一种从阿胶中快速提取DNA的优化方法与流程

本发明涉及应用分子生物学技术建立并优化从阿胶中快速提取dna的方法。

背景技术：

阿胶是采用马科动物驴equusasinusl.的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩、并加入冰糖、豆油等辅料熬制成的固体胶类药物，也被称为驴皮胶。阿胶属于传统名贵中药，滋阴补血，被誉为“滋补国宝”。现代药理研究结果显示，阿胶具有止血、补血、提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、耐缺氧等功能。随着生活水平的提高，人们更加注重养生和保健。阿胶作为一种滋补良品，其药用价值和保健作用逐渐为国内外市场所认识，阿胶产业蓬勃发展，市场需求量逐年上升。

在巨大的经济利益诱惑下，阿胶行业内制假、掺假、售假现象严重。一些企业采取成本低廉的马皮、牛皮、骡皮，甚至是皮革厂的劣质下脚料代替驴皮熬胶。真假阿胶外观上没有明显差别，但功效显著不同。这些以假充真的产品，不仅不具备阿胶的功效，甚至损害消费者的健康，严重扰乱阿胶市场的正常秩序，因此阿胶真伪鉴别势在必行。

传统的鉴别方法主要通过观察阿胶外观性状和理化性质分析来鉴别阿胶真伪，主观因素较大，且无法对已经深加工的阿胶制品进行鉴别；亦有学者采用高效液相色谱法、质谱法鉴别阿胶真伪和阿胶中蛋白质、氨基酸等成分分析，实验步骤繁多，且操作复杂；目前，主要采用分子生物学技术对阿胶进行真伪鉴别，灵敏性高、特异性好，可对阿胶中驴源性成分进行定性、定量检测。

高质量dna的快速提取是分子生物学实验的关键步骤。阿胶是采用驴皮经过长时间高温反复熬煮等一系列步骤制成，其dna严重降解、断裂(小于100bp)，且驴皮中含有大量胶原蛋白，进一步加大阿胶dna提取难度。为了从阿胶中提取长度较短、数量较多的可扩增dna片段，提高阿胶dna提取效率，本发明提供了一种从阿胶中快速提取dna的优化方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从阿胶中快速提取dna的优化方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种从阿胶中快速提取dna的优化方法，包括以下步骤：

1.样本前处理

取固体阿胶样本经过两侧紫外光照射20-30min，消除表面可能存在的污染。使用垂直式多功能粉碎机将其研磨成粉，分装保存。

2.阿胶dna提取

(1)取粉碎后阿胶样品0.200g左右，置1.5ml离心管中，加入p1(裂解液、0.5mol/ledta、20mg/mlpk酶和10mg/mlrna酶)消化液275μl，加入p2(1mol/ltris-hcl、0.5mol/ledta、nacl、10％sds和20mg/mlpk酶)裂解液250μl，使用枪头仔细混匀，在56℃水浴1h；

(2)充分混匀后，短离心，于70℃水浴10min；

(3)加到dna纯化柱中，10000rpm/min离心3min；

(4)弃去过滤液，加入p3(5mol/l乙酸钾、1mol/ltris-hcl、0.5mol/ledta、无水乙醇和ddh2o)洗脱液700μl，10000rpm/min离心1min，重复洗脱一次；

(5)弃去过滤液，10000rpm/min离心2min；

(6)将dna纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入te50μl，室温放置15min后，10000rpm/min离心2min，将离心得到的溶液重新过柱，即得dna溶液，于-20℃保存。

结果判定

本发明的突出特征在于：本发明应用dna吸附柱代替对实验人员毒性较大的酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂，从阿胶中提取严重降解的痕量驴源性基因组dna。经过数次条件优化，确定了提取阿胶中驴源性基因组dna的最适试剂及用量、消化温度及时间、洗脱次数，可有效去除蛋白质成分，最大程度、最高效率提取严重降解的阿胶基因组dna。

本方法所需试剂安全无毒，操作步骤简单方便。应用本方法可在90min内从深加工的阿胶及阿胶制品中提取出严重降解的dna片段，提取的dna纯度和浓度能满足阿胶分子生物学鉴定的要求，用dnaman软件设计的驴源性特异性引物经过聚合酶链式反应(pcr)，2％琼脂糖凝胶电泳后在78bp处出现特异性条带，紫外光下将特异性条带切下进行凝胶回收，转入大肠杆菌增菌，质粒小提后送往生工(上海)生物工程股份有限公司测序，于ncbi中blast比对后，与genbank中已登记的驴物种相似性为100％，说明本方法提取的阿胶基因组dna为驴源性dna，为阿胶真伪鉴别奠定基础。

附图说明

图1为阿胶样品dna浓度及纯度测定结果，其中：本方法提取的阿胶样品dna纯度均在1.70-1.90之间，浓度均在100ng/μl左右。

图2为阿胶基因组dna电泳结果示意图，将所提取的阿胶标准品和6批阿胶样品基因组dna在2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，其中：m为λhindⅲmarker；1-7号泳道均在100bp左右出现条带。

图3为阿胶样品pcr电泳结果示意图，其中：m为50bpdnamarker；阿胶标准品和6批市售阿胶样品均在78bp处出现特异性条带；8号为空白对照，不出现扩增产物。

图4为克隆测序后在ncbi中blast比对分析结果，与genbank中已登记的驴物种相似性为100％。

具体实施方式

结合实施例对本发明进行进一步说明。

实施例一

1.样本前处理

取阿胶标准品(中国食品药品检定研究院，批号：121274-201703)和吉林双药药业有限公司提供的6批阿胶样本(批号：20170601、20170901、20171101、20181001、20181002和20181003)经过两侧紫外光照射20-30min，消除表面可能存在的污染。使用垂直式多功能粉碎机将其研磨成粉，分装保存。

2.阿胶dna提取

(1)取粉碎后阿胶样品0.200g左右，置1.5ml离心管中，加入p1(裂解液、0.5mol/ledta、20mg/mlpk酶和10mg/mlrna酶)消化液275μl，加入p2(1mol/ltris-hcl、0.5mol/ledta、nacl、10％sds和20mg/mlpk酶)裂解液250μl，使用枪头仔细混匀，在56℃水浴1h；

(2)充分混匀后，短离心，于70℃水浴10min；

(3)加到dna纯化柱中，10000rpm/min离心3min；

(4)弃去过滤液，加入p3(5mol/l乙酸钾、1mol/ltris-hcl、0.5mol/ledta、无水乙醇和ddh2o)洗脱液700μl，10000rpm/min离心1min，重复洗脱一次；

(5)弃去过滤液，10000rpm/min离心2min；

(6)将dna纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入te50μl，室温放置15min后，10000rpm/min离心2min，将离心得到的溶液重新过柱，即得dna溶液，于-20℃保存。

阿胶基因组dna纯度、浓度参见图1，本方法提取的阿胶样品dna纯度均在1.70-1.90，每个样本3次测量数值差异小于0.01，浓度均在100ng/μl左右，说明本方法提取的dna纯度高，无蛋白质污染。

阿胶基因组dna电泳结果参见图2，将所提取的标准品及6批阿胶样品基因组dna在2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，其中：m为λhindⅲmarker；1-7号泳道均在100bp左右出现条带，说明阿胶及阿胶制品经过深加工后，基因组dna严重降解、断裂，多呈小于100bp的片段。

pcr电泳结果参见图3，其中：标准品及6批阿胶样品均在78bp处出现特异性条带；8号为空白对照，不出现扩增产物。

克隆后目的条带测序结果见图4，与genbank中已登记的驴物种相似性均为100％。

实施例二

吉林市市售6批阿胶样品提取步骤与结果与实施例一相同。