一种DNA编码化合物库及化合物筛选方法与流程

本发明涉及一种dna编码化合物库及化合物筛选方法。

背景技术：

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的dna编码化合物库合成技术，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个dna标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在国外制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(accountsofchemicalresearch,2014,47,1247-1255)。

传统的dna编码化合物库的合成及编码技术能很好的应用于筛选，但是其也存在一些应用上的局限：其一，采用传统的dna编码化合物库进行筛选时，需要将靶标蛋白(蛋白质靶点)进行固定，然而某些靶标蛋白在进行固定化操作后，其空间结构发生变化，导致筛选出的化合物并不能与未固定的靶标蛋白结合，从而限制了dna编码化合物库的应用范围；其二，采用传统的dna编码化合物库只能对纯度较高的靶标蛋白进行筛选。然而由于技术、蛋白性质等因素影响，某些蛋白并不能被纯化到可以进行筛选的纯度，从而也限制了dna编码化合物库的应用范围。

为了解决上述技术问题，cn107130299a公开了一种可以共价交联的dna编码化合物库，它在常规单链dna编码化合物库的基础上，引入一段具有8～12个碱基的短链dna，其中短链dna一端具有光交联基团。该dna编码化合物库通过光交联基团与靶标蛋白的结合，dna编码化合物与靶标蛋白共价结合，因此靶标蛋白可以不需要纯化和固定，扩大了dna编码化合物库的应用范围。cn107130299a还公开了一种基于上述dna编码化合物库的筛选方法，其中在共价交联后，需加入dna外切酶对dna进行降解。

然而由于不同蛋白质靶点的性质不同，在加入dna外切酶时，可能会出现外切酶将共价交联后的dna编码化合物的dna标签降解，从而限制了其应用范围。而如果直接对上述共价交联后的dna编码化合物采取电泳等强分离、强洗脱条件，则可能因为蛋白质靶点部分和dna标签部分间仅以少量碱基间的氢键连接而不足以耐受，导致蛋白质靶点与dna标签部分分离，从而使dna标签失去作用。

因此，现在需要一种更稳定的可共价交联的dna编码化合物库，使靶标蛋白与dna编码化合物结合更稳定，在强分离、强洗脱条件下也不会发生分离。

技术实现要素：

为了解决上述问题，进一步扩大dna编码化合物库的应用范围，本发明提供了一种新的dna编码化合物库及化合物筛选方法。

本发明首先提供了一种dna编码化合物，它具有式ⅰ所示的通式：

其中，x为原子或分子骨架；

a1为包含有连接链和寡核苷酸的部分；

a2为包含有连接链和寡核苷酸的部分；

m1为包含一个或多个结构单元的功能部分；

m2为包含一个或多个可操作进行共价交联的部分。

进一步地，x为碳原子或多原子的分子骨架。

进一步地，多原子骨架为环状或非环状骨架结构。

进一步地，非环状骨架结构为其中x1、x2、x3、x4分别独立的选自碳、氧、氮、硫。

进一步地，所述式ⅰ通式具有式ⅱ所示的结构：

其中，z1为在其3'末端与l1连接的寡核苷酸，z2为在其5'末端与l2连接的寡核苷酸或者z1为在其5'末端与l1连接的寡核苷酸，z2为在其3'末端与l2连接的寡核苷酸；

l1为包含有能与z1的3'末端或5'末端形成键的官能团的连接链；

l2为包含有能与z2的5'末端或3'末端形成键的官能团的连接链；

y1为功能部分；

y2为可操作进行共价交联的部分；

s1、s2各自独立地为连接链。

进一步地，z1与z2互补形成双链。

进一步地，z1与z2长度相同或不同。

进一步地，z1、z2的长度分别为10个以上的碱基，且具有10个以上的碱基对互补区。

进一步地，z1、z2均包含pcr引物序列。

进一步地，l1、l2分别独立地选自双官能团的亚烷基链或双官能团的低聚二醇链。

进一步地，l1、l2中的官能团选自磷酸基、氨基、羟基、羧基。

进一步地，l1、l2分别独立地选自其中，n为1～10的整数。

进一步地，s1、s2分别独立地选自双官能团的亚烷基链或双官能团的低聚二醇链。

进一步地，s1、s2中的官能团选自羧基、氨基或醛基。

进一步地，s1、s2选自其中，m为1～10的整数。

进一步地，y2包含光敏性基团、电敏性基团或可与蛋白质共价交联的基团。

进一步地，y2包含叠氮基团、双吖丙啶基团、磺酰氟基团、重氮基团、肉桂酰基、丙烯酸酯基。

进一步地，y2选自

本发明还提供了一种dna编码化合物库，它是由前述的dna编码化合物组成。

进一步地，所述dna编码化合物库包含至少10⁶种不同的dna编码化合物。

进一步地，所述dna编码化合物库包含至少10⁸种不同的dna编码化合物。

进一步地，所述dna编码化合物库包含至少10¹⁰种不同的dna编码化合物。

本发明还提供了前述的dna编码化合物库的筛选方法，它包括以下步骤：

a、将化合物库与蛋白质靶点进行孵育，然后操作进行共价交联；

b、将蛋白-dna编码化合物共价交联复合物与未交联的dna编码化合物分离；

c、将回收的蛋白-dna编码化合物共价交联复合物进行pcr扩增和dna测序，读取dna序列信息，获得化合物结构信息。

进一步地，所述步骤a中共价交联通过光照、通电或者直接孵育进行。

进一步地，所述步骤b中采用电泳法进行分离。

进一步地，所述步骤b中采用sds-page进行分离。

进一步地，所述步骤b中的分离方法为：将蛋白固定化，用洗脱剂将未固定物质洗掉即可。

进一步地，所述将蛋白固定化是使用磁珠将蛋白固定。

本发明还提供了前述的dna编码化合物库对细胞裂解液筛选的方法，它包括以下步骤：

ⅰ、用物理方法将细胞打碎；

ⅱ、进行离心，分离出可溶性物质；

ⅲ、使用上述dna编码化合物库对分离出的可溶性物质进行筛选。

本发明还提供了前述的dna编码化合物库对跨膜蛋白进行筛选的方法，它包括以下步骤：

1)、用物理方法将细胞打碎；

2)、进行第一轮离心，分离出可溶性物质和细胞膜，沉淀除去不可溶物质；

3)、进行第二轮离心，沉淀分离出细胞膜；

4)、使用上述dna编码化合物库对分离出的跨膜蛋白进行筛选。

使用本发明的dna编码化合物库进行筛选，不需要对靶点蛋白质进行纯化或固定，因此可适用于非固载蛋白、细胞跨膜蛋白、细胞裂解液等复杂体系的筛选。

本发明的dna编码化合物在与蛋白共价交联后，蛋白与dna标签部分全部通过共价连接，可耐受各种分离条件，如电泳分离、强洗脱条件等，蛋白与dna标签部分不会因为分离条件苛刻而发生分离。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为化合物4、5和6与靶点蛋白进行共价交联后电泳分离结果。

图2为化合物6、7和8与靶点蛋白进行共价交联后电泳分离结果。

具体实施方式

缩写：fmoc表示芴甲氧羰基；dmf表示n,n-二甲基甲酰胺；dmso表示二甲基亚砜；dmt-mm表示2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪；teaa表示乙酸三乙胺，diea表示n,n-二异丙基乙胺；boc表示叔丁氧羰基；dma表示n,n-二甲基乙酰胺；hatu表示2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯。

下述的dna的序列：

简写为

下述的dna的序列：

简写为

其中，a为腺嘌呤，t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，g为鸟嘌呤；

dna上进行的化学反应或dna酶连接反应的后处理操作：在dna上进行的化学反应或dna酶连接反应的反应液中加入10％反应液体积的5mnacl水溶液及2-3倍体积的乙醇。涡旋震荡后，将溶液置于-20℃冰箱冷冻1小时。冷冻后的溶液经高速离心沉淀后，去除上层清液，得到dna样品。

实施例1、dna编码化合物库的起始dna原料的合成

合成方法一：

步骤1、化合物1的合成

将化合物hub1(82nmol)溶于硼酸钠缓冲液(82μl,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将4-叠氮-苯甲酸的dma溶液(8.2μmol,浓度200mm/l)、hatu的dma溶液(8.2μmol,浓度400mm/l)和dipea的dma溶液(8.2μmol,浓度400mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物hub1起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应12小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作进行后处理，得化合物1(77nmol)。

步骤2、化合物4的合成

将化合物1(77nmol)溶于硼酸钠缓冲液(308μl,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度0.25mm/l的溶液，涡旋振荡充分混匀后，在90℃下反应16小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作进行后处理，得到化合物4(73nmol)。

合成方法二：

步骤1、化合物3的合成

将化合物hub(10μmol)溶于硼酸钠缓冲液(10ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将化合物2(aop-fmoc)的dma溶液(1000μmol,浓度200mm/l)、hatu的dma溶液(1000μmol，浓度400mm/l)和dipea的dma溶液(1000μmol，浓度400mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物hub起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应12小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入2ml氯化钠水溶液(5m/l)和60ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟。沉淀加入10mldd-h2o溶解，再加入1ml哌啶后，室温反应1-3小时，lcms监测反应。反应完全后，加入1ml氯化钠水溶液(5m/l)和60ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟，分出上清液得到白色沉淀，即为化合物3(9μmol，纯度>95％)。

步骤2、化合物4的合成

将化合物3(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将对叠氮苯甲酸的dma溶液(2μmol,浓度20mm/l)，hatu的dma溶液(2μmol,浓度20mm/l)和dipea的dma溶液(2μmol，浓度20mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物3起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应2-4小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入0.2ml氯化钠水溶液(5m/l)和10ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀加入1mldd-h2o溶解，hplc制备得到化合物4(300nmol，纯度>95％)。

实施例2、dna编码化合物库及筛选

用实施例1制备的起始dna原料构建了如下结构的dna编码化合物库：

对上述dna编码化合物库按以下步骤进行筛选：

1)将上述dna编码化合物库与靶标蛋白rock2在100μl的缓冲液体系中与蛋白孵育60分钟，然后在365nm光照条件下反应60秒；

2)将反应液加热至90℃使蛋白变性，通过制备型sds-page(12-15％)进行分离，采用切胶的方法回收和提取相应的目标蛋白质-dna编码化合物共价交联复合物的条带；

3)将回收的样本进行pcr扩增和dna测序，读取被富集的小分子化合物对应的dna序列，然后获得化合物的结构信息。

实施例3、dna编码化合物合成

通过实施例2中dna编码化合物库的筛选，对化合物结构进行解析后，重新合成无dna标签的化合物，其对rock2的抑制活性ic50约为50nm。以其作为工具化合物合成dna编码化合物，对共价交联进行进一步验证。

步骤1：化合物5的合成

将化合物3(5μmol)溶于硼酸钠缓冲液(5ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将sm01的dma溶液(10μmol,浓度20mm/l)，hatu的dma溶液(10μmol,浓度20mm/l)和dipea的dma溶液(10μmol,浓度20mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物3起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应2-4小时。取1μl反应液加100uldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入1ml氯化钠水溶液(5m/l)和50ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀加入5mldd-h2o溶解，hplc制备得到化合物5(2μmol，纯度>98％)。

步骤2：化合物6的合成

将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将对叠氮苯甲酸的dma溶液(100μmol,浓度200mm/l)，hatu的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)和dipea的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应2-4小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入0.2ml氯化钠水溶液(5m/l)和10ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物6(270nmol，纯度>95％)。

步骤3：化合物7的合成

将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将3-甲基-3h-双吖丙啶-3-丙酸的dma溶液(100μmol,浓度200mm/l)，hatu的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)和dipea的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应2-4小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入0.2ml氯化钠水溶液(5m/l)和10ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物7(310nmol，纯度>96％)。

步骤4：化合物8的合成

将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1ml,ph＝9.4,浓度250mm/l)中，配成浓度1mm/l的起始溶液；然后将4-(氟磺酰)苯甲酸的dma溶液(100μmol,浓度200mm/l)，hatu的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)和dipea的dma溶液(100μmol,浓度400mm/l)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温反应2-4小时。取1μl反应液加100μldd-h2o稀释，lcms监测反应。反应完全后，加入0.2ml氯化钠水溶液(5m/l)和10ml乙醇振荡5分钟，置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物8(250nmol，纯度>82％)。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1、化合物4、5和6与靶点蛋白进行共价交联

1、试验方法

(1)将化合物4、5和6在25μl的缓冲液体系(40mmpbs,50mmnacl,ph7.5)中分别与靶标蛋白孵育60分钟。

(2)在365nm的紫外条件下，光源直射反应液30分钟。

(3)在反应液中加入9μl4x上样缓冲液，吹打混匀，置于100℃金属浴加热10分钟，使蛋白彻底变性。

(4)通过sds-page电泳(120v，120min)分离蛋白质-dna编码化合物共价交联复合物和未交联的dna编码化合物。

2、试验结果

试验结果如图1所示。

上述试验结果表明，本发明的dna编码化合物能够特异性与靶标蛋白发生共价交联，靶标蛋白与dna编码化合物形成的复合物在电泳条件下不会发生分离，但是复合物与单独靶标蛋白在电泳下可以分离。

试验例2、化合物6、7和8与靶点蛋白进行共价交联

1、试验方法

(1)将化合物6在25μl的缓冲液体系(40mmpbs,50mmnacl,ph7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。

(2)一组在365nm的紫外条件下，光源直射反应液1分钟和30分钟。另一组放置于冰上黑暗处保存1分钟和30分钟。

(3)在反应液中加入9μl4x上样缓冲液，吹打混匀，置于100℃金属浴加热10分钟，使蛋白彻底变性。

(4)将化合物7在25μl的缓冲液体系(40mmpbs,50mmnacl,ph7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。

(5)一组在365nm的紫外条件下，光源直射反应液30分钟和120分钟。另一组放置于冰上黑暗处保存30分钟和120分钟。

(6)在反应液中加入9μl4x上样缓冲液，吹打混匀，置于100℃金属浴加热10分钟，使蛋白彻底变性。

(7)将化合物8在25μl的缓冲液体系(40mmpbs,50mmnacl,ph7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。

(8)在4℃条件下保存120分钟。

(9)在反应液中加入9μl4x上样缓冲液，吹打混匀，置于100℃金属浴加热10分钟，使蛋白彻底变性。

(10)通过sds-page电泳(120v，120min)分离蛋白质-dna编码化合物共价交联复合物和未交联的dna编码化合物。

2、试验结果

试验结果如图2所示。

上述试验结果表明，本发明的dna编码化合物可采用多种可共价交联的基团(如叠氮基团、双吖丙啶基团和磺酰氟基团等)，在适当的条件下，均可以与靶点蛋白质发生共价交联，靶标蛋白与dna编码化合物形成的复合物在电泳条件下不会发生分离，但是复合物与单独靶标蛋白在电泳下可以分离。

综上，使用本发明的dna编码化合物库进行筛选，不需要对靶点蛋白质进行纯化或固定，因此可适用于非固载蛋白、细胞跨膜蛋白、细胞裂解液等复杂体系的筛选。此外，本发明的dna编码化合物在与蛋白共价交联后，蛋白与dna标签部分全部通过共价连接，可耐受各种分离条件，如电泳分离、强洗脱条件等，蛋白与dna标签部分不会因为分离条件苛刻而发生分离。