感、稳定的上述f3、b3、fip、bip的lamp检测引物组；将设计合成的4条引物进行反应时间和温度优化实验后，确定扩增效率和特异性最好的反应条件。

具体实施例二

一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，其lamp反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板dna1μl，2.5μl10×反应缓冲液，1.5μl浓度为100mm的mgso4，3.5μl浓度为10mm的dntp，1μl浓度为8u/μlbstdna聚合酶，1μlfip/bip引物组溶液，1μlf3/b3引物组溶液和4μl甜菜碱，然后用双蒸水补足25μl；其中fip/bip引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的9种食源性致病菌的fip/bip引物组溶液，各引物终浓度均为40μm，f3/b3引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的9种食源性致病菌的f3/b3引物组溶液，各引物终浓度均为5μm。

上述检测试剂盒还包括显色剂，显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者sybr-greeni，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μm，氯化锰浓度为500μm；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μm，钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μl/孔，sybr-greeni显色剂的添加量为5μl/孔。还设置有阴性对照为水，阳性对照为双链的dna。

具体实施例三

一种利用上述具体实施例二检测试剂盒进行食源性致病菌的高通量定量检测的方法，包括以下步骤：

取待检样品，按照市售细菌dna提取试剂盒提取样品模板dna，取样品模板dna1μl，按照lamp反应体系组成加入2.5μl10×反应缓冲液，1.5μlmgso4，3.5μldntp，1μlbstdna聚合酶，1μlfip/bip引物组溶液，1μlf3/b3引物组溶液和4μl甜菜碱，然后用双蒸水补足25μl后混匀，取混合液20μl加至样品检测芯片的每个加样孔（其中引物组溶液分别为单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的9种食源性致病菌的引物组溶液，每一种食源性致病菌的引物组溶液相应加到一个加样孔中，加上加阴性对照的加样孔，参与反应的加样孔一共为9个），再在每个孔中加入1μl显色剂，打开仪器电源开关，待屏幕自检完成，打开反应室盖，将芯片放入仪器反应室内，盖上反应室盖，屏幕上点击“开始”按钮，仪器自动进行，等待反应结束，仪器提示后进入检测菜单界面，选择检测，仪器会自动读取芯片反应室的颜色数据（使用羟基萘酚蓝作为显色剂时阳性为蓝色，阴性为紫罗兰色；使用钙黄绿素为显色剂时，绿色为阳性，黄色为阴性）并按照rgb值进行浓度换算，最后给出每个孔样品中所含细菌核酸的拷贝数。

若是使用sybr-greeni显色液时，取混合液20μl加至样品检测芯片的每个加样孔。打开仪器电源开关，待屏幕自检完成，打开反应室盖，将芯片放入仪器反应室内，盖上反应室盖，屏幕上点击“开始”按钮，仪器自动进行，等待反应结束，取出芯片，每个加样孔加5μl的sybr-greeni的工作液。进入仪器检测菜单界面，选择检测，仪器会自动读取芯片反应室的颜色数据（绿色为阳性，橙色为阴性）并按照rgb值进行浓度换算，最后给出每个样品中所含细菌核酸的拷贝数。

图1为左侧为9种食源性致病菌的lamp反应后的电泳图谱，右侧为采用上述方法使用sybr-greeni染料后的9种食源性致病菌的lamp反应结果，绿色的为阳性，橙色的为阴性。由图1可知，样品检测芯片中只有对应的食源性致病菌lamp检测引物为阳性，空白对照及其余非目的菌检测结果均为阴性。

具体实施例四

灵敏度试验：将分别含有9种食源性致病菌特异片段的质粒10倍梯度稀释，取各稀释度进行lamp扩增反应，9种病原微生物lamp方法的检测限为10-70copies/μl。如图2所示，图中8为原始浓度，8-2分别为10倍稀释的模板，进行lamp反应后，分别用电泳和使用sybr-greeni染料染色观察结果。初始浓度a：3.75×10⁷copies/μl、b：2.44×10⁷copies/μl、c：5.98×10⁷copies/μl、d：3.07×10⁷copies/μl、e：1.55×10⁷copies/μl、f：3.41×10⁷copies/μl、g：3.98×10⁷copies/μl、h：4.01×10⁷copies/μl、i：6.22×10⁷copies/μl。

具体实施例五

将疑似待测食物样品2例按照相关国标方法进行样品前处理，制备dna模板，样品经lamp反应（离心式微流控生物芯片）检测后，a样品使用羟基萘酚蓝进行显示，b通过sybr-greeni染料染色。如图3所示，结果显示样品a中含有单增李斯特菌和霍乱弧菌，b样品中，含有霍乱弧菌和奇异变形杆菌。经生理生化试验验证，以上两个样品中含有检出的致病菌。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>宁波大学

<120>一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒

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<213>人工序列

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<223>致病性大肠杆菌espp-fip

<400>35

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<211>43

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